CN103382507B - 1型和3型鸭甲肝病毒一步法双重rt-pcr检测试剂盒、引物对及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的是1型和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测试剂盒、引物对及方法，引物对1由引物1和引物2组成，用于检测1型鸭甲肝病毒，它们的核苷酸序列分别依次为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的单链DNA；引物对2由引物3和引物4组成，用于检测3型鸭甲肝病毒，它们的核苷酸序列分别依次为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的单链DNA。一次RT-PCR反应就能同时检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒两种病原体的检测技术，避免了常规PCR的重复检测，具有低成本、高效率等优点，而且在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitisvirus,DHV)感染雏鸭引起的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害四周龄以内的雏鸭，具有发病急，传播迅速，病程短和死亡率高等特点；临床主要表现为雏鸭死前发生痉挛，头向背部后仰，呈“角弓反张”，病理变化主要为剖检可见肝脏肿大发炎和大量的出血性斑点，是危害养鸭业的主要疾病之一。目前世界上主要养鸭地区均有本病的存在，具有间歇爆发、地方流行性等特点，主要由属于小RNA病毒科禽肝病毒属的1型鸭肝炎病毒（DHV-1）引起。
1型鸭肝炎病毒（DHV-1），现重新命名为鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitisA virus，DHAV），目前被分为三种基因型（即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3）。目前我国主要流行的鸭肝炎病毒是1型鸭甲肝病毒（DHAV-1）和3型鸭甲肝病毒（DHAV-3），这两种病毒导致的临床症状和病理变化非常相似，但是不具有血清学相关性，对其的传统检测方法包括血清中和试验、琼脂扩散试验和ELISA等，但这些检测方法存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性，在临床上常常会因为不能对其及时做出正确的诊断和有效防制而造成巨大的经济损失。
PCR技术由于具有敏感性高、特异性好、快速、简便等特点，己经广泛应用于各种禽病病原体的检测，包括用于鸭肝炎病毒的检测。但常规PCR技术一次只能检测一种病原物，如果反应体系中含有两种以上的病原物，则需进行多次PCR，不但操作复杂，而且费用较高。多重PCR(Multiplex PCR)技术通过在同一反应管内同时加入多对引物，扩增完成后可同时检测出多种目的核酸片段，满足同时分析不同基因序列的需要，它具有高效快捷、高度特异敏感、降低实验成本、加速实验进程等优点，更适合在临床中应用。一步法RT-PCR即逆转录和PCR在一个共同的体系中进行，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖，有助于减少残余污染，简化了实验操作步骤，所以一步法RT-PCR在处理大量样品时具有明显的优势；而且一步法RT-PCR逆转录所得的cDNA全部用于PCR扩增，故可以得到更高的灵敏度，基于以上特点，一步法双重RT-PCR在临床检测应用中将有显著的优势。
目前已有1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的单一RT-PCR分子检测技术和两步法多重RT-PCR检测技术，但尚未见1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测技术的报道。同时由于鸭甲肝病毒所属的小RNA病毒极易发生基因突变与重组，通过BLAST验证发现已有的检测技术中所提供的检测引物不具有广泛的适用性，不能对众多的1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒毒株进行准确的诊断与分析。本试剂盒中使用的引物通过在1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒基因的相对保守区域设计获得，已通过BLAST验证对比发现其具有更广泛的适用性，同时引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用，同时由于使用该检测试剂盒可以获得包含了1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的全部VP1基因区域的片段，而通过分析1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒VP1基因序列可以对相应病毒进行血清型分析以及相关的抗原性分析，适用于疫源追踪和分子流行病学调查。该检测试剂盒将有利于调查清楚不同地区的鸭肝炎病毒流行情况，从而进行有效的防控，同时也有利于对禽类疾病及时做出正确的诊断，有效治疗和控制而避免造成巨大的经济损失。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能够检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的两个引物对，它们能够分别扩增出包含了1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒完整VP1基因区域的片段。
