CN102586478A - 检测芜菁花叶病毒的一步多重rt-pcr法及其专用引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测芜菁花叶病毒的一步多重RT-PCR法及其专用引物。本发明提供了一种检测芜菁花叶病毒的引物组，为如下引物组C、引物组A或引物组B：所述引物组C由引物组A和引物组B组成；所述引物组A包括引物对a；所述引物组B包括引物对b；所述引物对a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成；所述引物对b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子组成。本发明的实验证明，本发明建立了一步法多重RT-PCR，对TuMV进行快速、准确地检测。

Description

检测芜菁花叶病毒的一步多重RT-PCR法及其专用引物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测芜菁花叶病毒的一步多重RT-PCR法及其专用引物。

背景技术

芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Virus，TuMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，病毒粒子呈弯曲线形，长约720nm，宽约15-20nm，由95％的外壳蛋白和5％的RNA构成。病毒核酸为单链正义RNA，约由10,000个核苷酸组成。TuMV寄主范围广泛，在人工接种条件下，可侵染43科156属，超过318种双子叶植物及部分单子叶植物；主要侵染十字花科蔬菜作物和观赏性物种，是仅次于黄瓜花叶病毒(CMV)浸染大田蔬菜最重要的病毒。据调查，我国白菜因TuMV危害平均每年造成5％的产量损失，有些年份减产10％以上，病害严重的地块几乎绝收。对该病毒的快速、准确检测有助于控制其传播流行，减轻危害和损失。

常用的植物病毒检测方法有传统的生物学检测方法、血清学方法、电镜检测法和分子生物学方法等。传统生物学方法简单、直观、可靠，能准确反映病毒的生物学特性，但需要具备指示植物、温室、网室等隔离条件，且检测速度很慢，如隔离措施不当，容易交叉感染，影响准确性。电镜检测是最直接、最准确的检测病毒的手段，但用电镜观察时需要样品含有的病毒浓度较高，因此需要对被检病毒进行提纯，病毒提纯费时费力，且电镜法所需电镜及超速离心设备价格昂贵，操作对初学者掌握难度较大。血清学方法是检测植物病毒最常用的有效方法之一，该方法需要与被检病毒相对应的特异性抗血清。但抗血清制备需要的时间较长，且检测结果容易受抗血清的特异性影响，有时会有交叉反应。分子生物学方法是从核酸水平来检测病毒的存在，比血清学方法灵敏度高，可检测到皮克(pg)级甚至飞克(fg)级，并且特异性更强，可进行大批量样本的检测。由于分子生物学方法显著的优越性，使得其在病毒检测中得以迅速广泛的应用。

分子生物学方法包括核酸杂交、双链RNA电泳、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光定量PCR、芯片检测等方法，其中RT-PCR方法检测病毒是最为广泛应用的方法之一，该方法需要病毒基因特异性引物(GSP)对病毒核酸模板进行扩增检测。虽然ELISA技术已经广泛应用于植物病毒的检测，但其检测的灵敏性无法与RT-PCR方法相比，RT-PCR方法是DAS-ELISA方法敏感度的1000倍。随着人们对不同来源的病毒进行基因组测序工作的进展，GenBank的数据不断丰富，使得利用RT-PCR方法检测病毒变得更加切实可行。在此基础上人们进而开发了多重RT-PCR，在同一反应体系中同时检测多种病毒。一般RT-PCR检测法需要分两步进行：先提取样品总RNA，然后经反转录获得cDNA后进行PCR检测，步骤相对繁琐。在两步法的基础上人们为了简化步骤，开发了一步RT-PCR法，即反转录和PCR扩增在同一反应体系中进行。

因此，建立快速、高灵敏度的病毒检测体系是对TuMV病毒防治的先决条件。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测芜菁花叶病毒的引物组。

本发明提供的检测芜菁花叶病毒的引物组，为如下引物组C、引物组A或引物组B：

所述引物组C包括引物对a和引物对b；

所述引物组A包括引物对a；

所述引物组B包括引物对b；

所述引物对a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成；

所述引物对b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子组成。

上述引物组中，所述引物组C还包括随机引物和Oligo d(T)18；

所述引物组A还包括随机引物和/或Oligo d(T)18；

所述引物组B还包括随机引物和/或Oligo d(T)18。

所述随机引物为Random Primer，购自TaKaRa公司，产品目录号为D3801；

所述Oligo d(T)18为Oligo d(T)18，购自TaKaRa公司，产品目录号为D511。

上述引物组中，所述引物组C由所述引物对a、所述引物对b、所述随机引物和所述Oligo d(T)18组成；

上述引物组中，所述引物组A由所述引物对a、所述随机引物和/或所述Oligod(T)18组成；

上述引物组中，所述引物组B由所述引物对b、所述随机引物和/或所述Oligod(T)18组成。

本发明的第二个目的是提供一种检测芜菁花叶病毒的PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，为如下1)-3)中的任意一种：

