CN104059909A

CN104059909A - 马铃薯金线虫scar标记和lamp快速检测方法及应用

Info

Publication number: CN104059909A
Application number: CN201410331743.7A
Authority: CN
Inventors: 彭德良; 欧师琪; 彭焕
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2014-07-11
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2034-07-11
Also published as: CN104059909B

Abstract

本发明涉及马铃薯金线虫SCAR标记和LAMP快速检测方法及应用。根据扩增得到马铃薯金线虫的SCAR特异性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。以此为基础设计了一对特异性引物GrFI和GrRI，获得稳定的SCAR标记，可特异快速检测出马铃薯金线虫。同时根据SCAR片段序列设计了4条LAMP引物GrF3、GrB3、GrFIP和GrBIP；并建立LAMP反应体系，通过提取DNA，等温扩增、扩增产物显色检测，从而快速检测出马铃薯金线虫。本发明的检测方法利用SCAR-PCR和LAMP恒温两种方式均能特异性强、灵敏度高、成本低廉、操作简便，在马铃薯金线虫快速检疫检测方面具有很高的应用价值。

Description

马铃薯金线虫SCAR标记和LAMP快速检测方法及应用

技术领域

本发明涉及马铃薯金线虫SCAR标记和LAMP快速检测方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

马铃薯孢囊线虫包括马铃薯金线虫Globodera rostochiensis和马铃薯白线虫G.pallida，是世界上马铃薯毁灭性的病原线虫。目前马铃薯孢囊线虫我国尚未发生，因此列为我国一类进口植物检疫对象。马铃薯金线虫与白线虫的形态学特征非常相似，难与区分，传统的马铃薯孢囊线虫鉴定方法必须借助于一定数量特征性的孢囊或雌虫，并结合2龄幼虫特征进行鉴别，因此马铃薯孢囊线虫检测的专业性特别强，同时还需要有足够数量的标本。为了保护我国农业生产的安全，防止马铃薯孢囊线虫传入我国，开展马铃薯孢囊线虫的特异快速的分子检测技术研究具有重要的现实意义。

马铃薯孢囊线虫的分子鉴定的研究始于上世纪80年代末。分子技术包括RFLP、PCR、RAPD、SCAR-PCR等方法，主要针对马铃薯孢囊线虫的mtDNA或mtDNA-PCR、rDNA-ITS和基于基因组进行鉴定、遗传、检测、致病性和作物抗性等方面的研究。

孢囊线虫种类的鉴别是最早的。Burrow和Boffey(1986)最早应用RFLP直接酶切mtDNA，根据内切酶产物的大小区分马铃薯金线虫(G.rostochiensis)及马铃薯白线虫(G.pallida)。Burrows及Perry(1988)分别构建了马铃薯白线虫(G.pallida)的基因组文库，并筛选出了特异性探针。Flemin等(1993)、Thiery&Mugniery(1996)通用引物rDNA1和rDNA2扩增PCN的DNA，得到一个包括ITS1、ITS区域及5.8S基因序列长1200bp的片段，用限制性内切酶AluI酶切PCR产物能快速区分PCN种。Fleming C.C.等用引物rDNA2和rDNA1.58s然后用Alu I和Hinf I酶切，分析RFLP图谱，可将G.tabacum、G.rostochiensis、G.pallida、H.glycines、H.goettingiana、H.schachtii、H.mani、H.carotae和H.punctata9种孢囊线虫彼此分开。

Folkertsma et al.，1994用RAPD分析了马铃薯白线虫和马铃薯金线虫种间和群体间的遗传变异，并从相关致病型组中分离出马铃薯金线虫群体。Burrow P.R.et al.(1996)分析来自英国的20个G.pallida群体RAPD图谱，证实地理分布与基因组相似性无关。Blok V.C.等和ThieryM.et al.(1997)用RAPD研究球孢囊线虫的遗传变异，结果表明球孢囊线虫种内不同群体的遗传变异极小，但种间的差异性较大。