检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的两个引物对，引物对1由引物1和引物2组成，用于检测1型鸭甲肝病毒，它们的核苷酸序列分别依次为序列表中序列1和序列2所示的单链DNA；引物对2由引物3和引物4组成，用于检测3型鸭甲肝病毒，它们的核苷酸序列分别依次为序列表中序列3和序列4所示的单链DNA；引物对1扩增出的目的片段大小为992bp，引物对2扩增出的目的片段大小为1533bp。
上述引物组中，所述引物1、引物2、引物3和引物4的摩尔比可为1:1:(1-2.5):(1-2.5)，所述引物1、引物2、引物3和引物4的摩尔比具体为1:1:2:2。
本发明的另一目的是提供一种快速、特异性和灵敏度高的1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测试剂盒。在本试剂盒中包括彼此独立分装的以下各组分（100次量）：
1.PrimeScript1Step Enzyme Mix 100μl；
2.2×1Step Buffer 625μl×2；
3.引物1 （5μM）*100μl；
4.引物2 （5μM）*100μl；
5.引物3 （10μM）*125μl；
6.引物4 （10μM）*125μl；
7.阳性对照 （30ng/ul）20μl；
8.RNase Free dH2O 625μl×2；
其中PrimeScript1Step Enzyme Mix由RTase、TaKaRa Ex HS、RNase Inhibitor以及One Step RT-PCR用稳定剂配制，2×1 Step Buffer由Buffer、dNTP以及One Step Enhancer Solution配制，具体配比参照宝生物工程（大连）有限公司的One Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)。
该试剂盒基于1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒多重PCR检测用引物组。引物1在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.2umol/L；引物2在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.2umol/L；引物3在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.4umol/L；引物4在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.4umol/L；RT-PCR的反应条件为50℃反转录30分钟，94℃变性2分钟；然后进入变性94℃30秒，45℃梯度退火20秒，每循环一次升高2℃，72℃延伸2分钟的循环，共进行8个循环；然后进入变性94℃30秒，55℃退火20秒，72℃延伸2分钟的循环，共进行25个循环；最后再经72℃延伸10分钟后，于4℃结束反应。
另外本发明双重RT-PCR检测试剂盒的组分含有空白对照和阳性对照；其中，所述的空白对照是RNase Free dH20；所述的阳性对照是含有1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒RNA的混合溶液；本发明中的RT-PCR检测试剂盒中的各种组分都可从商业途径购买得到，所用到的引物都可通过专业公司合成得到。
本发明公开了一种检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的引物组、试剂盒及其检测方法。本发明所提供的引物组由序列1、序列2、序列3和序列4分别所示的四条单链DNA组成。本发明建立一次RT-PCR反应就能同时检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒两种病原体的检测技术，避免了常规PCR的重复检测，具有低成本、高效率等优点，而且在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用。
附图说明
图1为一步法双重RT-PCR的优化结果；
图2为一步法双重RT-PCR检测DHAV-1的灵敏性实验结果；
图3为一步法双重RT-PCR检测DHAV-3的灵敏性实验结果；
图4为一步法双重RT-PCR检测病毒的特异性结果；
图5为一步法双重RT-PCR检测细菌的特异性结果；
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的材料和试剂具体如下：
病毒株：
1型鸭甲肝病毒：鸭病毒性肝炎CH60弱毒株（CH60株在中国专利201310011872.3中已公布，公开日2013年5月15日）。
3型鸭甲肝病毒：CH-1株，本实验室分离得到并已于2013年3月25日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：V201305，分类命名：禽肝病毒属小RNA病毒科3型鸭甲肝病毒Duck HepatitisA Virus type3，DHAV-3。
