CN103757132A - 检测番茄斑萎病毒感染的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明“检测番茄斑萎病毒感染的试剂盒及其应用”，涉及植物病原检测技术。其特征在于该技术中采用的引物如下：上游引物TSWV-F 5’-CAGGATTGGAGCCACCGACAT-3’；下游引物TSWV-R 5’-AGCATACTCTTTCCCTTTCT-3’。本发明基于该核心提供了检测番茄斑萎病毒感染的试剂盒，以及该试剂盒在检测番茄斑萎病毒感染的应用。采用本发明提供的方法和试剂盒，可以检测特定材料是否感染或携带番茄斑萎病毒，也可以针对特定作物或蔬菜种植区进行番茄斑萎病毒感染危害的预警，防治番茄斑萎病毒大面积传播造成的农业经济损失。本发明的方法及试剂盒具有快速，易于实现，敏感可靠等优点，可在一天内完成多个待考察地区的检测或预警。

Description

检测番茄斑萎病毒感染的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及植物病原物检测方法，特别是涉及一种检测番茄斑萎病毒感染的试剂盒及方法。 
背景技术
番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae），番茄斑萎病毒属（Tospovirus），于1915年由Brittlebank首次在澳大利亚发现，是目前已知的寄主范围最广、最具经济重要性的植物病毒之一。该病毒传播方式主要是以蓟马持久性方式传播，现已在世界上多个国家和地区的温带、亚热带及热带地区广泛分布，侵染烟草、大豆、番茄、花生、辣椒、莴苣、菊花等作物及多种杂草等84科1090多种单子叶、双子叶植物。该病毒主要引起叶片斑块状褪绿、黄化、坏死及灼烧状等症状，可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害，造成极其严重的经济损失，严重时损失可超过80%产量，甚至绝收。 
在法国和西班牙等欧洲国家和地区，曾因该病毒的传播介体—蓟马的大量扩散而引起番茄、辣椒等作物的严重病害，造成毁灭性损失，重病地块损失达100%。20世纪90年代末期，TSWV在日本的菊花上发生严重，TSWV以其广泛的寄主范围和造成的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。2000年，张仲凯等在研究云南烟草病毒病原中发现TSWV在云南烟区广泛分布，在局部地区可造成60%以上的严重损失，同时在我国广东和广西、珠江三角洲等地也有该病毒病发生的报道。2003年，张友军等在北京大棚辣椒上首次发现该病毒的传播介体西花蓟马，近些年又多次从进境花卉植物上检出多种蓟马，因此在我国存在因该病毒扩散而造成严重危害的风险。该病毒以蓟马为媒介传播，可在蓟马体内自行复制增殖。在所有的蓟马中，西花蓟马是传播效率最高的媒介昆虫。 
TSWV具有膜包被的三分体单链RNA（L RNA，M RNA，S RNA）基因组，编码4种结构蛋白，三个片段的5′和3′末端共有8个保守互补碱基，可形成假环状结构。L RNA（8.9kb）含有一个开放阅读框(open reading frame，ORF)，编码病毒RNA依赖性聚合酶蛋白（RdRp）。M RNA（4.8kb）和S RNA（2.9kb）为双义RNA，其中M RNA病毒链编码非结构蛋白NSm，互补链编码糖蛋白G1，G2的前体蛋白；S RNA病毒链编码非结构蛋白NSs，互补链编码核壳体蛋白(nucleocapsid protein，N)。病毒粒子近球形，直径为80～120nm，其中外膜为20～25nm，核壳体直径为60nm，包括三个单链RNA片段，在形态学上明显区别于其它属的植物病毒；在受侵染的寄主细胞中，多个核壳体聚集于不规则的膜内，具有典型的细胞病毒特征。 
研究表明TSWV在植物提取液中非常不稳定，即使提纯病毒其免疫原活性也很弱，因而多抗血清的滴度较低，因此采用常规的酶联免疫吸附法（ELISA），灵敏度低和特异性差，大大限制了对该病毒的检测。 
RT-PCR技术是一种体外扩增DNA或RNA片段的方法，该方法特异、灵敏、快速、简便。番茄斑萎病毒属于单链RNA病毒，需要先合成cDNA模板，然后加入特异性引物进行PCR扩增。1994年，Mumford等成功应用RT-PCR技术检测了TSWV，认为RT-PCR技术与当时其他技术相比特异性及灵敏度更高。1996年，DEWEY应用来源于Tospovirus L RNA及S RNA序列的引物，使用RT-PCR技术检测TSWV。WEEKES和他的同事们成功地用RT-PCR检测到Tospovirus属病毒，之后又对该方法又作了一些修改。2001年CORTEZ等为了使检测更加灵敏、可靠又对RT-PCR技术作了修改。2003年，GIOVANNA等成功地用RT-PCR检测到单头蓟马体内的TSWV。Mason等应用RT-PCR技术检测到97％感染TSWV的蓟马呈阳性，认为该方法快速且可靠。 
