CN1865937A - 同时检测a、b型流感病毒的实时荧光定量检测方法及试剂盒 - Google Patents

同时检测a、b型流感病毒的实时荧光定量检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测A型和B型流感病毒的实时荧光定量检测方法及试剂盒,针对A型、B型流感病毒保守序列的引物及相应探针不同DNA序列,分别建立和优化包括引物、探针、酶、寡聚核苷酸和镁离子的A型、B型定量反应体系和反应条件,检测并建立标准曲线,试剂盒包括:RT-PCR反应缓冲液、Taq酶、RT-PCR酶、RT-PCR酶稀释液、DEPC水、阳性对照、阴性对照。解决了双重荧光定量PCR检测体系等问题,具有操作简单、可定量、污染少、检测速度快等优点,可同时检测A、B型流感病毒,检出病毒的最小量达10-5TCID50,可广泛用于医学和农业等领域。

Description

同时检测A、B型流感病毒的实时荧光 定量检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测方法及其试剂盒,更具体地说,涉及一种同时检测A型和B型流感病毒的实时荧光定量检测方法及其检测试剂盒。
背景技术
众所周知,禽流感病毒(AIV)是由A型流感病毒引起的家禽和野禽的一种烈性传染病,给养禽业造成巨大损失,我国农业部和国际兽医局都将其定为A类传染病。禽流感其病理变化因感染病毒毒株毒力的强弱、病程长短和禽种的不同而不同。其临床症状因感染禽的种类、年龄、性别、并发感染情况及所感染毒株的毒力和其他环境等不同而表现出的症状很不一致。自1878年禽流感在意大利爆发和流行到如今已有100多年的历史。禽流感已成为具有重要公共卫生意义的传染病,该病不仅具有发生突然、传播迅速、发病率高、致死率高等特点,而且禽流感病毒是几乎所有A型流感病毒的基因库,其自然宿主的广泛性及遗传变异给禽流感的及时定性诊断和预防带来很大困难。由于候鸟的迁徙和国际间禽类贸易的日益频繁,使得该病呈全球性分布,给养禽业造成巨大的经济损失。以往认为禽流感病毒对人群无致病力,但1997年“香港H5禽流感、2000年H9、2003年荷兰H7至2004年亚洲的H5均发生感染人,甚至导致人员死亡,死亡率约30%左右。其危害性比2003年的SARS还大、还难于预料。在现有技术中,长期以来禽流感的诊断一直依赖于病原的分离和鉴定。近年来相继建立的禽流感琼脂扩散(AGP)、血凝抑制试验(HI)、神经氨酸酶抑制试验(NI)、间接酶联免疫吸附试验(ELAISA)等血清学诊断技术及分子诊断技术(RT-PCR),已经远远满足不了我国禽流感及呼吸道疾病的流行病学监测及现场诊断与防制的迫切需要。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,是集PCR扩增技术、探针杂交技术和荧光共振能量转移光谱技术于一体的新兴技术,该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,是目前国际上用在病毒检测上最先进的检测方法之一,具有普通的PCR扩增技术无法比拟的优点:1、特异性高:因为只有当探针与待测模板匹配时Taq酶才会启动其5’-3’端的外切酶活性,将探针上的荧光基团切割下来而产生荧光强度的增长,因此荧光定量PCR技术克服了普通PCR由于非特异性扩增而导致的假阳性问题;2、敏感度高:荧光PCR技术可检出极低拷贝数的核酸,使真正意义上的早期诊断成为现实;3、高通量、高效率:1~2小时可全自动同步完成近百个样品的扩增及检测,且结果重现性好;4、无须凝胶电泳,采用全封闭反应管及光电传导系统,无管道内污染。该方法可对DNA和RNA的PCR产物进行定量分析。
近几年欧美、日本一些国家也进行RT-PCR和多重荧光定量PCR的研究。国内未见多重荧光定量PCR检测流感病毒文献报道。目前国内常用的快速检测方法为传统PCR或半巢式-MPCR。上述方法存在一定的缺陷,如传统PCR或半巢式-MPCR技术易出现假阳性、交叉污染、操作步骤多和费时。而双重荧光定量PCR具有的操作简单、可定量、污染少、检测速度快,同时检测A、B型流感病毒。检出病毒的最小量为10-5TCID50等优点越来越受学者的认同和研究。“双重荧光定量PCR快速检测流感人(禽)病毒和准确分型”,这一研究不仅在国内属于首次,而且在国际上也属于先进水平。在我国流感快速诊断研究方面仍停留在传统PCR或半巢式-MPCR技术中,这与我国作为流感多发地来说是极不相称,因此,研究开发双重荧光定量PCR检测流感病毒技术,为使我国的流感病毒快速诊断技术尽快的与国际接轨,适应当今快速前进社会的发展,确保人们的生命安全和国家的利益具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简便、污染少、检测速度快,并可同时检测A型和B型流感病毒的实时荧光定量检测方法及试剂盒。
为了达到上述目的,本发明提供了如下的技术方案:采用一种同时检测A型和B型流感病毒的实时荧光定量检测方法,过程包括合成引物和荧光探针,和使用所述的引物、探针及其它聚合酶链式反应成份组成荧光聚合酶链式反应体系,从待测标本中提取DNA或提取RNA,加入前述的反应体系中,经混合后进行RT-PCR扩增和荧光信号测定,本发明的具体方法为:
