CN101988126B - 检测多刺曼陀罗的核酸组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测多刺曼陀罗(D.ferox)的核酸组合物，包括SEQ ID No1所示的核酸引物F、SEQ ID No 2所示核酸引物R和SEQ ID No 3所示核酸分子探针P或与核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P完全互补的核酸链。通过实时荧光PCR检测技术，本发明核酸组合物能在半个工作日内完成检测，不仅检测时间大大缩短，检测的灵敏度也显著提高。将本发明核酸组合物用于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域当中，以达到快速和准确的检测鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及农业和植物检验检疫技术领域，具体涉及一种利用分子生物学检测技术快速准确地检测多刺曼陀罗(D.ferox)的核酸组合物，采用实时荧光PCR检测技术，该组合物适用于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域当中。
背景技术
曼陀罗属(Datura L)，为茄科植物。世界上每年都会发生曼陀罗中毒事件，另外，由于曼陀罗属许多种被广泛地用于药物学和园艺学，因此，该属许多种在世界各地和我国均有大量栽培，导致该属在世界范围内广泛分布。在进口货物如大豆中，经常有截获有毒和有害杂草曼陀罗属种子的报道，且种子鉴定易发生混淆。目前在国内外文献中常出现的曼陀罗属的植物名称有：多刺曼陀罗(D.ferox)，栎叶曼陀罗(D.quercifolia)，曼陀罗(D.stramonium)，木本曼陀罗(D.arborea)，美丽曼陀罗(D.candida)，湿地曼陀罗(D.ceratocaula)，异色曼陀罗(D.discolor)，无刺曼陀罗(D.inermis)，毛曼陀罗(D.inoxia)，光曼陀罗(D.leichhardtii)，洋金花(D.metel)，紫花曼陀罗(D.tatula)，柏哈地曼陀罗(D.bernhardii)，红花曼陀罗(D.sanguinea)等，其中多刺曼陀罗的异名为D.quercifolia。
实际工作中，农产品中夹杂的曼陀罗杂草种子的外观特征往往会因运输受到磨损与变形，同时由于环境、气候、栽培条件的影响、种子成熟度的不同等引起的个体差异，更为形态鉴定增加了难度，而细胞生物学方法等需要的周期比较长且难以准确鉴定。
目前，细胞学研究表明曼陀罗(D.stramonium)和多刺曼陀罗(D.ferox)的随体和二价体形状和数目最接近；生物化学的研究表明曼陀罗(D.stramonium)和多刺曼陀罗(D.ferox)的同工酶最近似；在分子水平，利用AFLP技术发现曼陀罗(D.stramonium)和多刺曼陀罗(D.ferox)的相似距离最近，在进化树上 (D.ferox)。
发明内容
本发明的一个目的在于克服上述现有技术中关于形态鉴定和细胞生物学方法存在的困难，提出采用分子生物学的方法，对核糖体内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers，ITS)序列差异设计多刺曼陀罗(D.ferox)的检测用核酸组合物。
本发明的另一个目的在于，建立多刺曼陀罗(D.ferox)的实时荧光PCR检测方法，将核酸组合物用于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域当中，以达到快速和准确的检测鉴定。
本发明提供的检测多刺曼陀罗(D.ferox)的核酸组合物是基于多刺曼陀罗(D.ferox)与其近似种在rDNA内转录间隔区序列上的差异设计的。18S～26S核核糖体DNA(nrDNA)的内转录间隔区ITS分为ITS 1和ITS2两部分。ITS区在植物核基因组中是高度重复的。全部nrDNA重复单位包括4万个拷贝以串联重复(tandemrepeats)方式出现在一个或多个染色体基因位点上(Hamby R K，Zimer E A.Ribosomal RNA as a phylogenetic tool in plant systematics of plants[M].Chapman and Hall，New York，NY.1992，50～91.)。在被子植物中，ITS区既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，说明这些间隔区的序列很容易在近缘类群间排序，而且丰富的变异可在较低的分类阶元上(如：属间和种间)解决植物系统发育问题。屈良鹄和陈月琴(1999)(生物分子分类检索表——原理与方法，中山大学学报(自然科学版)[J].1999，38(1)：1-6)通过对不同生物类群的ITS序列(自生物学数据库)的比较得出：被子植物大多数科属的ITS序列的种间差异值为1.2％～10.2％，属间差异值为9.6％～28.8％，这对系统发育研究来说都是较合适的范围。