番鸭细小病毒（MDPV）（购买，保藏编号为：CVCC AV238）
鸭瘟病毒：鸭瘟病毒CH virulent株(DPV CHv)，简称CHv株（在中国专利201210116719.2中已公布，公开日2012年8月22日）。
传染性喉气管炎病毒（ILTV）（购买，保藏编号为：ATCC VR-783）
马立克氏病毒（MDV）（购买，保藏编号为：ATCC VR-585）
菌株：
鸭疫里默氏菌(RA)（购买，保藏编号为：ATCC11845）
巴氏杆菌(PM)PM966
金黄色葡萄球菌（购买，保藏编号为：ATCC6538）
鸭大肠杆菌（E.coli）（购买，保藏编号为：CVCC83003）
鸭沙门氏菌(Sa1．A)（购买，保藏编号为：CMCC50083）
试剂及仪器：
TRNzol总RNA提取试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；One Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)与DL2,000DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司。核酸蛋白检测仪（Bio Rad,Smartspec3000）、梯度PCR仪（Biometra,Tgradient）、电泳仪（Bio Rad,Powerpac300）和凝胶成像系统（Bio Rad Versa DocModel2000）。
实施例1、引物的设计与合成
根据GenBank中1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的全基因组序列，应用Primer Premier5.0软件在其相对保守区域设计引物；设计的两对特异性引物(表1)由上海Invitrogen公司合成。
表1鉴定DHAV-1和DHAV-3的引物序列
实施例2、一步法双重RT-PCR检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒
一、待测样品的制备
参照TRNzol总RNA提取试剂的使用说明书操作，分别抽提1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的RNA，番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、马立克氏病毒、鸭疫里默氏菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌的DNA，并使用核酸蛋白检测仪（Bio Rad,Smartspec3000）测定它们的核酸浓度和纯度后，-70℃保存备用。
二、一步法双重RT-PCR反应的建立
使用One Step RT-PCR试剂盒进行一步法双重RT-PCR，通过对反应液中引物对1、引物对2的使用量及双重RT-PCR的退火温度、时间以及循环次数等的优化，最后确定双重RT-PCR中最佳引物浓度：引物1在反应液中的终浓度具体为0.2umol/L；引物2在反应液中的终浓度具体为0.2umol/L；引物3在反应液中的终浓度具体为0.4umol/L；引物4在反应液中的终浓度具体为0.4umol/L。
表2RT-PCR反应体系(25ul)：
| PrimeScript1 Step Enzyme Mix | 1ul |
| 2×1Step Buffer（Dye Plus） | 12.5ul |
| 引物1（5uM） | 1ul |
| 引物2（5uM） | 1ul |
| 引物3（10uM） | 1ul |
| 引物4（10uM） | 1ul |
| 模板 | 4ul |
| dH2O | 3.5ul |
模板分别为含有1型鸭甲肝病毒RNA、3型鸭甲肝病毒RNA以及1型与3型鸭甲肝病毒RNA的溶液共4ul(体积比是1:1)作为混合模板。
一步法双重RT-PCR的最佳反应模式为50℃反转录30分钟，94℃变性2分钟；然后进入变性94℃30秒，45℃梯度退火20秒，每循环一次升高2℃，72℃延伸2分钟的循环，共进行8个循环；然后进入变性94℃30秒，55℃退火20秒，72℃延伸2分钟的循环，共进行25个循环；最后再经72℃延伸10分钟后，于4℃结束反应。
按照表2在PCR反应管中配制RT-PCR反应液25ul，高速离心10s后，将反应管放入梯度PCR仪（Biometra,Tgradient）中，按照最佳反应模式设定的程序开始工作。
反应结束后，取扩增产物5ul在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，然后利用凝胶成像系统（Bio Rad Versa Doc Model2000）扫描进行初步鉴定，结果见图1，其中：M为DL2,000DNA Marker；1为仅使用含有3型鸭甲肝病毒RNA模板，扩增得到大小约为1500bp的条带；2为仅使用含有1型鸭甲肝病毒RNA模板，扩增得到大小约为1000bp的条带；3为使用含有1型与3型鸭甲肝病毒RNA模板，扩增得到大小约为1000bp与1500bp的条带，与实验设计大小相符。
三、引物的敏感性试验
将步骤一中制备得到的1型鸭甲肝病毒RNA（3.8ng/ul）和3型鸭甲肝病毒RNA（34ng/ul）溶液，分别用移液器取2ul到不同PCR反应管中，分别进行6个10倍比梯度稀释，然后按照步骤二中得到的优化后的反应条件进行扩增，检测其敏感性。
