CN102586461B - 一种北方根结线虫lamp快速检测方法及应用 - Google Patents
一种北方根结线虫lamp快速检测方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种北方根结线虫LAMP快速检测方法及应用，属生物技术领域。本发明根据克隆测序的北方根结线虫ITS序列，在其序列保守区域设计了5条LAMP引物MHF3、MHB3、MHFIP、MHBIP和MHLB，探针MH-FITC-Probe5’端用FITC标记，其中MHFIP引物的5’端用生物素标记。通过对北方根结线虫DNA提取，采用上述特异性引物混合物、反应缓冲液和反应酶，等温扩增、扩增产物显色检测，从而快速检测出北方根结线虫。本发明的检测方法特异性强、灵敏度高、成本低廉、操作简便，灵敏度高，在北方根结线虫现场快速检测和北方根结线虫病的早期诊断方面具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及北方根结线虫LAMP快速检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)属植物根系专性内寄生线虫，是世界性分布的威胁全球农业生产的重要植物病原线虫之一。迄今己记载的根结线虫有90余种，其中南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)和花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)是四种常见最重要的根结线虫。
在我国，这四种根结线虫在大多数省(区)均有发生，侵染农作物达百种以上，致使寄主常年减产15～25％，有时达70％以上(徐建华，魏大为，詹裕定和程瑚瑞.江苏省大棚蔬菜寄生线虫的种类和发生.南京农业大学学报，1994，17(1)：47-51).，严重地制约了大棚蔬菜、果树、花卉等作物的生产和出口创汇。据估计，我国农作物的生产每年因根结线虫的为害而遭受的经济损失达数亿元以上。据调查研究，我国分布最广泛、最常见的根结线虫与世界各地类似，包括南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)。北方根结线虫是1949年Chitwood在太平洋地区的咖啡树上发现的(Chitwood，B.G.1949.Root-knot nematodes.Part-I.A revision of the genus Meloidogyne Goeldi，1887.Proceedings of the Helminthological Society of Washington 16：90-104.)。
根结线虫的传统鉴定方法主要根据形态学，主要是根据会阴花纹进行鉴定，但由于不同地理种群之间存在较大的变异性导致有时结果不够准确。再者形态特征细微复杂，对专业知识要求高，鉴定过程耗时、费力，且需要大量线虫样本，在单头线虫水平上不能达到要求。
后来发展的同工酶技术能快速准确的鉴定不同的根结线虫，但是它需要有适宜雌虫的存在，因而不适用于多数情况下幼虫和卵的检测。
由于形态学和同工酶技术的局限性，上世纪90年代起开始了根结线虫分子鉴定的研究。目前针对根结线虫的PCR诊断法主要基于rDNA的ITS和IGS序列的rDNA-PCR法，基于mtDNA的mtDNA-PCR-RFLP法，基于RAPD的SCAR-PCR法。
真核生物的rDNA在基因组内是以串联重复序列的形式出现，每一串联重复序列包括3个编码区(18SrRNA，5.8SRNA，28SRNA)和两个ITS(Internal Transcribed Spacers)区，两个串联重复序列之间各一段IGS(Intergenetic Spaces)区。ITS是随后发展起来的全新分子标记，其优点在于拷贝数多，同时包含保守和变异序列，根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增。Zijlstra等(Zijlstra，C.，Lever，A.E.M.，Uenk，B.J.and Sifhout，C.H.Differences between ITSregions of isolates of root-knot nematode Meloidogyne hapla and M.chitwoodi.Phytopathology，1995，85：1231-1237.Zijlstra，C.，Uenk，B.J.and Sifhout，C.H.A reliable，precise method todifferentiate species of root-knot nematode in mixtures on the basis of ITS-RFLPs.Fundamentaland Applied Nematology.1997，20：59-63.)分析了M.hapla和M.chitwoodi ITS区的差异进行了ITS-PCR-RFLP分析，发现用Aui I、Dra I、HinfI可将二者分开，并且还能将二者与M.incognita和M.javanica分开。Pertersen等(Petersen，D.J.，Vrain，T.C.Rapid identification of Meloidogynechitwoodi，M.hapla，and M.fallax using PCR primers to amplify thei ribosomal intergenic spacer.Fundamental and Applied Nematology.1996，19(6)：601-605.)