CN103276057B - 一种基于lamp技术快速检测灰葡萄孢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测灰葡萄孢的方法，可用于灰霉病的快速诊断及病原的发展动态监测，对灰霉病流行的早期预警及合理用药指导具有重要的现实意义。本发明是以环介导恒温扩增技术(LAMP)为基础建立起来的一种快速简便的灰葡萄孢分子检测技术。该检测方法共分3个主要步骤，(1)分别提取待测样品的基因组DNA；(2)进行LAMP反应；(3)根据反应产物颜色判定是否为灰葡萄孢；如果颜色为天蓝色(有扩增产物)为灰葡萄孢；如果颜色为紫色(无扩增产物)则不是灰葡萄孢。本发明为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的灰葡萄孢检测技术，对增加生态、社会和经济效益都具有现实而深远的意义。
Description
技术领域
本发明是基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的快速分子检测方法，可用于多种寄主植物灰霉病的诊断及病原群体发展动态的监测，进行灰霉病的流行预测及早期预警。
背景技术
环介导恒温扩增反应(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，该方法利用一套(4种)特异性引物，以识别靶基因的六个特定区域。该技术原理是：在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。LAMP方法的优势是在恒温条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原的快速诊断及检测。
灰霉病是一类由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的植物真菌病害，可危害200多种蔬菜、果树以及观赏性植物等重要的经济作物，该病的发生可引起植物幼苗、果实及贮藏器官的猝倒、落叶、花腐、烂果及烂窑，造成严重的经济损失。近年来，随着保护地蔬菜生产的发展，加重了灰霉病的发生和流行。目前由于作物种质资源缺少高抗灰霉病的品种，采用化学药剂是控制灰霉病最有效方便的途径之一。灰霉病具有发生快、极易传播等特点，因此以LAMP为基础的分子生物学技术能快速检测灰葡萄孢，该方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，从而大大提高了检测效率，为灰霉病的流行预测、早期预警及综合防控提供理论指导。然而，经检索目前国内外尚未对灰葡萄孢菌的LAMP快速分子检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的是对已有的灰葡萄孢的鉴定及检测方法中存在费时、费力、成本高、准确性低的缺点，提供一种具有简便、快速、省时省力、灵敏度高的检测灰葡萄孢的方法，根据灰葡萄孢基因型，优化反应条件，能在灰霉病发病前期进行大量、快速和简便的病原物群体的诊断和检测，对及时采取有效防治措施、控制病害流行、减少经济损失具有实用价值。
本发明所述的快速检测灰葡萄孢的分子生物学方法，步骤是：
(1)在灰葡萄孢Bcos5(BC1G_07633)基因上设计1对外引物和1对内引物，利用该引物在恒温条件下，进行LAMP扩增；
①LAMP反应所用的两对引物分别是：
F3：CTACACAACGACCACAGT
B3：CCACCAGGTAGTTTCAATCC
FIP：GCCCTCCAGATAATCCATCTATGG-CCCGCGACAATATCATCA
BIP：CATGCGACCTCCACCACAAA-TTCTTGCGCTTAGTCCAC
②LAMP反应体系及其条件：
反应体系(25μL)：
反应条件：
63℃ 45min，80℃ 10min：
(1)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；
(3)鉴定是否为灰葡萄菌菌株：如果LAMP扩增产物显示天蓝色(有产物扩增)，这时电泳图谱应为梯状条带，判定为灰葡萄菌菌株；如果扩增产物为紫色(无产物扩增)，这时电泳图谱无条带扩增，判定为非灰葡萄菌菌株(图1)。
本发明提供的快速检测灰葡萄孢的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：
1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程；
2、检测高效性：该检测方法所用检测时间不足1小时，而PCR扩增时间较长，一般需要几小时，这样能大大提高了检测的效率；
3、灵敏度高：以灰葡萄孢基因组DNA为模板，该方法的检测下限为1pg μL-1，是常规PCR的10倍；
4、准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源DNA和杂质的影响，不需要从样本中纯化DNA，可直接利用发病组织或病残体提取DNA快速检测，大大提高了检测的准确度；
5、特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；
6、本发明是国内外首次利用LAMP技术对灰葡萄孢进行检测，这种方法快速简便，对病害的准确诊断、及时了解病原发展动态、指导科学用药，以及降低成本和减少环境污染具有重要的现实意义；
7、对所采集的50株灰葡萄孢的LAMP检测结果与传统形态学及分子生物学鉴定结果完全吻合。
附图说明
图1：灰葡萄孢及其他常见农作物病原菌LAMP反应颜色变化及电泳谱带图
其中：M-100bp Marker；1-灰葡萄孢；2-10-依次为牡丹葡萄孢、核盘菌、小麦赤霉菌、小麦纹枯菌、水稻纹枯菌、棉花黄萎菌、番茄早疫菌、辣椒炭疽菌、稻瘟菌。
图2：灰葡萄孢LAMP灵敏度检测反应颜色变化及电泳谱带图
图3：灰葡萄孢普通PCR灵敏度检测电泳谱带图
具体实施方式
实施例1 LAMP反应体系优化