反应结束后，取扩增产物5ul在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，然后利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定，最后将RT-PCR反应液送至大连宝生物工程有限公司测序后对测序结果进行Blast比对分析。
琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，M为DL2,000DNA Marker，1-6号泳道分别为使用7.2×10-1-7.2×10-6ng1型鸭甲肝病毒RNA模板的实验结果，该双重RT-PCR最低能检出0.72pg1型鸭甲肝病毒RNA；如图3所示，M为DL2,000DNA Marker，1-6号泳道分别为使用6.8-6.8×10-5ng3型鸭甲肝病毒RNA模板的实验结果，该双重RT-PCR最低能检出6.8pg3型鸭甲肝病毒RNA；最低检测线以上各浓度的模板中1型鸭甲肝病毒均扩增得到大小约为1000bp的条带，3型鸭甲肝病毒均扩增得到大小约为1500bp的条带，与实验设计大小相符，且测序结果进一步证实PCR产物的核酸序列与引物设计模板的基因对应片段的同源性一致，它们是1型和3型鸭甲肝病毒RT-PCR的扩增产物，以上结果表明利用试剂盒检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒具有较高的灵敏度。
四、双重RT-PCR的特异性试验
按照步骤一中得到的优化后的PCR反应体系与条件进行扩增，不同的是模板分别如下：番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、马立克氏病毒、鸭疫里默氏菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌的DNA；阴性对照为水。
反应结束后，取扩增产物5μL在15g/L的琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。
琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示：Y为未加入模板的阴性对照，M为DL2,000DNA Marker，1-6号泳道分别为以1型和3型鸭甲肝病毒RNA、水、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒和马立克氏病毒的DNA为模板的实验结果；如图5所示，M为DL2,000DNA Marker，1-6号泳道分别为以1型和3型鸭甲肝病毒RNA、鸭疫里默氏菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌的DNA为模板的实验结果。含有1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒RNA混合液模板的样品能扩增出与试验设计大小相符的扩增条带，而其它对照病原体在相同位置却无任何扩增条带。测序结果进一步证实了1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR扩增产物与实验设计大小相符，利用该双重RT-PCR检测具有较强的特异性。
以上三个实验证明本发明所提供的引物组、试剂盒与检测方法可应用于鉴定待测样本是否含1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒：若得到992bp的片段，则表示检测样本中含有1型鸭甲肝病毒；若得到1533bp的片段，则可表明检测样本中含有3型鸭甲肝病毒。
实施例3、双重PCR检测待测样本
一、样品的制备
将采集的20份（编号为1-20）疑似鸭甲肝病毒感染鸭病料（肝脏）磨成悬液，反复冻融3次后高速离心，然后取上清液接种于11日龄的无特异病原体健康鸭胚尿囊腔内，20枚/株，收集24-120h内死亡胚体的尿囊液，得到20份待测样品。
二、双重RT-PCR检测
1、模板的制备：按照实施例2的步骤一抽提出20份待测样品中的总RNA。具体参照TRNzol总RNA提取试剂的使用说明书操作，并使用核酸蛋白检测仪（Bio Rad,Smartspec3000）测定其核酸浓度和纯度后，-70℃保存备用。
2、双重RT-PCR检测：按照实施例2的表2在PCR反应管中配制RT-PCR反应液25ul。
高速离心10s后，将反应管放入梯度PCR仪（Biometra,Tgradient）中，按照实施例2的步骤二中得到的优化后的RT-PCR反应条件进行扩增：50℃反转录30分钟，94℃变性2分钟；然后进入变性94℃30秒，45℃梯度退火20秒，每循环一次升高2℃，72℃延伸2分钟的循环，共进行8个循环；然后进入变性94℃30秒，55℃退火20秒，72℃延伸2分钟的循环，共进行25个循环；最后再经72℃延伸10分钟后，于4℃结束反应。
反应结束后，取扩增产物5ul在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，然后利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。
若得到992bp的片段，则待测样本中含有1型鸭甲肝病毒，反之则没有；
若得到1533bp的片段，则待测样本中含有3型鸭甲肝病毒，反之则没有；
若得到992bp与1533bp的片段，则待测样本中含有1型与3型鸭甲肝病毒，反之则没有。