使用PCR引物扩增M.chitwoodi、M.hapla和M.fallax的ITS区，实现了对3种根结线虫的快速鉴定。Pertersen等(Pertersen，D.J.，Zijlstra，C.，Wishart，J.，Blok，V.and Vrain，T.C.Specific probes efficiently distinguish root-knotnematode species using signature sequences in the ribosomal intergenic spacer.Fundamental andApplied Nematology，1997，20：619-626.)根据IGS区的差异，设计了5条PCR引物，应用multiplex-PCR同时实现了对M.chitwoodi、M.fallax和M.hapla的鉴定，其灵敏度可达单条幼虫。然而Powers等(Power，T.O.，Todd，T.C.，Burnell，A.M.，Murray，P.C.B.，Fleming，C.C.，Szalanski，A.L.，Adams，B.A.，and Harris，T，S.The rDNA internal transcribed spacer region as ataxonomic marker for nematodes.Journal of Nematology.1997，29(4)：441-450.)发现M.incognita、M.javanica和M.arenaria ITS序列一致，Hugall等(Hugall，A.，Stanton，J.，andMoritz，C.Reticulate evolution and the origins of ribosomal internal transcribed spacer diversity inapomictic Meloidogyne.Molecular and Biological Evolution.1999，16：157-164.)通过序列分析发现3种多倍体的主要根结线虫(M.incognita、M.javanica和M.arenaria)ITS区遗传变异较大，因此基于rDNA的鉴别方法无法有效区分主要根结线虫种群。
RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)，是由Wiliamson等(Williams，J.G.，Kubelik，A.R.，Livak，K.J.，Rafalski，J.A.，and Tingey，S.V.DNA polymorphisms amplified by arbitraryprimers are useful as genetic markers.Nucleic Acids Reaseareh.1990，18(22)：6531-6535.)和Welsh等(Welsh，J.，McClelland，M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers.Nucleic Acids Reaseareh.1990，18(24)：7213-7218.)几乎同时发明的，RAPD依赖一系列不同的随机排列的寡核苷酸作为引物，对所研究的基因组DNA进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，经EB染色检测扩增产物的多态性。
近年来，SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)技术的得到了广泛应用。Wiliamson等(Williamson，V.M.，Caswell-Chen，E.P.，Westerdahl，B.B.，Wu，F.F.，and Caryl，G.Assay to Identify and Distinguish Single Juveniles of Meloidogyne hapla and M.chitwoodi.Journalof Nematology，29(1)：9-15.)通过对M.chitwoodi和M.hapla基因组DNA的RAPD分析，筛选出具有M.hapla种鉴定特征的特异性片段，经克隆测序后，设计了一对特异性引物，准确鉴定了M.hapla；Zijlstra等(Zijlstra，C.，Donkers-Venne，D.T.H.M.and Fargette，M.Identification ofMeloidogyne incognita，M.javanica and M.arenaria using sequence characterized amplifiedregion(SCAR)based PCR assays.Nematology，2000，2：847-853)根据M.incognita、M.javanica和M.arenaria 3种根结线虫的RAPD标记，设计了3对SCAR引物，快速、准确的鉴定了这3种线虫；Zijlstra等(Zijlstra，C.，Donkers-Venne，D.T.H.M.and Fargette，M.Identification ofMeloidogyne incognita，M.javanica and M.arenaria using sequence characterized amplifiedregion(SCAR)based PCR assays.Nematology，2000，2：847-853)利用SCAR-PCR同样鉴定了M.chitwoodi、M.fallax和M.hapla。