发明内容
本发明根据上述领域的需求和空白，提供一种用于检测番茄斑萎病毒感染的方法及试剂盒，该方法具有快速，灵敏，特异的优点，可用于预测植物是否感染番茄斑萎病毒，具体技术方案如下： 
一种用于PCR检测番茄斑萎病毒感染的引物，其核苷酸序列如下： 
上游引物TSWV-F 5’-CAGGATTGGAGCCACCGACAT-3’； 
下游引物TSWV-R 5’-AGCATACTCTTTCCCTTTCT-3’。 
检测番茄斑萎病毒感染的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含以固体形式或液体形式存在的以下引物对： 
上游引物TSWV-F 5’-CAGGATTGGAGCCACCGACAT-3’； 
下游引物TSWV-R 5’-AGCATACTCTTTCCCTTTCT-3’。 
所述试剂盒还包括用于提取总RNA、合成cDNA模板所需的通用试剂， 
PCR扩增所需通用试剂， 
用于电泳显示的标准品Maker，和/或 
电泳检测所需的通用试剂。 
上述任一试剂盒在检测番茄斑萎病毒感染中的应用，包括如下步骤： 
（1）采取疑似感染TSWV的样品，并提取总RNA,以所述总RNA为模板合成cDNA； 
（2）以cDNA为模板进行PCR扩增， 
（3）结果判断：检测PCR扩增结果出现397bp特征条带说明所述样品感染了番茄斑萎病毒；未出现397bp特征条带说明所述样品未感染番茄斑萎病毒， 
所述疑似感染TSWV的样品指表现感染TSWV疑似症状的植物样品或表现感染TSWV疑似症状的植物样品所在地区出现的西花蓟马，或疑似与TSWV有接触的生物材料； 
所述PCR扩增体系中采用所述引物对。 
所述PCR扩增体系如下：扩增体系：cDNA 2μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、ES2×Tap10 Master Mix、ddH2O 7μL，总体积20ul； 
PCR扩增条件如下：4℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火45s、72℃延伸45s，40个循环，最后72℃延伸5min，终止温度为4℃。 
番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae），番茄斑萎病毒属（Tospovirus）是目前已知的寄主范围最广、最具经济重要性的植物病毒之一。该病毒以蓟马为媒介传播，可在蓟马体内自行复制增殖。在所有的蓟马中，西花蓟马是传播效率最高的媒介昆虫。现已在世界上多个国家和地区的温带、亚热带及热带地区广泛分布，侵染烟草、大豆、番茄、花生、辣椒、莴苣、菊花等作物及多种杂草等84科1090多种单子叶、双子叶植物。该病毒主要引起叶片斑块状褪绿、黄化、坏死及灼烧状等症状，可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害，造成极其严重的经济损失，严重时损失可超过80%产量，甚至绝收。 
由于该病毒引起的感染症状与很多其它病毒引起的症状非常相似，例如西瓜花叶病毒WMV，烟草花叶病毒TMV,番茄黄化曲叶病毒TYLCV,瓜类退绿黄化病毒病CCYV等，肉眼难以准确分辨确定属于哪种病毒感染，但是其危害和传播速度远远超过其它病毒。 
常规的免疫检测方法也能准确可靠地鉴别和检测该病毒，因为TSWV在植物提取液中非常不稳定，即使提纯病毒其免疫原活性也很弱，因而多抗血清的滴度较低，采用常规的酶联免疫吸附法（ELISA），灵敏度低和特异性差，大大限制了对该病毒的检测。 
根据以上情况，发明人认为采用RT-PCR的方法对疑似感染植物样品以及西花蓟马等样品进行检测应该是不错的选择。基于该想法，发明人首先解决的技术问题是获取用于RT-PCR的特异性引物。本发明针对核壳体蛋白(nucleocapsid protein，N)序列，设计并验证获得特异性引物。经验证（如实施例3），该引物能够在引起相似感染症状的多种病毒种类中特异灵敏地检测出番茄斑萎病毒，根据PCR检测检索是否出现特征条带判断。 