最后将RT-PCR反应液送至上海Invitrogen公司测序，对测序结果进行Blast比对分析。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，20份待测样品中检出1型鸭甲肝病毒16份(目的条带约为1000bp，阳性率为80%)，检出3型鸭甲肝病毒5份(目的条带约为1500bp，阳性率为25%)。其中，1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒混合感染1份(目的条带分别约为1000bp和1500bp，阳性率为5%)。RT-PCR产物经测序分析后同源性在96%-99%之间，进一步证实了上述结果的准确性，即使用该试剂盒进行一步法双重RT-PCR扩增得到的产物为1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的特异性片段，测序结果包括了它们的全部VP1基因区域，通过该实施事例3证明了该试剂盒将可用于调查清楚不同地区的鸭肝炎病毒流行情况，进行疫源追踪从而对其进行有效的防控，同时也有可对禽类疾病及时做出正确的诊断，有效治疗和控制，从而避免造成巨大的经济损失。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (3)
1.能够检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的两个引物对，其特征在于，引物对1由引物1和引物2组成，用于检测1型鸭甲肝病毒，它们的核苷酸序列分别依次为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的单链DNA；引物对2由引物3和引物4组成，用于检测3型鸭甲肝病毒，它们的核苷酸序列分别依次为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的单链DNA。
2.1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，在本试剂盒中包括彼此独立分装的以下各组分：
其中PrimeScript 1 Step Enzyme Mix由RTase、HS、RNase Inhibitor以及One Step RT-PCR用稳定剂配制，2×1Step Buffer由Buffer、dNTP以及One Step Enhancer Solution配制，具体配比参照宝生物工程(大连)有限公司的One Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)，上述剂量为100次量。
3.应用权利要求2所述检测试剂盒检测1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒的多重PCR检测方法，其特征在于，用于非诊断性目的的检测，引物1在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.2umol/L；引物2在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.2umol/L；引物3在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.4umol/L；引物4在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.4umol/L；RT-PCR的反应条件为50℃反转录30分钟，94℃变性2分钟；然后进入变性94℃30秒，45℃梯度退火20秒，每循环一次升高2℃，72℃延伸2分钟的循环，共进行8个循环；然后进入变性94℃30秒，55℃退火20秒，72℃延伸2分钟的循环，共进行25个循环；最后再经72℃延伸10分钟后，于4℃结束反应。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN103060478A (zh) * | 2013-01-30 | 2013-04-24 | 山东农业大学 | 一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重rt-pcr方法 |
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2013
- 2013-06-08 CN CN201310228262.9A patent/CN103382507B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103060478A (zh) * | 2013-01-30 | 2013-04-24 | 山东农业大学 | 一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重rt-pcr方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 鸭甲型肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立及华东地区2009-2011年鸭甲型肝炎病毒的流行病学调查;朱寅彪;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20130415(第4期);D050-134页，参见摘要、第1.4节、第1.7节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103382507A (zh) | 2013-11-06 |
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