以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷。但PCR检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以检测，需要较长的时间，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。
环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本学者Notomi(Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research，2000，28：e63.)发明的一种新式恒温核酸扩增技术。反应采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNA polymerase)，在等温条件下(65℃左右)可以高效(30min～60min)、高特异的扩增目标DNA。在LAMP反应过程中，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，能产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过变化来判定结果，也可通过琼脂糖凝胶电泳进行观察可以看到梯形条带，尤其适宜于基层的简洁快速检测。LAMP反应具有简单、快速、高效、经济等特征。因而具有极为广泛的应用前景
目前，LAMP在动物疫病和食品安全方面广泛应用，国内最早报道是在2002年北京奶牛中心运用引进的LAMP法进行胚胎性别的检测。2009年日本Kikuchi(Kikuchi T，Aikawa T，OedaY，Karim N，Kanzaki N.A Rapid and Precise Diagnostic Method for Detecting the PinewoodNematode Bursaphelenchus xylophilus by Loop-Mediated Isothermal Amplification.Nematology.2009，12：1365-1369.)开发出松材线虫LAMP快速检测体系，能在1小时内检测到松材线虫。2011年Niu等(Niu J H，Guo Q X，Jian H，Chen C L，Yang D，Liu Q，Guo Y D.Rapid detection ofMeloidogyne spp.by LAMP assay in soil and roots.Crop Protection 2011，8，1063-1069.)根据18s-rDNA-ITS序列差异，开发出能检测根结线虫及特异性检测南方根结线虫的LAMP检测技术，2011年Niu等(Niu，J.H.，Guo，Q.X.，Jian，H.，Chen，C.L.，Yang，D.，Liu，Q.，Guo，Y.D.Rapiddetection of Meloidogyne spp.by LAMP assay in soil and roots.Crop Protection，2011，30：1063-1069.)根据根结线虫rDNA-IGS的序列差异，开发出象耳豆根结线虫LAMP检测技术。
发明内容
本发明的目的是采用环介导等温扩增技术(LAMP)建立检测北方根结线虫的LAMP快速检测方法。
一种北方根结线虫LAMP快速检测方法，以北方根结线虫DNA为模板，LAMP反应体系试剂中包括引物混合物、探针、反应缓冲液和反应酶，所述引物混合物有如下引物：
①MHF3：5’-GAATATGAGGTGACATGTTAGG-3’，
②MHB3：5’-TCAATGTTTCTGCAGTTCG-3’，
③MHFIP：5’-TGAAAAAAATATTGCTGGCGTCCACCTTAATCGGGTTTAAGACT-3’，
④MHBIP：5’-TCTATCCTTATCGGTGGATCACTCCACAAATTATCGCAGTTAGCT-3’，
⑤MHLB：5’-GGCTCGTGGATCCATGAAGAACG-3’，
所述方法还包括观察检测结果步骤，其特征在于：在LAMP反应完的体系加入显色剂，观察显色情况。
所述显色剂为SYBR green I。
所述方法还包括观察检测结果步骤，其特征在于：取LAMP扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带。
所述方法还包括观察检测结果步骤，其特征在于：引物混合物中MHFIP或MHBIP的5’端带有生物素标记，在LAMP反应产物中加入FITC标记的探针，63℃保温5min，冷却到室温，取8μL的杂交液加入100μl PBS缓冲液，将LFD试纸浸入到杂交后的溶液中，通过观察LFD试纸上的条带，所述探针序列为：MH-FITC-Probe：5’-CTCGTGGATCCATGAAGAAC-3’，MH-FITC-Probe的5’端用FITC标记。
所述引物混合液：外引物MHF3和MHB3各0.2μmol/L，内引物MHFIP和MHBIP各1.6μmol/L，环引物MHLB为0.4μmol/L，所述反应缓冲液：6mmol/L dNTP，20mmol/LTris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，5mmol/L MgSO4，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1％Tritonx-100；反应酶：8U Bst DNA聚合酶大片段。
所述探针的浓度为20pmol/L。