马铃薯孢囊线虫种特异性引物研究较多，如Mulholland et al.(1996)根据ITS1区域设计出了马铃薯金线虫的特异性引物和马铃薯白线虫的特异性引物，与通用引物进行PCR反应，扩增出238bp马铃薯金线虫DNA片断，扩增出391bp的马铃薯白线虫特异性DNA片断。据此可以区分马铃薯金线虫和马铃薯白线虫。Bulmam&Marshall，1997年根据马铃薯孢囊线虫澳大利亚群体ITS分析结果，设计出了马铃薯金线虫种的特异性引物PITSr3和马铃薯白线虫的特异性引物PITSp4，用PITSr3可以扩增出一个特异性识别马铃薯金线虫的343bp DNA带，用PITSp4可以扩增出特异性识别马铃薯白线虫的265bpDNA片断。

Fullanodo,A.et al.(1999)用随机引物OPG5分别扩增出区分马铃薯金线虫特异性RAPD标记片段为826bp，马铃薯白线虫特异性RAPD标记片段为1100bp。对扩增出的马铃薯金线虫和白线虫的RAPD标记片段进行全序列分析，将RAPD标记转化成SCAR标记，设计出马铃薯金线虫FullGrf和FullGrr以及马铃薯白线虫的SCAR特异性标记引物FullGpf和FullGpr，用FullGrf和FullGrr扩增出了315bp马铃薯金线虫的特异性片段，用FullGpf和FullGpr扩增出798bp的马铃薯白线虫的特异性片段,这是目前已知孢囊形线虫首例RAPD-SCAR标记。

植物线虫基于基因组DNA的SCAR标记的稳定性和特异性渐渐被认识到，而近几年发展迅猛。Ou,S.Q.Peng D.L.(欧师琪彭德良等2008)采用RAPD技术，获得了基于大豆孢囊线虫基因组DNA的特异性SCAR标记，构建了特异性SCAR标记的特异性引物SCNFI和SCNRI，PCR扩增出500bp大豆孢囊线虫的特异性SCAR片段，选用核糖体引物D2A和D3B作为内标与上述特异性引物SCNF1和SCNR1相结合，发明了一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫，在PCR扩增条件下，大豆孢囊线虫群体都获得了500bp的特异性SCAR标记片段和800bp片段。随后获得菲利普孢囊线虫、小麦禾谷孢囊线虫、豌豆孢囊线虫的SCAR标记。(彭德良、亓晓莉等2013)。

以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷。但PCR检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以检测，需要较长的时间，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。

循环恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本学者Notomi(2000年)等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。反应采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在等温条件下(61～65℃左右)可以高效(30min～lh)和特异的扩增目标DNA。在LAMP反应过程中,从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合,能产生焦磷酸镁沉淀物,出现浑浊沉淀,因此用肉眼就判定扩增结果,也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过变化来判定结果,也可通过琼脂糖凝胶电泳进行观察可以看到梯形条带，尤其适宜于基层的简洁快速检测。LAMP反应具有简单、快速、高效、经济等特征。因而具有极为广泛的应用前景

目前,LAMP在动物疫病和食品安全方面广泛应用，国内最早报道是在2002年北京奶牛中心运用引进的LAMP法进行胚胎性别的检测。2009年日本Kikuchi开发出松材线虫LAMP快速检测体系，能在1小时内检测到松材线虫。2012、2013年彭德良等分别获得香蕉穿孔线虫和象耳豆根结线虫的LAMP快速检测专利，但在马铃薯金线虫上尚无相关报道。本发明第一次采用LAMP技术检测马铃薯金线虫。

发明内容

本发明的目的是获得马铃薯金线虫的SCAR标记建立检测体系，同时利用SCAR标记DNA片段的特异性建立马铃薯金线虫的LAMP快速检测方法。

马铃薯金线虫特异SCAR标记的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

一种马铃薯金线虫特异性SCAR-PCR快速检测方法，其特征在于：SCAR-PCR反应体系中含有权利要求2所述的特异性引物GrF1和GrR1，其序列为：

GrFI：5’-GGACCCTGACCGAATTCTGTTCCA-3’

GrRI：5’-GGACCCTGACAACGGATGGCACGA-3’。

马铃薯金线虫SCAR-PCR快速检测方法，其特征在于：SCAR-PCR反应体系中含有:2.5μl的10×PCR含Mg²⁺的Buffer；2μl10mM dNTP；1μl特异性引物GrF1和GrR1；1U Taq DNA聚合酶；1μl模板DNA；灭菌ddH2O补足至25μl。