本发明提供的一种检测多刺曼陀罗(D.ferox)的核酸组合物，包括核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P。
核酸引物F，即上游引物，其5’端至3’端序列为： AGGGAGACGCACGGAGGA。
核酸引物R，即上游引物，其5’端至3’端序列为：CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGA。
核酸分子探针P为Taqman荧光探针，其5’端至3’端序列为：CCGAAGCACAGCCCGCGC。荧光基团，如：羧基荧光素(FAM)结合于探针的5’末端，淬灭剂，如：羧基四甲基罗丹明(TAMRA)结合于探针3’末端。
根据核苷酸碱基配对规则可以推知，与本发明提供的核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P核酸序列完全互补的核酸链组成的一组核酸组合物也适用于本发明当中。
提取目标样品的总DNA后，运用实时荧光PCR检测技术就可完成对目标样品的扩增，随着PCR循环数的增加，所能检测的荧光信号亦随之增加，从而通过荧光标识判断目标样品是否为多刺曼陀罗(D.ferox)。
本发明是在提取单粒种子的DNA后，利用核酸引物F/R和核酸分子探针P进行实时荧光PCR检测。PCR扩增后的阳性样品能检测到荧光信号，PCR扩增后的阴性样品及空白对照无法检测到有荧光信号的增加，由此可以区分多刺曼陀罗(D.ferox)和其它曼陀罗属的样品。
传统的鉴定方法是利用种子形态学特征、细胞生物学特征等。外观形态鉴定作为能便捷地辨别不同植物的外部特征对不同种植物进行分类而成为口岸检疫杂草的重要手段之一。但是，由于进口的农产品中因脱落、干燥、储运、装卸等原因，夹杂的杂草种子的外观特征往往会因此受到磨损与变型，同时由于环境、气候、栽培条件的影响、种子成熟度的不同等引起的个体差异也是难免的，这样就给外表形态鉴定带来了困难。而细胞生物学方法等不仅需要较长的周期，而且仅依据染色体的形态仍难以鉴定。
多刺曼陀罗(D.ferox)的近似品种较多，如：曼陀罗(D.stramonium)，木本曼陀罗(D.arborea)，美丽曼陀罗(D.candida)，湿地曼陀罗(D.ceratocaula)，异色曼陀罗(D.discolor)，无刺曼陀罗(D.inermis)，毛曼陀罗(D.inoxia)，光曼陀罗(D.leichardtii)，洋金花(D.metel)，紫花曼陀罗(D.tatula)，柏哈地曼陀罗(D.bernhardii)，红花曼陀罗(D.sanguinea)等。这些植物的籽实与多刺曼 陀罗(D.ferox)极为相似，但是其危害性及检疫地位各有不同。本发明采用核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P及其互补核酸链形成的核酸组合物，采用实时荧光PCR检测技术实现对多刺曼陀罗(D.ferox)的特异性区分，有利于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域对目标样品的快速准确的检测鉴定。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
1.样品DNA提取
单粒种子研磨粉碎，按照以下步骤提取：
1)液氮中研细后转入离心管中，加入500～800μL TES[100mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA，2％SDS]；加50～100μg蛋白激酶K混匀，置于55℃～60℃水浴60～90min，期间轻轻混匀几次；
2)调节盐浓度，加1/10体积的10％十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)，置于65℃水浴10～20min；
3)加入等体积的SEVGA(氯仿∶异戊醇＝24∶1)混匀，0℃孵育30min；
4)离心，取上清，加3～6μL RNase A，37℃水浴30min，去除RNA；
6)加预冷异丙醇，-20℃放置15～30min；
7)离心，弃异丙醇，70％乙醇洗2次。室温干燥，50～200μL ddH2O溶解。
2.实时荧光PCR检测
实时荧光PCR扩增体系25μl：Premix Ex TaqTM(2×)12.5μL，上、下游引物(5μmol/L)各1μL，TaqMan核酸分子探针P(5μmol/L)1μL，DNA(10～20ng/μL)模板1μL，ROX Reference Dye II(50×)0.5μL，灭菌蒸馏水补至25μL，在ABI 7500型Fast Real-Time PCR System上进行实时荧光PCR扩增。反应程序为：预变性95℃10s；然后以95℃15s，60℃1min进行40个循环。