所述LAMP反应条件：将引物混合液、反应缓冲液、反应酶混合均匀后加入1μl DNA模板后，61～65℃保温30～60min，82℃保温5min。
所述北方根结线虫DNA的提取试剂组分配方如下：
1)WLB溶液：500mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl2，1.0mmol/L DTT，4.5％Tween20，等体积混匀，过滤灭菌；
2)蛋白酶K：20mg/mL蛋白酶K。
所述北方根结线虫DNA的提取方法为：挑取单头根结线虫放入装有10μl ddH2O的0.2mL离心管中，加入8μl的WLB溶液，2μl蛋白酶K溶液，放入液氮中，再放入37℃水浴锅中，待融化后放入液氮中，重复6～7次，然后在-80℃下冷冻30min；将离心管转移到65℃下温育90min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。
本发明利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立针对北方根结线虫的检测方法。本方法具有多条引物的扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于LAMP反应操作步骤简单及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，荧光剂显色后可以用肉眼观察判定反应结果，也可以用LFD试纸直接检测反应结果，适用于各种实验条件下检测工作的使用，也适合在实验条件不足的室外检测。
本发明的方法具体实施方案
1、线虫裂解液的配制
1)WLB(Worm Lysis Buffer)溶液：500mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，15mmol/LMgCl2，1.0mmol/L DTT，4.5％Tween20，等体积混匀，过滤灭菌。
2)蛋白酶K：20mg/ml蛋白酶K。
2、线虫DNA的提取
挑取单头北方根结线虫放入装有10μl ddH2O的0.2ml离心管中，加入8μl的WLB溶液，2μl蛋白酶K溶液，放入液氮中，再放入37℃水浴锅中，待融后放入液氮中，重复6～7次，然后在-80℃下冷冻30min。然后将离心管取出，在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。
3、北方根结线虫rDNA-ITS扩增及序列分析
采用ITS区的通用引物rDNA1(5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’)和rDNA2(5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’)扩增两个北方根结线虫种群ITS区片段。PCR扩增反应体系为50μl，PCR反应体系为10×Buffer(含Mg2+)5μl，10mM dNTP 4μl，引物rDNA1和rDNA2(10μmol/L)各1μl，Taq酶(5U/μl，Takara)0.5μl，模板DNA 5μl，灭菌ddH2O补足至50μl。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，55℃退火30sec，72℃延伸1min；94℃变性45sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相回收、克隆和测序，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。
4、北方根结线虫LAMP引物设计
根据北方根结线虫ITS测序结果为模板，设计以下5条引物和一条探针，序列如下：
①MHF3：5’-GAATATGAGGTGACATGTTAGG-3’
②MHB3：5’-TCAATGTTTCTGCAGTTCG-3’
③MHFIP：5’-TGAAAAAAATATTGCTGGCGTCCACCTTAATCGGGTTTAA
GACT-3’
④MHBIP：5’-TCTATCCTTATCGGTGGATCACTCCACAAATTATCGCAGTT
AGCT-3’
⑤MHLB：5’-GGCTCGTGGATCCATGAAGAACG-3’
⑥MH-FITC-probe：5’-CTCGTGGATCCATGAAGAAC-3’
LFD试纸检测时，使用5′端生物素标记的MHFIP引物和5′端用FITC标记MH-FITC-Probe探针。
5、LAMP反应体系配制：外引物MHF3和MHB3各0.2μmol/L，内引物MHFIP和MHBIP各1.6μmol/L，环引物MHLB为0.4μmol/L，10mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，5mmol/L MgSO4，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段，1μl DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到25μl。
6、LAMP反应体系扩增条件：将以上反应成分加入反应管中混合后，置于60～65℃恒温水浴中等温扩增30～60min，82℃保温5min。
7、LAMP结果检测：结果可以采用以下三种检测方法：
1)将上述反应完的体系中加入2μl的显色剂。轻晃混匀，即可肉眼观察；
2)取2μl扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带；