马铃薯金线虫SCAR-PCR快速检测方法，所述的SCAR-PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃30S，65℃60S，72℃2min循环35次，72℃延伸10min后保存在4℃条件下。

一种马铃薯金线虫LAMP快速检测方法，所述LAMP反应体系所使用的引物是：

①GrF3:5’-CCCTGACCGAATTCTGTT-3’，

②GrB3:5’-AAATTGTCGGACGCGAAT-3’，

③GrFIP:5’-CCGACCGATGGTTCAGAGAGCCAATATAATGTACAACAACATCTC-3’，

④GrBIP:5’-GTACACACACCGGTAGGCAAGAGAGAAATATTCTCAAATCTTGGA-3’。

一种马铃薯金线虫LAMP快速检测方法，所述LAMP反应体系包括：

引物混合液：外引物GrF3和GrB3各0.2μmol/L，内引物GrFIP和GrBIP各1.6μmol/L；

反应混合液：4mmol/L dNTPs，20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，5.75mmol/L MgS0₄，10mmol/L(NH₄)₂S0₄，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段；

3)1μL DNA模板；

加灭菌双蒸馏水补足到20μL。

LAMP反应条件如下：将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入1μLDNA模板后，61～65℃温育60～90min，82℃保温10min。

上述任一检测方法在诊断植物、土壤的马铃薯金线虫感染情况或鉴别马铃薯金线虫中的应用。

本发明利用SCAR标记和LAMP建立针对马铃薯金线虫的检测方法。本发明特异SCAR标记的DNA片段设计4条LAMP引物，此方法具有多条引物的扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于LAMP反应操作步骤简单及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，荧光剂显色后可以用肉眼观察判定反应结果，本发明不仅适用于各种实验条件下检测工作的使用，其中LAMP更适合在实验条件不足的室外检测。

本发明的方案具体实施步骤如下：

1.线虫DNA提取试剂配制

1)LB(Lysis Buffer)溶液：500mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl2，1.0mmol/LDTT，4.5％Tween20，等体积混匀，过滤灭菌。

2)蛋白酶K：20mg/mL蛋白酶K。

2.DNA的提取

挑取孢囊线虫单头二龄幼虫放入装有14μL ddH₂O的0.2ml离心管中，加入3μL的LB(lysis buffer)溶液，3μL蛋白酶K溶液，点动离心后，放入液氮中，再放入37℃水浴锅中，待融后放入液氮中，重复6～7次，然后在-80℃下冷冻30min。然后将离心管取出，在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。

3.马铃薯金线虫特异SCAR标记的DNA片段获得及序列分析

采用随机引物OPA06(5’-GGACCCTGAC-3’)扩增不同孢囊线虫种群。扩增反应体系为：10×Buffer(含Mg²⁺)2.5μL，10mM dNTPs2.0μL，1U Taq酶(5U/μL,Takara)，引物(1μg/μL)1.5μL，模板DNA0.5μL，灭菌ddH2O补足至25μL。PCR扩增条件为：94℃下变性4min后，94℃变性30S，35℃退火30S，72℃延伸1min，10个循环；94℃变性30S，35℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环。最后72℃延伸10min后保存在4℃条件下。

PCR扩增后，取5μL扩增产物加1μL加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相，找到马铃薯金线虫特异SCAR标记的DNA片段，回收、克隆和测序如SEQ ID NO1，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。

4.马铃薯金线虫SCAR引物设计

根据马铃薯金线虫RAPD特异性片段测序结果为模板，设计以下2条引物，序列如下：

GrFI：5’-GGACCCTGACCGAATTCTGTTCCA-3’

GrRI：5’-GGACCCTGACAACGGATGGCACGA-3’。

5.SCAR反应体系配置：引物GrFI和GrRI(1ng/μL)；0.8mmol/L dNTPs，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，1.5mmol/L MgS0₄，1U Taq DNA聚合酶；1μL DNA模板；灭菌ddH₂O补足至50μL。