本发明该基于该引物提出了试剂盒以及该试剂盒的应用的方案。用于对特定样品进行检测，看其是否携带或感染番茄斑萎病毒。特定样品可以是表现感染TSWV疑似症状的植物样品或表现感染TSWV疑似症状的植物样品所在地区出现的西花蓟马，或疑似与TSWV有接 触的生物材料，如海关检测中遇到的疑似生物材料； 
本发明还未上述应用提供了优选PCR体系和程序。 
本发明具有以下有益效果： 
本发明方法具有操作简便，灵敏度高，特异性强，检测速度快等特点被广泛应用于病毒检测，本方法针对不同地区TSWV样品进行检测，提供了该病毒快速、高灵敏度的检测方法和体系。本发明检测方法与酶联免疫吸附法（ELISA）、电镜检测法、TSWV试纸条、负染色法和超薄切片细胞病理观察法相比，具有检测所需样品量少，准确性高，特异性和重复性好等特点。本发明检测时间只要6小时左右，每检测一个测试点只需要一个叶片或10头西花蓟马，且不必考虑西花蓟马的龄期，只需一个人就可以完成对多个地区的样品检测；而传统酶联免疫吸附法（ELISA）至少需要2天，耗时长，现代快速TSWV试纸条虽然检测时间短，但带毒量较少很难检测出。 
附图说明
下面结合具体实施例和附图说明对本发明进一步说明。 
图1为北京中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室和山东济宁地区番茄斑萎病毒不同症状辣椒叶片检测结果图； 
泳道1～5分别代表疑似感染番茄斑萎病毒表温室带毒辣椒、温室带毒辣椒、济宁卷叶辣椒、济宁皱缩辣椒叶片、济宁斑点辣椒叶片； 
图2为感染番茄斑萎病毒曼陀罗叶片检测结果电泳图； 
图3为阳性对照，北京顺义和北京延庆辣椒叶片番茄斑萎病毒症状检测结果图。 
其中泳道1～5分别代表疑似感染番茄斑萎病毒顺义环纹辣椒、顺义斑点辣椒叶片、顺义皱缩辣椒叶片、延庆环纹辣椒叶片，延庆斑点辣椒叶片；CK为阳性对照，接种有TSWV的曼陀罗叶片提取的RNA， 
图4特异性检测结果 
其中泳道自左至右依次代表M，携带TSWV曼陀罗，携带TSWV辣椒叶片，人工接种TSWV的曼陀罗叶片，带西瓜花叶病毒WMV的西瓜叶片，带烟草花叶病毒TMV的烟草叶片，带番茄黄化曲叶病毒TYLCV的番茄叶片，带瓜类退绿黄化病毒病CCYV的黄瓜叶片； 
以上四个电泳图中M均代表Marker I。 
具体实施方式
下面通过具体实施方式详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅 作示例说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常用生化试剂商店够买所得，特异性引物由上海生工生物技术有限公司。 
生物材料来源 
以下生物材料获取途径及方式：在相应地区田间采集疑似带TSWV的植物叶片，判断方式是表现叶片斑块状褪绿、黄化、坏死及灼烧状等症状。 
温室疑似带毒辣椒（采集于中国农科院蔬菜花卉所昆虫组实验温室，赵巍巍） 
温室疑似带毒辣椒（采集于中国农科院蔬菜花卉所昆虫组实验温室，赵巍巍） 
济宁卷叶辣椒（采集于山东济宁，李飞） 
济宁皱缩辣椒叶片（采集于山东济宁，李飞） 
济宁斑点辣椒叶片（采集于山东济宁，李飞） 
感染番茄斑萎病毒曼陀罗叶片（采集于中国农科院蔬菜花卉所昆虫组实验室，赵巍巍） 
顺义环纹辣椒（采集于北京顺义杨村，赵巍巍） 
顺义斑点辣椒叶片（采集于北京顺义杨村，赵巍巍） 
顺义皱缩辣椒叶片（采集于北京顺义杨村，赵巍巍） 
延庆环纹辣椒叶片（采集于北京延庆县广积屯，吴青君） 
延庆斑点辣椒叶片（采集于北京延庆县广积屯，吴青君） 
以下材料采集自中国农业科学院蔬菜花卉研究所植物病理组实验室。 
人工接种TSWV的曼陀罗叶片 
人工接种TSWV的辣椒叶片 
带西瓜花叶病毒WMV的西瓜叶片 
带烟草花叶病毒TMV的烟草叶片 
带番茄黄化曲叶病毒TYLCV的番茄叶片 
带瓜类退绿黄化病毒病CCYV的黄瓜叶片 
实施例1.用于番茄斑萎病毒的特异性引物序列设计 
步骤一、序列获得 
1、通过NCBI的GENBANK数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索所有已报道、已发现、已提交数据库的TSWV序列； 
2、将尽可能多的TSWV序列下载后，使用DNAMAN软件进行序列比对分析；筛选出不同株系的同一病毒序列； 
3、通过DNAMAN软件将不同株系的TSWV病毒序列进行比对，寻找其保守区域(即所有株系完全相同，没有变异的一段DNA序列)； 
步骤二、方法：使用PRIMER5，OLIGO引物设计软件在保守区域内设计引物。 
步骤三、引物设计原则： 
1、两引物中G+C碱基对的百分比尽量相似； 
2、引物内部避免具有明显的二级结构； 
3、两引物之间不应有互补序列，避免形成“引物二聚体”； 