3)在反应产物中加入5μL FITC标记的MH-FITC-Probe探针，63℃保温5min，冷却到室温，取8μL的杂交液加入100μl PBS缓冲液，将LFD试纸浸入到杂交后的溶液中，通过观察LFD试纸上的条带即可得到结果。
本发明所提供的北方根结线虫LAMP快速检测方法具有以下优点：
一、灵敏度高，对北方根结线虫的检测极限可低至1/200 000头，检测灵敏度比常规PCR高100倍。
二、特异性强，所用的特异引物根据北方根结线虫的ITS不同区域设计出5条引物，并与特异性探针结合，特异性比常规PCR要强。
三、检测时间短，1h左右可获得检测结果，比常规PCR检测节省2～4h。
四、仪器设备要求低，不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅就可以完成检测。
五、操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学学基础的人员即可完成。结果清晰明显，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察。
六、对人和环境友好，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。
综上所述，本发明具有比现有PCR技术检测北方根结线虫的方法具有更高的特异性、灵敏度和便携性。可以在实际生产中现场应用检测。该技术可应用于对北方根结线虫田间土壤样品及植物上北方根结线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。
附图说明
图1北方根结线虫ITS序列的LAMP引物和探针设计示意图，
A为北方根结线虫LAMP引物和探针的位点，
B为北方根结线虫LAMP引物设计示意图，
图2北方根结线虫LAMP方法检测，
A为加荧光染料检测结果，1：阳性结果，具有绿色荧光，2：阴性对照，为深褐色。B为检测结果为电泳图，M：D2000DNA标准分子量(Takara)1：阳性结果，为LAMP扩增梯形条带，2：阴性对照，无扩增产物。
C为LFD试纸检测结果图，1：阳性结果，有测试带和控制带，2：阴性对照，只有控制带。
图3北方根结线虫不同地理种群的LAMP检测结果
A为加荧光染料检测结果，1：MHYJ，2：MHYN，3：阴性对照。
B为电泳检测结果，M：D2000DNA标准分子量(Takara)，1：MHYJ，2：MHYN，3：阴性对照。
C为LFD试纸检测结果，1：MHYJ，2：MHYN，3：阴性对照。
图4北方根结线虫LAMP方法特异性检测结果
A为LAMP加荧光染料检测结果图，1～13分别为：MHYJ、MIDX、MEXED、MJYN、MAYN、RSAM、PLD、DdCL、GS-14、GS-11、BD、BX和阴性对照。
B为LAMP检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量(Takara)，1～13分别为：MHYJ、MIDX、MEXED、MJYN、MAYN、RSAM、PLD、DdCL、GS-14、GS-11、BD、BX和阴性对照。
图5北方根结线虫LAMP方法灵敏度检测结果
A为LAMP加荧光染料检测结果图，1～8分别为：单头线虫，10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和阴性对照。
B为LAMP检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量(Takara)，1～8分别为：单头线虫，10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和阴性对照。
C为普通PCR法检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量(Takara)，1～8分别为：单头线虫，10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和阴性对照。
具体实施方式
实验材料
共收集2个北方根结线虫种群(MHYJ和MHYN)(见表1)。本实验室均有保存，可以对公众发放。
表1供试北方根结线虫种群及其来源
主要试剂：Taq DNA聚合酶和DNA marker购自大连TaKaRa公司；引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成；pGEM-T Easy Vector购于美国promega；蛋白酶K购自德国Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段购自美国New England Biolabs公司；SYBR green I购自美国Invitrogen公司；横向流动试纸购自德国MileniaBiotec公司。
实施例1北方根结线虫DNA的提取、rDNA-ITS扩增及序列分析
1.1北方根结线虫DNA的提取
挑取单头根结线虫放入装有10μdddH2O的0.2ml离心管中，加入8μl的WLB溶液，2μl蛋白酶K溶液，点动离心后，放入液氮中，再放入37℃水浴锅中，待融后放入液氮中，重复6～7次，然后在-80℃下冷冻30min。然后将离心管取出，在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。
1.2北方根结线虫rDNA-ITS扩增及序列分析