6.SCAR-PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃30S，65℃60S，72℃2min循环35次，72℃延伸10min后保存在4℃条件下。

PCR扩增后，取5μL扩增产物加1μL加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相。

7.马铃薯金线虫LAMP引物设计

根据马铃薯金线虫SCAR特异性片段测序结果为模板，设计以下4条引物，序列如下：

①GrF3:5’-CCCTGACCGAATTCTGTT-3’，

②GrB3:5’-AAATTGTCGGACGCGAAT-3’，

③GrFIP:5’-CCGACCGATGGTTCAGAGAGCCAATATAATGTACAACAAC-ATCTC-3’，

④GrBIP:5’-GTACACACACCGGTAGGCAAGAGAGAAATATTCTCAAATC-TTGGA-3’。

8.LAMP反应体系配置：外引物GrF3和GrB3各0.2μmol/L，内引物GrFIP和BIP各1.6μmol/L，4mmol/L dNTPs，20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，5.75mmol/L MgS0₄，10mmol/L(NH₄)₂S0₄，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段，1μL DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到20μL。

9.LAMP反应扩增条件：将以上各成分加入反应管中混合后，置于62℃恒温水浴中等温扩增85min，再82℃保温5min，反应结束后加入2μL配制好的显色剂混匀后观察结果。

10.LAMP结果检测：结果可以采用以下三种检测方法：

1)将上述反应完的体系中加入2μL的显色剂。轻晃混匀，即可观察；

2)取2μL扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带；

3)将反应后的离心管3000rpm离心30S，阳性的管底可观察到白色沉淀。

本发明所提供的马铃薯金线虫SCAR标记和LAMP快速检测方法具有以下优点：

一、特异性强，所用的特异引物是获得的RAPD特异性标记转化为SCAR标记和LAMP方法，引物对仅马铃薯金线虫模板DNA扩增发生扩增反应，并提供PCR和非PCR两种方法检测马铃薯金线虫，比其他检测方法更具保真性。

二、灵敏度高，常规PCR检测马铃薯金线虫的检测灵敏度达到1/2000条幼虫水平，LAMP方法检测极限比其高1000倍。

三、检测时间短，SCAR-PCR检测需时2～4h，LAMP1小时左右可获得检测结果。

四、LAMP不需要PCR仪，对仪器设备要求低，不需要任何PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅或者保温瓶就可以完成检测。

五、LAMP操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，一般技术人员即可完成检测，结果容易辨别，通过不同颜色，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察。

六、LAMP对人和环境友好，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。

综上所述，本发明比现有检测马铃薯金线虫的方法具有更高的特异性、灵敏度和便携性。可以在实际生产中现场应用检测。该技术可应用于对携带有马铃薯金线虫进出口物品包括土壤样品及植物上进行快速分子检测，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1为马铃薯金线虫的特异SCAR标记的DNA片段以及SCAR引物和LAMP引物设计示意图。

图2为马铃薯金线虫SCAR标记检测M：DL2000marker；1-8：PCNr3，PCNp1，SCN29，SCN11，SCN03，SCN05，SCN10，CCN02；9：阴性对照。

图3为马铃薯金线虫LAMP检测方法特异性检测结果图

A为LAMP加荧光染料检测结果图，1～8分别为：PCNr3、PCNr4、PCNp1、SCN29、BCN、CCN03、CCN01和阴性对照。

B为LAMP检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量(Takara)，1～11分别为：PCNr3、PCNr4、PCNp1、SCN29、BCN、CCN03、CCN04、CCN01、CCN02、CCN05和阴性对照。图4为马铃薯金线虫灵敏度检测结果

A为LAMP加荧光染料检测结果图，1～8分别为：单头线虫，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和阴性对照。

B为LAMP检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量(Takara)，1～7分别为：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和阴性对照。

C为普通PCR法检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量(Takara)，1～7分别为：单头线虫，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、阴性对照。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

所述试剂均为市售，所用线虫为检疫性线虫，本申请人实验室少量保存，仅供研究。

试验材料

表1孢囊线虫样品代码及群体来源

主要试剂：Taq DNA聚合酶购自天根公司；DNA marker购自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；pGEM-T Easy Vector购于美国promega Pro K(蛋白酶K)购自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段购自New England Biolabs公司；SYBR green I购自Invitrogen公司。