(1)针对A型、B型流感病毒保守序列的引物及相应探针,具备如下DNA序列:
A型上游引物:5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC,
下游引物:5’CTACGCRGCAGTCCTCGCTC,
TaqMan探针:5’FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1;
B型上游引物:5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA,
下游引物:5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA,
TaqMan探针:5’CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2;
(2)建立和优化包括引物、探针、酶、寡聚核苷酸和镁离子的A型、B型定量反应体系和反应条件:(2-1)建立具有如下组分浓度的50μl反应体系:10倍反应缓冲液5μl,镁离子5mM,寡聚核苷酸4mM,RNA酶抑制剂40U,反转录酶25U,Taq酶5U,A型上、下游引物各0.5mM,B型上、下游引物各0.5mM,A型探针250nM,B型探针200nM,A、B型模板RNA各10μl;(2-2)确立如下的反应条件:48℃30分钟→95℃10分钟→95℃15秒→60℃1分钟,其中95℃15秒→60℃1分钟之间进行45次循环;选择荧光定量PCR仪上FAM和CY5双色荧光通道进行检测;(2-3)建立标准曲线:取流感A、B病毒培养液抽提RNA,然后将RNA进行10倍梯度稀释,最高稀释度为10-6,各浓度梯度RNA同时进行荧光反应,计算并汇出标准曲线。
本发明还提供同时检测A型和B型流感病毒方法的试剂盒,其中用于100次试验的试剂盒的构成为:RT-PCR反应缓冲液1.6ml,Taq酶(5U/μl)50μl,RT-PCR酶(200U/μl)10μl,RT-PCR酶稀释液10μl,二乙基焦碳酸酯水1ml,阳性对照1ml,阴性对照1ml。试剂盒中的RT-PCR酶溶液是使用时用RT-PCR酶稀释液稀释8倍的现配溶液或稀释后在-20℃下保存一周内的酶溶液。换句话说,RT-PCR酶(200U/μl)使用时,请用RT-PCR酶稀释液稀释成25U/μl(8倍稀释)后使用。尽量保证现配现用,用多少配多少,稀释后的酶溶液在-20℃下保存时不要超过一周。
本发明所述的试剂盒,是经包装并在-20℃或以下保存期为一年或以内的试剂盒。换句话说,所述试剂盒的保存期为不超过一年,并应经包装后保存。
本发明试剂盒中的二乙基焦碳酸酯水,也即焦碳酸二乙酯水或DEPC水,采用行业内通用的DEPC水,是用DEPC处理过的水。
与现有技术相比,本发明具有以下明显的优点:1、双重荧光定量PCR具有操作简单、可定量、污染少、检测速度快,同时检测A、B型流感病毒,检出病毒的最小量达10-5TCID50。2、技术效果好:建立“多重荧光定量RT-PCR技术快速检测A型、B型流感病毒”的检测试剂盒,可在3-4小时内从被检测标本中,快速、准确、特异、安全、简便的鉴定出流感病毒的A型、B型,检出病毒的最小量为分别为2.56×10-5,5.0×10-5个TCID50,可定量分析,比巢式RT-PCR灵敏度高、灵敏,而且不容易污染,而传统PCR或半巢式-MPCR检出病毒的最小量为0.01-0.1TCID50。3、适用范围广:可适用于各种呼吸道病毒疾病及流感、禽流感的检测和鉴别,同时也可检测被禽流感病毒污染,而病毒含量级少,一般方法不容易检测到的禽类产品和半成品。
附图说明
以下是本发明的附图说明:
图1是A、B型流感病毒双重荧光RT-PCR灵敏度检测图;
图2是A、B型流感病毒双重荧光RT-PCR十倍稀释标准曲线图。
参照图1,根据流感毒株A,B TCID50法的滴定结果,分别取2.56个和5.0个TICD50的病毒RNA,分别十倍梯度稀释,最大稀释度分别为2.56×10-6,5.0×10-6,将相同稀释度A、B病毒RNA混合加入同一个双重反应体系管中,荧光RT-PCR反应结果见图1,图中可以看出A型曲线的荧光值较B型的要高,这是由于荧光基团FAM与CY5本身的差异所造成的;相同稀释度A、B病毒的CT值很接近,提示虽然A、B流感病毒的TCID50值不同,但其病毒拷贝数是很接近的,这反应了A、B流感病毒的致病能力是有一定差异的,双重反应体系中A、B病毒10-6浓度组均成阴性,较单一荧光反应减少了一个数量级,原因是反应体系增加,使得病毒RNA的相对浓度下降的缘故。
参照图2,分别以A型、B型流感病毒的TCID50浓度为横坐标,以各自RT-PCT循环的CT值为纵坐标作图,可以得到双重荧光RT-PCR反应对A型、B型病毒进行相对定量的两条标准曲线,见图2。其中A型标准曲线的斜率为-3.024,扩增效率为114.1%,相关系数为0.997,几项参数与A型单一荧光反应均很接近,说明此双重反应检测体系对A型流感病毒的检测无明显影响;B型标准曲线的斜率为-3.149,扩增效率为107.8%,相关系数为0.998,几项参数与B型单一荧光反应也都很接近,说明此双重反应检测体系对B型流感病毒的检测也无明显影响。