利用ITS区的通用引物rDNA1(5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’)和rDNA2(5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’)扩增两种北方根结线虫种群ITS区片段。PCR扩增反应体系为50μl，PCR反应体系为10×Buffer(含Mg2+)5μl，10mM dNTP 4μl，引物rDNA1和rDNA2(10μmol/L)各1μl，Taq酶(5U/μl，Takara)0.5μl，模板DNA 5μl，灭菌ddH2O补足至50μl。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，55℃退火30sec，72℃延伸1min；94℃变性45sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相回收、克隆和测序，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。
实施例2LAMP技术检测北方根结线虫方法的建立
2.1LAMP引物设计
根据北方根结线虫ITS序列测序结果，设计并筛选下述LAMP引物和探针(如图1所示)，其中五条引物包括两条外引物(F3和B3)、两条内引物(FIP和BIP)和一条环引物(MELB)，FIP由F1c-F2组成，BIP由B1c-B2组成，F1c和B1c分别是F1和B1的互补序列。引物和探针交上海生物工程技术服务有限公司合成标记。序列如下：
①MHF3：5’-GAATATGAGGTGACATGTTAGG-3’
②MHB3：5’-TCAATGTTTCTGCAGTTCG-3’
③MHFIP：5’-TGAAAAAAATATTGCTGGCGTCCACCTTAATCGGGTTTAAG
ACT-3’
④MHBIP：5’-TCTATCCTTATCGGTGGATCACTCCACAAATTATCGCAGTT
AGCT-3’
⑤MHLB：5’-GGCTCGTGGATCCATGAAGAACG-3’
⑥MH-FITC-probe：5’-CTCGTGGATCCATGAAGAAC-3’
LFD试纸检测时，使用5′端生物素标记的MHFIP引物和5′端用FITC标记MH-FITC-Probe探针。
2.2LAMP反应体系配置：外引物MHF3和MHB3各0.2μmol/L，内引物MHFIP和MHBIP各1.6μmol/L，环引物MHLB为0.4μmol/L，10mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，5mmol/L MgSO4，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段，1μl DNA模板，用灭菌双蒸馏水补足25μl。
2.3LAMP反应扩增条件：将以上各成分加入反应管中混合后，然后置于60～65℃恒温水浴中等温扩增30～60min，再82℃保温5min。
2.4LAMP反应产物检测
LAMP反应产物的检测方法有三种：反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后观察结果(如图2A所示)；取2μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图2B所示)，可看到有LAMP的特征性梯形带；在反应产物中加入5μL FITC标记的探针，63℃保温5min，冷却到室温。取8μL的杂交液加入100μl PBS缓冲液，将LFD试纸浸入到杂交后的溶液中，观察LFD试纸上的条带变化(如图2C)。
实施例3LAMP法检测不同地理种群北方根结线虫
将本实验室采集的两种北方根结线虫进行LAMP检测，将引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，加入1μl模板DNA，按2.3反应条件进行，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(如图3A所示)，加有北方根结线虫DNA的管中能看到绿色荧光，阴性对照则为红褐色。取2μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图3B所示)，可看到1～2泳道有LAMP的特征性梯形带，阴性对照没有扩增产物。在反应产物中加入5μL FITC标记的探针，63℃保温5min，冷却到室温。取8μL的杂交液加入100μl PBS缓冲液，将LFD试纸浸入到杂交后的溶液中，观察LFD试纸上的条带变化(如图3C)，可以看到加入北方根结线虫DNA管中的LFD试纸出现测试带和控制带两条带，而阴性对照只有控制带。
实施例4北方根结线虫LAMP特异性检测
收集南方根结线虫、象耳豆根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、香蕉穿孔线虫、短体线虫、甘薯茎线虫、大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、豆伞滑刃线虫、松材线虫(见表2)，(本实验室均有保存，可以对公众发放)分别提取其DNA作为模板与北方根结线虫种群DNA模板一起进行LAMP检测，以检测北方根结线虫LAMP检测方法的特异性。
表2供试的其它植物线虫群体样品代码及来源