1.1孢囊线虫DNA的提取

挑取孢囊线虫(见表1)单头二龄幼虫放入装有14μL ddH₂O的0.2ml离心管中，加入3μL的LB(lysis buffer)溶液，3μL蛋白酶K溶液，点动离心后，放入液氮中，再放入37℃水浴锅中，待融后放入液氮中，重复6～7次，然后在-80℃下冷冻30min。然后将离心管取出，在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。

1.2马铃薯金线虫特异SCAR标记的DNA片段获得及序列分析

采用随机引物OPA06(5’-GGACCCTGAC-3’)扩增不同孢囊线虫种群。扩增反应体系为：10×Buffer(含Mg²⁺)2.5μL，10mM dNTPs2.0μL，1U Taq酶(5U/μL,Takara)，引物(1μg/μL)1.5μL，模板DNA0.5μL，灭菌ddH₂O补足至25μL。PCR扩增条件为：94℃下变性4min后，94℃变性30S，35℃退火30S，72℃延伸1min，10个循环；94℃变性30S，35℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环。最后72℃延伸10min后保存在4℃条件下。

PCR扩增后，取5μL扩增产物加1μL加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相，找到马铃薯金线虫RAPD特异性片段，将特异性片段回收纯化、克隆和测序如SEQ ID NO1，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。

实施例2

2.1马铃薯金线虫SCAR引物设计

根据马铃薯金线虫RAPD特异性片段测序结果，设计以下2条引物，设计位置见图1所示，序列如下：

GrFI：5’-GGACCCTGACCGAATTCTGTTCCA-3’

GrRI：5’-GGACCCTGACAACGGATGGCACGA-3’。

2.2SCAR反应体系配置：引物GrFI和GrRI(1ng/μL)；0.8mmol/L dNTPs，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，1.5mmol/L MgS0₄，1U Taq DNA聚合酶；1μL DNA模板；灭菌ddH₂O补足至50μL。

2.3SCAR-PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃30S，65℃60S，72℃2min循环35次，72℃延伸10min后保存在4℃条件下。

2.4马铃薯金线虫SCAR标记特异性检测

收集马铃薯白线虫、甜菜孢囊线虫、大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、豌豆孢囊线虫等不同群体(见表1)，提取其DNA作为模板与马铃薯金线虫DNA模板一起进行引物GrFI和GrRI的SCAR反应体系检测，以检测马铃薯金线虫LAMP检测方法的特异性。

将上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，加入1μL模板DNA，按2.3的反应条件进行，PCR扩增后，取5μL扩增产物加1μL加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图2所示)。第一泳道为马铃薯金线虫群体，可见440bp SCAR片段，其他群体线虫和阴性对照一致，无扩增产物。结果表明上述SCAR引物和反应体系在检测马铃薯金线虫时具有很高的特异性。

实施例3LAMP技术检测马铃薯金线虫方法的建立

3.1LAMP引物设计

根据马铃薯金线虫SCAR特异性片段测序结果，设计以下4条引物，引物交上海生物工程技术服务有限公司合成。引物设计图示位置见图1，引物序列如下：

①GrF3:5’-CCCTGACCGAATTCTGTT-3’，

②GrB3:5’-AAATTGTCGGACGCGAAT-3’，

③GrFIP:5’-CCGACCGATGGTTCAGAGAGCCAATATAATGTACAACAACATCTC-3’，

④GrBIP:5’-GTACACACACCGGTAGGCAAGAGAGAAATATTCTCAAATCTTGGA-3’。

3.2LAMP反应体系配置：外引物GrF3和GrB3各0.2μmol/L，内引物GrFIP和BIP各1.6μmol/L，4mmol/L dNTPs，20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，5.75mmol/L MgS0₄，10mmol/L(NH₄)₂S0₄，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段，1μL DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到20μL。

3.3LAMP反应扩增条件：将以上各成分加入反应管中混合后，置于62℃恒温水浴中等温扩增85min，再82℃保温5min，反应结束后加入2μL配制好的显色剂混匀后观察结果(如图3中的A所示)前两管为马铃薯金线虫DNA，可以观察到绿色荧光，其他管的线虫和阴性对照均为红褐色。取2μL产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图3中的B所示)，可看到有LAMP的特征性梯形带。