具体实施方式
以下通过具体的实施方式对本发明进行更加详细的描述:
A、原理概述:在荧光定量RT-PCR的扩增反应体系中,同时加入分别与A型、B型流感病毒匹配的两对引物及两条特异性的TaqMan探针。两条探针的两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团,其中两个报告基团的激发和发射波长不同。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;RT-PCR扩增时,Taq聚合酶的5′→3′外切酶活性将结合于模板上的探针酶切降解,使报告基团和淬灭基团分离,从而产生荧光信号,根据针对A型、B型流感病毒荧光探针所发出的不同波长的荧光信号就可以从未知样本中判断出流感病毒的类型。当荧光信号累积达到仪器设置的检测阈值时,对应的RT-PCR扩增的循环数CT与对应的病毒模板数之间成线性关系,可对病毒进行定量分析。
B、实施详情:
1、材料:
A型、B型流感病毒由本实验室培养保存;RNA提取试剂盒购自ROCHE公司;引物及TaqMan探针均由上海博亚公司合成;荧光定量PCR仪是Stratagene公司的MX4000型。
2、方法:
2.1利用Primer Express软件分别设计针对A型、B型流感病毒保守序列的引物及其相应TaqMan探针。具体DNA序列如下:(1)针对A型、B型流感病毒保守序列的引物及相应探针,具备如下DNA序列:
A型上游引物:5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC,
下游引物:5’CTACGCRGCAGTCCTCGCTC,
TaqMan探针:5’FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1,
扩增片段大小154bp;
B型上游引物:5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA,
下游引物:5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA,
TaqMan探针:5’CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2,
扩增片段大小170bp;
2.2取A型、B型流感病毒培养液各200μl,用ROCHE公司的RNA提取试剂盒分别提取总RNA,用50μl溶解缓冲液溶解。
2.3检测试剂盒50μl反应体系包括:
10倍反应缓冲液5μl,镁离子5mM,寡聚核苷酸4mM,RNA酶抑制剂40U,反转录酶25U,Taq酶5U,A型上、下游引物各0.5mM,B型上、下游引物各0.5mM,A型探针250nM,B型探针200nM,A、B型模板RNA各10μl。
2.4反应条件:
先48℃30分钟;再95℃10分钟;最后95℃15秒,60℃1分钟,循环45次,然后选择荧光定量PCR仪上FAM和CY5双色荧光通道进行检测。
2.5灵敏度分析及标准曲线的建立:
取适当滴度的流感A、B病毒培养液抽提RNA,然后将RNA进行10倍梯度稀释,最高稀释度为10-6。各浓度梯度RNA同时进行荧光RT-PCR反应,由荧光定量PCR仪计算出标准曲线。
2.6检验试剂盒的研发及推广:将反应体系中相应的引物、探针、酶、寡聚核苷酸、镁离子等分别按比例进行混合及包装,并在相关机构进行中试及推广。
3、结果:
3.1A型、B型流感病毒双重荧光RT-PCR检测灵敏度
根据流感毒株A,B TCID50法的滴定结果,分别取2.56个和5.0个TICD50的病毒RNA,分别十倍梯度稀释,最大稀释度分别为2.56×10-6,5.0×10-6。将相同稀释度A、B病毒RNA混合加入同一个双重反应体系管中,荧光RT-PCR反应结果见图1,图中可以看出A型曲线的荧光值较B型的要高,这可能是由于荧光基团FAM与CY5本身的差异所造成的;相同稀释度A、B病毒的CT值很接近,提示虽然A、B流感病毒的TCID50值不同,但其病毒拷贝数是很接近的,这反应了A、B流感病毒的致病能力是有一定差异的;相同稀释度A、B病毒的CT值很接近,提示虽然A、B流感病毒的TCID50值不同,但其病毒拷贝数是很接近的,这反应了A、B流感病毒的致病能力是有一定差异的;双重反应体系中A、B病毒10-6浓度组均成阴性,较单一荧光反应减少了一个数量级,原因可能是反应体系增加,使得病毒RNA的相对浓度下降的缘故。
3.2A型、B型流感病毒双重荧光RT-PCR检测标准曲线
分别以A型、B型流感病毒的TCID50浓度为横坐标,以各自RT-PCT循环的CT值为纵坐标作图,可以得到双重荧光RT-PCR反应对A型、B型病毒进行相对定量的两条标准曲线,见图2。其中A型标准曲线的斜率为-3.024,扩增效率为114.1%,相关系数为0.997,几项参数与A型单一荧光反应均很接近,说明此双重反应检测体系对A型流感病毒的检测无明显影响;B型标准曲线的斜率为-3.149,扩增效率为107.8%,相关系数为0.998,几项参数与B型单一荧光反应也都很接近,说明此双重反应检测体系对B型流感病毒的检测也无明显影响。