将上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，加入1μl模板DNA，按2.3的反应条件进行，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(如图4A所示)，第一管为北方根结线虫DNA，可以观察到绿色荧光，其他管的线虫和阴性对照均为红褐色。取2μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图4B所示)，可看到第一泳道有LAMP的特征性梯形带，其他泳道均未发现有扩增产物。结果表明上述LAMP引物和反应体系在检测北方根结线虫时具有很高的特异性。
实施例6北方根结线虫LAMP灵敏度检测
将单头北方根结线虫MHYJ种群提取的DNA模板按10倍稀释成1～1.0×10-5 6个浓度，各取1μl DNA做为模板，将上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，按2.3的反应条件进行，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(如图5A所示)，1～5管均可以看到绿色荧光。取2μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图5B所示)，可以看出1～5泳道均有LAMP的特征性梯形带，灵敏度能达到1/200000头线虫。同时以上述稀释DNA为模板，以MHF3和MHB3为引物，进行常规PCR检测，体系如下：2.5μl 10×PCRBuffer(含Mg2+)，2μl 10mMdNTP(2.5mM)，1μl引物对MHF3/MHB3(10uM)，0.25μl TaqDNA聚合酶(5U/ul)，1μl模板DNA，灭菌ddH2O补足至25μl，采用无线虫DNA模板为阴性对照。凝胶电泳观察结果(如图5C所示)。结果表明在DNA稀释到10-2倍时，能够观察到扩增条带，再次稀释时常规PCR则不能检测。
以上结果说明：上述LAMP检测体系能够检测到1/200 000头北方根结线虫。具有极高的灵敏度，比常规PCR检测灵敏100倍。
Claims (10)
1.一种北方根结线虫LAMP快速检测方法，以北方根结线虫DNA为模板，LAMP反应体系试剂中包括引物混合物、反应缓冲液和反应酶，所述引物混合物有如下引物：
①MHF3:5’-GAATATGAGGTGACATGTTAGG-3’，
②MHB3:5’-TCAATGTTTCTGCAGTTCG-3’，
③MHFIP:5’-TGAAAAAAATATTGCTGGCGTCCACCTTAATCGGGTTTAAGACT-3’，
④MHBIP:5’-TCTATCCTTATCGGTGGATCACTCCACAAATTATCGCAGTTAGCT-3’，
⑤MHLB:5’-GGCTCGTGGATCCATGAAGAACG-3’。
2.根据权利要求1所述的检测方法，所述引物混合液为：外引物MHF3和MHB3各0.2μmol/L，内引物MHFIP和MHBIP各1.6μmol/L，环引物MHLB为0.4μmol/L，所述反应缓冲液：6mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl的pH为8.8，10mmol/L KCl，5mmol/LMgS04，10mmol/L(NH4)2S04，0.1%Triton x-100；反应酶：8U Bst DNA聚合酶大片段。
3.根据权利要求1所述的检测方法，还包括观察检测结果步骤，其特征在于：在LAMP反应完的体系加入显色剂，观察显色情况。
4.根据权利要求3所述的检测方法，所述显色剂为SYBR green I。
5.根据权利要求1所述的检测方法，还包括观察检测结果步骤，其特征在于：取LAMP扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带。
6.根据权利要求1所述的检测方法，还包括观察检测结果步骤，其特征在于：引物混合物中MHFIP或MHBIP的5’端带有生物素标记，在LAMP反应产物中加入20pmol/L的FITC标记的探针，63℃保温5min，冷却到室温，取8μL的杂交液加入100μl PBS缓冲液，将LFD试纸浸入到杂交后的溶液中，通过观察LFD试纸上的条带，所述探针序列为：
MH-FITC-Probe:5’-CTCGTGGATCCATGAAGAAC-3’，MH-FITC-Probe的5’端用FITC标记。
7.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，所述LAMP反应条件：将引物混合液、反应缓冲液、反应酶混合均匀后加入1μl DNA模板后，61～65℃保温30～60min，82℃保温5min。
8.根据权利要求1所述的检测方法，所述北方根结线虫DNA的提取试剂组分配方如下：
1)WLB溶液：500mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl2，1.0mmol/L DTT，4.5%Tween20，等体积混匀，过滤灭菌；
2)蛋白酶K：20mg/mL蛋白酶K。
9.根据权利要求8所述的检测方法，所述北方根结线虫DNA的提取方法为：挑取单头根结线虫放入装有10μlddH2O的0.2mL离心管中，加入8μl的WLB溶液，2μl蛋白酶K溶液，放入液氮中，再放入37℃水浴锅中，待融化后放入液氮中，重复6～7次，然后在-80℃下冷冻30min；将离心管转移到65℃下温育90min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。
10.权利要求1-9所述任一检测方法在诊断植物、土壤的北方根结线虫感染情况或鉴别北方根结线虫中的应用。
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