4、引物与靶DNA片段的配对须精确、严格，尤其3’末端； 
5、特异引物应具有一定的退火温度（不低于50℃）和一定的长度（不少于20个bp）。 
步骤四、结果： 
将设计好后的备选引物提交到NCBI的BLAST系统中进行电子PCR筛选，选择相似性为100%，能搜索出最多不同株系番茄斑萎病毒序列的引物作为标准引物。 
本发明获得的引物序列如下： 
上游引物5’-CAGGATTGGAGCCACCGACAT-3’（SEQ ID No.1） 
下游引物5’-AGCATACTCTTTCCCTTTCT-3’（SEQ ID No.2）。 
该引物扩增的条带清晰，扩增结果稳定，重复性好。 
实施例2.验证PCR引物在番茄斑萎病毒感染中的有效性和特异性 
步骤1.获取待分析区域的疑似感染样品 
本实施例中疑似感染样品包括：表现叶片斑块状褪绿、黄化、坏死及灼烧状等症状的植物叶片； 
采取到疑似感染样品后，立即进入步骤3或-80℃保存。 
步骤2.合成本发明设计的如下引物 
上游引物TSWV-F 5’-CAGGATTGGAGCCACCGACAT-3’； 
下游引物TSWV-R 5’-AGCATACTCTTTCCCTTTCT-3’； 
步骤3.植物样品总RNA提取 
将植物样品放入已灭菌且充分预冷的研钵中，加入液氮，迅速研成粉末； 
1.5mL RNase-free离心管中加入1mL Trizol试剂，然后将约100mg粉末迅速转移到离心管中，涡旋充分混匀，室温静置5min；12000rpm，4℃离心5min，移至新RNase-free离心管，取上清；加入350ul氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min；12000rpm，4℃ 15min，将上层水相（400ul）移至新离心管；加入400ul异丙醇（等体积），轻轻混匀，冰上静置5-10min；12000rpm， 4℃ 10min，弃上清，RNA沉淀于管底；加入1mL 75%乙醇，轻轻振荡离心管。8000rpm，4℃5min，尽量除去上清；室温放置10-15min，晾干；用30-40ul RNase-free ddH2O(或DEPC水)溶解RNA，室温溶解后分装成小管，存于-80℃冰箱备用。 
提取的RNA先用1.0%琼脂糖凝胶电泳定性检测，再用DNA/RNA Nanodrop测定浓度。RNA提取物于-20℃存储备用。 
根据试剂盒TakaRa PrimeScriptTM rimeScripttScript ddHgDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书，采用上述提取的总RNA为模板合成cDNA模板。 
步骤4.特异性PCR产物扩增 
扩增体系：cDNA 2μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、ES 2×Tap10 Master Mix、ddH2O 7μL，总体积20ul。 
扩增条件如下：4℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火45s、72℃延伸45s，40个循环，最后72℃延伸5min，终止温度为4℃。 
步骤5.电泳检测 
取步骤（4）扩增产物8.0μL，点样于2.0%的琼脂糖凝胶，于琼脂糖凝缓冲液中、150V/cm电压下电泳，电泳结束后于自动凝胶成像系统上照相。 
按照步骤1～5，分别对不同地区不同疑似番茄斑萎病毒寄主进行检测； 
图1编号1～5分别代表疑似感染番茄斑萎病毒温室带毒辣椒、温室带毒辣椒、济宁卷叶辣椒、济宁皱缩辣椒叶片、济宁斑点辣椒叶片； 
图2编号1～8代表感染番茄斑萎病毒曼陀罗叶片； 
图3编号1～5分别代表疑似感染番茄斑萎病毒顺义环纹辣椒、顺义斑点辣椒叶片、顺义皱缩辣椒叶片、延庆环纹辣椒叶片，延庆斑点辣椒叶片；CK为阳性：人工接种TSWV的曼陀罗叶片，所有M均代表Marker I； 
电泳结果见图1、图2、图3，均扩增出分子量为397bp的特征DNA条带。 
步骤6.回收PCR产物 
回收的PCR产物连接到T载体后，送公司测序。序列分析结果显示，扩增的片段为397bp，序列为番茄斑萎病毒序列。 
实施例3.本发明检测方法的特异性验证 
材料： 
人工接种TSWV的曼陀罗叶片 
人工接种TSWV的辣椒叶片 
带西瓜花叶病毒WMV的西瓜叶片 
带烟草花叶病毒TMV的烟草叶片 
带番茄黄化曲叶病毒TYLCV的番茄叶片 
带瓜类退绿黄化病毒病CCYV的黄瓜叶片 
以上材料采集自中国农业科学院蔬菜花卉研究所植物病理组实验室 
