CN103421894A - 苹果根结线虫的pcr检测试剂及试剂盒 - Google Patents

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顾建锋
何洁
陈先锋
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Abstract

本发明公开了苹果根结线虫的PCR检测试剂及试剂盒，包括一对特异性引物，上游引物的核苷酸序列：GGGACCGACGGCTTAGTG，下游引物的核苷酸序列：CCGTTACACGACGAGAGTC。该特异性引物对苹果根结线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为250bp，对其它根结线虫无特异性条带片段；应用本发明的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成测试，灵敏度高，实用性强。

Description

苹果根结线虫的PCR检测试剂及试剂盒
技术领域
 本发明涉及根结属线虫的检测技术，具体涉及苹果根结线虫的PCR检测试剂及试剂盒。
背景技术
根结属线虫（Meloidogyne Goeldi，1887）为植物根系专性内寄生线虫，是植物病原线虫中种类最多、分布最广、为害最严重的类群之一，具有十分重要的经济意义。我国于2007年将根结线虫（非中国种）列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。 苹果根结线虫Meloidogyne mali Itoh, Ohshima & Ichinohe, 1969为宁波口岸首次从来自日本的鸡爪槭中截获。虽然我国上世纪90年代曾报道福建漳州的柑橘及河南郑州的杨树上发现苹果根结线虫，但上述报道均未对发现的根结线虫种类进行详细、准确地描述和鉴定，况且柑橘及杨树都不是公认的苹果根结线虫寄主，其鉴定是否准确还有待证实。苹果根结线虫寄主植物主要为木本植物，包括苹果、海棠果、三叶海棠、葡萄、樱桃、日本栗、鸡爪槭、桑树、玫瑰、榆树、无花果、覆盘子、枸树等。在日本，该种线虫造成苹果产量损失可高达40％，它还是日本桑树最重要的病原线虫，可造成桑树变矮、叶片减小，严重时导致桑树死亡。我国口岸出入境检疫实验室或其他相关部门，都面临着对根结线虫进行快速、准确的鉴定这一难题。近年来，虽然在形态学鉴定的基础上，PCR－RFLP、荧光PCR、特异性PCR、序列测定、LAMP技术等已在线虫鉴定上广泛应用，但多数只能针对南方、花生、爪哇等几种常见的根结线虫进行鉴定，如公开号为CN1661108的发明专利申请，就公开了爪哇根结线虫的检测引物及检测方法。目前还未公开苹果根结线虫的分子生物学方面的检测报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异、准确的苹果根结线虫的PCR检测试剂及试剂盒。
本发明系选择参考GenBank中苹果根结线虫的核糖体ITS基因（Internal Transcribed Spacer），使用Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp）设计了特异性引物，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估（以苹果根结线虫的DNA为模板，南方根结线虫为阴性对照，水为空白对照，利用引物进行PCR检测。通过观察扩增产物的保守性和特异性，筛选最适引物），筛选得到扩增效率和特异性好的一对特异性引物。引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。
本发明的苹果根结线虫的PCR检测试剂，包括一对特异性引物，所述一对特异性引物的核苷酸序列分别为：
上游引物： 5’- GGGACCGACG GCTTAGTG-3’      
下游引物： 5’- CCGTTACACG ACGAGAGTC-3’。
    苹果根结线虫的PCR检测试剂盒，试剂盒的组成成份如下：无Mg2+的10×PCR缓冲液，浓度为25 mM的MgCl2溶液，浓度为0.1 mM的dNTP溶液，浓度5 U/μL 的Taq酶溶液，浓度都为10μM的上游引物溶液和下游引物溶液。