采用上述相同的检测步骤，对来自于不同地区的多刺曼陀罗及其近似品种 的样品(见表1)进行检测，检测结果见表2。
表1PCR扩增所用材料及其来源
表2PCR检测光高粱及其近似种结果
“+”表示：阳性，随着PCR循环次数的增加，样品中的荧光信号也在增加；
“-”表示：阴性，随着PCR循环次数的增加，样品中的荧光信号不再增加，与初始状况相同。
检测结果表明，检测结果与实验材料完全相符，多刺曼陀罗(D.ferox)(阳性)样品有扩增，能检测到荧光信号，多刺曼陀罗(D.ferox)近似品种(阴性)样品及空白对照没有荧光信号的增加。
由此可见，本发明采用的核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P组合物能大大缩短检测时间，采用实时荧光PCR技术能在半个工作日内完成检测。本发明通过单粒种子的检测就能确定，检测的灵敏度大大提高。传统的常规检测方法不能区分形态磨损和成熟度不够的种子，建立的实时荧光PCR检测方法能特异敏感准确快速地鉴定多刺曼陀罗(D.ferox)及其近似种。
以上通过具体实施方式对本发明进行了详细的说明，但这些并非构成对本 发明的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域的技术人员还可做出许多变形和改进，这些改变也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>上海出入境检验检疫局
<120>检测多刺曼陀罗的核酸组合物及其应用
<130>100189CN-CH-I
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>SEQ ID No 1
<211>18
<212>DNA
<213>核酸引物F
<400>1
agggagacgc acggagga 18
<210>SEQ ID No 2
<211>23
<212>DNA
<213>核酸引物R
<400>2
Cgtaacaagg tttccgtagg tga 23
<210>SEQ ID No 3
<211>18
<212>DNA
<213>核酸分子探针P
<400>3
ccgaagcaca gcccgcgc 18
Claims (6)
1.一种检测多刺曼陀罗的核酸组合物，其特征是包括核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P；或者，所述核酸组合物包括与核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P完全互补的核酸链；
所述的核酸引物F如SEQ ID No 1所示，所述的核酸引物R如SEQ ID No 2所示，所述的核酸分子探针P如SEQ ID No 3所示。
2.根据权利要求1所述的检测多刺曼陀罗的核酸组合物，其特征是所述的核酸分子探针P为Taqman荧光探针。
3.根据权利要求2所述的检测多刺曼陀罗的核酸组合物，其特征是所述的核酸分子探针P的荧光基团为羧基荧光素。
4.根据权利要求2所述的检测多刺曼陀罗的核酸组合物，其特征是所述的核酸分子探针P的淬灭剂为羧基四甲基罗丹明。
5.根据权利要求1所述的检测多刺曼陀罗的核酸组合物，其特征是所述的核酸组合物用于实时荧光PCR检测技术判断目标样品中的多刺曼陀罗。
6.一种实时荧光PCR检测多刺曼陀罗的试剂组合物，其特征是包括权利要求1-4之一所述的核酸组合物。
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| Lucila C. de Miguel et al..The very-low-fluence and high-irradiance responses of the phytochromes have antagonistic effects on germination, mannan-degrading activities, and DfGA3ox transcript levels in Datura ferox seeds.《Journal of Experimental Botany》.2007,第58卷(第14期),3997-4004. * |
| Lucila Cecilia de Miguel et al..A phytochrome-dependent embryonic factor modulates gibberellin responses in the embryo and micropylar endosperm of Datura ferox seeds.《Planta》.2006,第223卷(第4期),847-857. * |
| 文传浩等.一种简单、快捷植物RAPD分析DNA提取方法.《云南大学学报（自然科学版）》.2000,第22卷(第5期),392-393. * |
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