为了节省检测成本，保证该检测方法的稳定性和可靠性，实验对反应体系中Bst DNA聚合酶(8U/μL)(1U-12U)、Mg2+(25mM)浓度(1-8μL)、引物FIP/BIP(40μM)及F3/B3(20μM)浓度(0.25-2μL)，甜菜碱(8M)浓度(0.125-4μL)、HNB(2.5mM)浓度(0.25-2μL)进行了优化，确定了最佳反应体系为：Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL，10×ThermoPol 2.5μL，MgCl2(25mM)3.0μL，dNTP(10mM)2.5μL，FIP(40μM)0.75μL，BIP(40μM)0.75μL，F3(10μM)0.5μL，B3(10μM)0.5μL，甜菜碱(8M)2.0uL，HNB(2.5mM)1.5μL，基因组DNA 1.0μL，dH2O(灭菌蒸馏水)9.0μL。
实施例2 LAMP反应条件优化
为了得到最适的反应温度和时间，保证该检测方法的高效性，实验对反应参数中的反应温度(60-65℃)及时间(15-90min)进行了优化，最终确定最适的反应温度和时间分别为63℃和45min。
实施例3 LAMP反应灵敏度检测
为了确定LAMP反应的检测下限，本实验中用试剂盒提取纯化的基因组DNA作为模板，以10倍梯度稀释。以上述稀释的基因组DNA作为模板，分别进行LAMP及PCR扩增。从图2和图3中可以得知，LAMP技术的最低检测下限为1pg，而普通PCR检测下限仅为10pg。
实施例4 LAMP引物特异性检测
以灰葡萄孢及其他常见农作物病原菌基因组DNA为模板分别进行LAMP扩增，反应具有很好的特异性。当模板为灰葡萄孢时，反应产物颜色为天蓝色，电泳图谱成梯状条带；当模板为其他常见农作物病原菌时，反应产物颜色为紫色，电泳无条带(图1)。
实施例5 LAMP重复性检测
对2012年采集不同地理位置的50个灰葡萄孢菌株基因组DNA为模板进行LAMP检测，50个实验样品的反应颜色均为天蓝色，电泳图谱均呈梯状条带。该方法检测结果可靠，重复性好。
本发明所建立的检测方法能准确、快速的检测出灰葡萄孢菌株，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为灰霉病的早期预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态、社会和经济效益都具有现实而深远的意义。
Claims (1)
1.一种基于LAMP技术快速检测灰葡萄孢的方法，步骤是：
(1)运用两对特异性引物对待鉴定真菌的基因组DNA进行LAMP恒温扩增，其中所述的两对特异性引物的碱基序列分别是：
外引物对：
F3：CTACACAACGACCACAGT
B3：CCACCAGGTAGTTTCAATCC
内引物对：
FIP：GCCCTCCAGATAATCCATCTATGG-CCCGCGACAATATCATCA
BIP：CATGCGACCTCCACCACAAA-TTCTTGCGCTTAGTCCAC
LAMP反应总体积为25μL，反应体系是：
LAMP反应恒温扩增条件是：63℃45min，80℃10min；
(2)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；
(3)鉴定是否为灰葡萄孢菌株：LAMP扩增产物显示天蓝色，电泳图谱为梯状条带，鉴定为灰葡萄孢菌株；扩增产物为紫色，电泳图谱无条带扩增，鉴定为非灰葡萄孢菌株。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3670668A1 (en) * | 2018-12-20 | 2020-06-24 | Fundacion Gaiker | Method for the detection of botrytis cinerea based on loop-mediated isothermal amplification, detection reagent and set of primers |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103436628B (zh) * | 2013-09-23 | 2014-10-29 | 南京农业大学 | 一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的方法 |
| CN104293957B (zh) * | 2014-10-14 | 2017-06-16 | 华中农业大学 | 一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法 |
| CN106381340B (zh) * | 2016-11-30 | 2019-08-27 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 番茄灰霉病菌lamp检测引物、检测试剂盒及其应用 |
| CN109929942B (zh) * | 2017-12-19 | 2022-03-22 | 北京市林业果树科学研究院 | 与葡萄果皮颜色相关的snp分子标记及应用 |
| CN109234436A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-01-18 | 扬州大学 | 一种基于lamp方法的灰霉病菌快速痕量检测试剂、方法及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1319715A1 (de) * | 2001-12-11 | 2003-06-18 | Bayer CropScience AG | IMP Dehydrogenase und deren Verwendung zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen |
| CN1752215A (zh) * | 2005-08-26 | 2006-03-29 | 中国人民解放军第二军医大学 | 灰霉病的分子诊断方法 |
| CN101074926A (zh) * | 2007-06-12 | 2007-11-21 | 浙江大学 | 可见和近红外光谱的植物叶片或冠层灰霉病诊断方法与系统 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9803250B2 (en) * | 2008-11-26 | 2017-10-31 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Broad range PCR-based compositions and methods for the detection and identification of fungal pathogens |
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- 2013-04-03 CN CN201310112983.3A patent/CN103276057B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1319715A1 (de) * | 2001-12-11 | 2003-06-18 | Bayer CropScience AG | IMP Dehydrogenase und deren Verwendung zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen |
| CN1752215A (zh) * | 2005-08-26 | 2006-03-29 | 中国人民解放军第二军医大学 | 灰霉病的分子诊断方法 |
| CN101074926A (zh) * | 2007-06-12 | 2007-11-21 | 浙江大学 | 可见和近红外光谱的植物叶片或冠层灰霉病诊断方法与系统 |
Non-Patent Citations (12)
| Title |
|---|
| ) assays for the detection and quantification of Botrytis cinerea in planta.《Plant Physiology and Biochemistry》.2005,第43卷第890-899页. * |
| c and sensitive detection of Botrytis cinerea Pers.: Fr. in strawberry (FragariaUananassa Duch.) usingPCR.《FEMS Microbiology Letters》.2002,第209卷第169-174页. * |
| cent * |
| Detection of Botrytis cinerea by loop-mediated isothermal amplification;J.A. Tomlinson et.al.,;《Letters in Applied Microbiology》;20101231;第51卷;第652页左栏第3段、图1，右栏第2段 * |
| J.A. Tomlinson et.al.,.Detection of Botrytis cinerea by loop-mediated isothermal amplification.《Letters in Applied Microbiology》.2010,第51卷第652页左栏第3段、图1，右栏第2段. |
| M. Belen Suarez et.al.,.Development of real-time PCR (TaqMan& * |
| M. Belen Suarez et.al.,.Development of real-time PCR (TaqMan® |
| reg * |
| Stefania Rigotti et.al.,.Characterization of molecular markers for speci& * |
| Stefania Rigotti et.al.,.Characterization of molecular markers for speci¢ |
| 王娜等.番茄灰霉病分子诊断方法研究.《上海交通大学学报( 农业科学版)》.2007,第25卷(第1期),第50-54页. |
| 番茄灰霉病分子诊断方法研究;王娜等;《上海交通大学学报( 农业科学版)》;20070228;第25卷(第1期);第50-54页 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3670668A1 (en) * | 2018-12-20 | 2020-06-24 | Fundacion Gaiker | Method for the detection of botrytis cinerea based on loop-mediated isothermal amplification, detection reagent and set of primers |
| WO2020128028A1 (en) * | 2018-12-20 | 2020-06-25 | Fundacion Gaiker | Method for the detection of botrytis cinerea based on loop-mediated isothermal amplification, detection reagent and set of primers |
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| Publication number | Publication date |
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