方法步骤 
检测步骤同是实施例2的操作。只是在步骤3中，TYLCV是DNA病毒，参照试剂盒说明书提取DNA,试剂盒是Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型） 
植物基因组DNA提取试剂盒 
1.取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分碾磨。 
2.将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700ul 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 
3.加入700ul氯仿，充分混匀，12,000rpm(～13,400×g)离心5min。 
4.小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700ul缓冲液GP2，充分混匀。 
5.将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃掉废液。（吸附柱容积为700ul左右，可分次加入离心。） 
6.向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 
7.向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 
8.重复操作步骤7. 
9.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 
10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。 
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50ul，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。 
检测结果，检测结果如图4所示，本发明的方法能够在产生相似感染症状的病毒中鉴定出番茄斑萎病毒。 
Figure IDA0000446169180000011
Figure IDA0000446169180000021

Claims (6)

1.一种用于PCR检测番茄斑萎病毒感染的引物，其核苷酸序列如下： 
上游引物TSWV-F 5’-CAGGATTGGAGCCACCGACAT-3’； 
下游引物TSWV-R 5’-AGCATACTCTTTCCCTTTCT-3’。 
2.检测番茄斑萎病毒感染的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含以固体形式或液体形式存在的以下引物对： 
上游引物TSWV-F 5’-CAGGATTGGAGCCACCGACAT-3’； 
下游引物TSWV-R 5’-AGCATACTCTTTCCCTTTCT-3’。 
3.根据权利要求2所述的试剂盒，还包括用于提取总RNA，合成cDNA模板所需的通用试剂。 
4.根据权利要求2所述的试剂盒，还包括 
PCR扩增所需通用试剂， 
用于电泳显示的标准品Maker,和/或 
电泳检测所需的通用试剂。 
5.权利要求2～4所述任一试剂盒在检测番茄斑萎病毒感染中的应用，包括如下步骤： 
（1）采取疑似感染TSWV的样品，并提取总RNA,以所述总RNA为模板合成cDNA； 
（2）以cDNA为模板进行PCR扩增， 
（3）结果判断：检测PCR扩增结果出现397bp特征条带说明所述样品感染了番茄斑萎病毒；未出现397bp特征条带说明所述样品未感染番茄斑萎病毒， 
所述疑似感染TSWV的样品指表现感染TSWV疑似症状的植物样品或表现感染TSWV疑似症状的植物样品所在地区出现的西花蓟马，或疑似与TSWV有接触的生物材料； 
所述PCR扩增体系中采用所述引物对。 
6.根据权利要求5所述的应用，所述PCR扩增体系如下：扩增体系：cDNA 2μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、ES 2×Tap10 Master Mix、ddH2O 7μL，总体积20ul；PCR扩增条件如下：4℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火45s、72℃延伸45s，40个循环，最后72℃延伸5min，终止温度为4℃。 
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