与现有技术相比，本发明的优点是苹果根结线虫的PCR检测试剂及试剂盒，包括一对特异性引物，上游引物的核苷酸序列：GGGACCGACG GCTTAGTG，下游引物的核苷酸序列： CCGTTACACG ACGAGAGTC。该特异性引物对苹果根结线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为250 bp，对其它根结线虫无特异性条带片段；应用本发明的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成检测，灵敏度高，实用性强。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1、苹果根结线虫的PCR检测试剂盒
100次或200次等的×50μL反应体系试剂盒，50μL反应体系组份如下：无Mg2+的10×PCR缓冲液5.0μL，浓度为25 mM的MgCl2溶液5.0μL，浓度为0.1 mM的dNTP溶液4.0μL，浓度5 U/μL 的Taq酶溶液0.6μL，浓度都为10μM的上游引物溶液和下游引物溶液各3.0μL。无Mg2+的10×PCR缓冲液，Taq酶液，dNTP液购于宝生物工程（大连）有限公司，其中上游引物溶液含有核苷酸序列为GGGACCGACG GCTTAGTG的引物，下游引物溶液含有核苷酸序列为CCGTTACACG ACGAGAGTC引物。
实施例2、DNA提取方法
挑取单条线虫放入200 μL PCR管中[已加有10 μL 双蒸水和5 μL 10×PCR缓冲液（无Mg2+）]，液氮中放置1 min （或-70度放置0.5 h）以上，取出后立即85℃加热2 min。然后向PCR管中加入1 μL 1 mg/mL蛋白酶K，56℃加热30 min以上，95℃加热10 min，得到DNA模板。
实施例3、PCR检测方法
用苹果根结线虫的PCR检测试剂盒进行检测，PCR反应体系为：无Mg2+的10×PCR缓冲液5.0μL，浓度为25 mM的MgCl2溶液5.0μL，浓度为0.1 mM的dNTP溶液4.0μL，浓度5 U/μL 的Taq酶溶液0.6μL，浓度都为10μM的上游引物溶液和上游引物溶液各3.0μL，DNA模板1.0～5.0μL，ddH2O补齐50μL。PCR反应条件：94℃ 4 min；94℃ 40 sec，52℃ 1 min，72℃ 1.5 min，36个循环；72℃ 8 min。电泳：将5 μL PCR产物用1.0％（重量/体积）琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像，出现特异性片段大小为250 bp，则为苹果根结线虫。
实施例4、苹果根结线虫的特异性和敏感性试验
用实施例2的提取方法，实施例3的PCR检测方法，分别对苹果根结线虫（采自日本进口的鸡爪槭）、山茶根结线虫（采自日本进口的山茶）、爪哇根结线虫（采自福建福州的烟草）、南方根结线虫（采自云南路南县的烟草）、花生根结线虫（采自江苏徐州产的番茄）、北方根结线虫（采自山东菏泽产的牡丹）、象耳豆根结线虫（采自海南儋州产的番石榴）和西班牙根结线虫（采自海南儋州产的番木瓜）进行检测，只有苹果根结线虫能进行有效扩增，出现条带，且其特异性片段大小为250 bp，说明本发明一对引物具有很好的特异性。对苹果根结线虫的DNA模板进行100、10﹣1、10﹣2、10﹣3、10﹣4、10﹣5、10﹣6稀释再PCR检测，结果显示PCR检测限为原液稀释10-1倍。
<110>宁波检验检疫科学技术研究院
          
<120>苹果根结线虫的PCR检测试剂及试剂盒
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
 
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据苹果根结线虫的核糖体ITS基因设计的特异性引物
 
<400> 1
GGGACCGACG GCTTAGTG  18
 
<210>2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据苹果根结线虫的核糖体ITS基因设计的特异性引物
 
<400>2
CCGTTACACG ACGAGAGTC       19   
 

Claims (2)

1.苹果根结线虫的PCR检测试剂，包括一对特异性引物，其特征在于一对特异性引物的核苷酸序列分别为：
上游引物：GGGACCGACG GCTTAGTG  
下游引物：CCGTTACACG ACGAGAGTC。
2.权利要求1所述的苹果根结线虫的PCR检测试剂组成的检测试剂盒，其特征在于试剂盒的组成成份为：无Mg2+的10×PCR缓冲液，浓度为25 mM的MgCl2溶液，浓度为0.1 mM的dNTP溶液，浓度5 U/μL 的Taq酶溶液，浓度都为10μM的上游引物溶液和下游引物溶液。
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