实施例4马铃薯金线虫LAMP特异性检测

收集马铃薯白线虫、甜菜孢囊线虫、大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、豌豆孢囊线虫等不同群体(见表1)，分别提取其DNA作为模板与马铃薯金线虫DNA模板一起进行LAMP检测，以检测马铃薯金线虫LAMP检测方法的特异性。

将上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，加入1μL模板DNA，按3.3的反应条件进行，反应结束后加入2μL配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(如图3中A所示)，前两管为马铃薯金线虫DNA，可以观察到绿色荧光，其他管的线虫和阴性对照均为红褐色。取2μL产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图3中的B所示)，可看到第一、二泳道有LAMP的特征性梯形带，其他泳道均未发现有扩增产物。结果表明上述LAMP引物和反应体系在检测马铃薯金线虫时具有很高的特异性。

实施例5马铃薯金线虫LAMP灵敏度检测

将单头马铃薯金线虫二龄幼虫提取的DNA模板按10倍稀释成1.0×10^-1～1.0×10^-66个浓度，各取1μL DNA做模板，将上述的引物混合液和反应混合液混合均匀后，按3.3反应条件进行，反应结束后加入2μL配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(如图4中的A所示)，1～5管均可以看到绿色荧光。取2μL产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图4中的B所示)，可以看出1～5泳道均有LAMP的特征性梯形带，灵敏度能达到1/2000000头线虫。同时以上述稀释DNA为模板，进行常规PCR检测，凝胶电泳观察结果(如图4中的C所示)。结果表明在DNA稀释到10^-2倍时，能够观察到扩增条带，再稀释时常规PCR则不能检测。

以上结果说明：上述LAMP检测体系能够检测到1/200 0000头马铃薯金线虫。具有极高的灵敏度，比常规PCR检测灵敏1000倍。

Claims

1.马铃薯金线虫特异SCAR标记的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

2.一种马铃薯金线虫特异性SCAR-PCR快速检测方法，其特征在于：SCAR-PCR反应体系中含有特异性引物GrF1和GrR1，其序列为：

GrFI：5’-GGACCCTGACCGAATTCTGTTCCA-3’

GrRI：5’-GGACCCTGACAACGGATGGCACGA-3’。

3.根据权利要求2所述马铃薯金线虫SCAR-PCR快速检测方法，其特征在于：SCAR-PCR反应体系中含有:2.5μl的10×PCR含Mg²⁺的Buffer；2μl10mM dNTP；1μl特异性引物GrF1和GrR1；1U Taq DNA聚合酶；1μl模板DNA；灭菌ddH2O补足至25μl。

4.根据权利要求3所述马铃薯金线虫SCAR-PCR快速检测方法，所述的SCAR-PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃30S，65℃60S，72℃2min循环35次，72℃延伸10min后保存在4℃条件下。

5.一种马铃薯金线虫LAMP快速检测方法，所述LAMP反应体系所使用的引物是：

①GrF3:5’-CCCTGACCGAATTCTGTT-3’，

②GrB3:5’-AAATTGTCGGACGCGAAT-3’，

③GrFIP:5’-CCGACCGATGGTTCAGAGAGCCAATATAATGTACAACAACATCTC-3’，

④GrBIP:5’-GTACACACACCGGTAGGCAAGAGAGAAATATTCTCAAATCTTGGA-3’。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：其中的LAMP反应体系包括：

1)引物混合液：外引物GrF3和GrB3各0.2μmol/L，内引物GrFIP和GrBIP各1.6μmol/L；

2)反应混合液：4mmol/L dNTPs，20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，5.75mmol/L MgS0₄，10mmol/L(NH₄)₂S0₄，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段；

3)1μL DNA模板；

加灭菌双蒸馏水补足到20μL。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其中LAMP反应条件如下：将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入1μLDNA模板后，61～65℃温育60～90min，82℃保温10min。

8.权利要求2-7任一所述检测方法在马铃薯金线虫早期诊断或鉴别中的应用。