3.3本发明试剂盒的构成见下表:
  组分(100次试验/盒)   规格
  RT-PCR反应缓冲液   1.6ml
  Taq酶(5U/μl)   50μl
  RT-PCR酶(200U/μl)*   10μl
  RT-PCR酶稀释液   100μl
  二乙基焦碳酸酯水   1ml
  阳性对照   1ml
  阴性对照   1ml
  操作说明书   1本
                       核甘酸序列表
<110>程小雯
<120>同时检测A型和B型流感病毒的实时荧光定量检测方法及试剂盒
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
CAGAGACTTG AAGATGTTTT TGC    23
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
CTACGCRGCA GTCCTCGCTC    20
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>3
FAM-CAAGACCAAT CCTGTCACCT CTGA-BHQ1    31
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>4
AAATACGGTG GATTAAATAA AAGCAA    26
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>5
CCAGCAATAG CTCCGAAGAA A    21
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>6
CY5-CACCCATATT GGGCAATTTC TATGGC-BHQ2    33

Claims (3)

1、一种同时检测A型和B型流感病毒的实时荧光定量检测方法,过程包括合成引物和荧光探针,和使用所述的引物、探针组成荧光聚合酶链式反应体系,从待测标本中提取DNA或提取RNA,加入前述的反应体系中,经混合后进行RT-PCR扩增和荧光信号测定,其特征在于:
(1)针对A型、B型流感病毒保守序列的引物及相应探针,具备如下DNA序列:
A型上游引物:5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC,
下游引物:5’CTACGCRGCAGTCCTCGCTC,
TaqMan探针:5’FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1;
B型上游引物:5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA,
下游引物:5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA,
TaqMan探针:5’CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2;
(2)建立和优化包括引物、探针、酶、寡聚核苷酸和镁离子的A型、B型定量反应体系和反应条件:
(2-1)建立具有如下组分浓度的50μl反应体系:
10倍反应缓冲液5μl,镁离子5mM,寡聚核苷酸4mM,RNA酶抑制剂40U,反转录酶25U,Taq酶5U,A型上、下游引物各0.5mM,B型上、下游引物各0.5mM,A型探针250nM,B型探针200nM,A、B型模板RNA各10μl;
(2-2)确立如下的反应条件:
先48℃30分钟;再95℃10分钟;最后95℃15秒,60℃1分钟,循环45次,然后选择荧光定量PCR仪上FAM和CY5双色荧光通道进行检测;
(2-3)建立标准曲线:
取流感A、B病毒培养液抽提RNA,然后将RNA进行10倍梯度稀释,最高稀释度为10-6,各浓度梯度RNA同时进行荧光反应,计算并汇出标准曲线。
2、采用权利要求1所述方法的试剂盒,其特征在于:用于100次试验的该试剂盒的构成为:
RT-PCR反应缓冲液               1.6ml
Taq酶(5U/μl)                  50μl
RT-PCR酶(200U/μl)             10μl
RT-PCR酶稀释液                 10μl
二乙基焦碳酸酯水               1ml
阳性对照                       1ml
阴性对照                       1ml。
3、根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒是经包装并在-20℃或以下保存期不超过一年的试剂盒。
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