1)由上述的引物组中的所述引物组C、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；

2)由上述的引物组中的所述引物组A、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；

3)由上述的引物组中的所述引物组B、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成。

在上述PCR试剂中，所述反转录酶为M-MLV；

所述各引物组中的所述引物对a和所述引物对b的各条引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为0.125μmol/L；

所述引物组A或所述引物组B中的所述随机引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为1.25μmol/L；

所述引物组A或所述引物组B中的所述Oligo d(T)18在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为0.625μmol/L。

本发明的第三个目的是提供一种检测芜菁花叶病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的PCR试剂。

上述的引物组、上述的PCR试剂或上述的试剂盒在鉴定或辅助检测芜菁花叶病毒中的应用也是本发明保护的范围。

或上述的引物组、上述的PCR试剂或上述的试剂盒在制备鉴定或辅助检测芜菁花叶病毒产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的引物组、上述的PCR试剂或上述的试剂盒在鉴定或辅助检测待测植物是否感染芜菁花叶病毒中的应用也是本发明保护的范围；在上述应用中，上述待测植物具体为萝卜、甘蓝或四月慢油菜。

本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助检测待测植物是否感染芜菁花叶病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：以待测植物组织的RNA提取物作为模板，分别用上述的PCR试剂或上述的试剂盒中的所述的引物组C、所述的引物组A或所述的引物组B进行一步RT-PCR扩增，得到扩增产物，

检测扩增产物，

若所述引物组C扩增产物的大小为156bp和/或377bp，则待测植物为或候选为感染芜菁花叶病毒；

若所述引物组A扩增产物的大小为156bp，则待测植物为或候选为感染芜菁花叶病毒；

若所述引物组B扩增产物的大小为377bp，则待测植物为或候选为感染芜菁花叶病毒。

上述方法中，所述大小为156bp的扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列1或与其同源性大于90％的核苷酸序列；

所述大小为377bp的扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列2或与其同源性大于90％的核苷酸序列；

所述一步RT-PCR扩增的退火温度为55℃；

所述检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳；

所述待测植物为萝卜、甘蓝或四月慢油菜；

上述方法中的所述待测植物组织的RNA提取物按照如下方法制备：将所述待测植物叶片在提取液中研磨，得到研磨液，即得到RNA提取物，所述提取液由Tris、NaCl、EDTA、SDS和水组成；所述Tris在所述提取液中的终浓度为200mM，所述NaCl在所述提取液中的浓度为250mM，所述EDTA在所述提取液中的浓度为25mM，所述SDS在所述提取液中的浓度为0.5％(质量百分含量)；所述提取液的pH值为7.5；

所述研磨在23℃-28℃条件下进行；

所述组织为叶片。

上述提取液在提取RNA中的应用；上述应用中，所述提取的温度具体为23℃-28℃。

本发明的实验证明，本发明根据GenBank数据，设计了两套针对TuMV的特异性引物，利用反转录酶M-MLV和普通Taq酶，建立了一步法多重RT-PCR，可以实现对TuMV进行快速、准确地检测，尤其是两套针对TuMV的特异性引物确保了检测的准确性；另外在一步法多重RT-PCR中的模板只需要在室温条件下对样品简单研磨即可制备，研磨的粗提液或经浓缩后的DNA-RNA混合物均可作为模板，方法简便，不需要经过先对总RNA的单独提纯步骤；再者，一步法多重RT-PCR中的M-MLV反转录酶比现有的一步法RT-PCR使用的SuperscriptII价格便宜，在实际应用中应更容易被接受。

附图说明

图1为多种引物组合对检测效果的影响

图2为病毒量对扩增效率的影响

图3为粗提物经分离纯化浓缩后的产物图

图4为用粗提液与浓缩产物为模板进行检测的对比

图5为用GSP1引物组合对TuMV的快速检测结果

图6为用GSP2引物组合对TuMV的快速检测结果

图7为用GSP1引物组合和GSP2引物组合对TuMV的快速检测结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中部分材料如下：

TuMV毒源为来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所的北京TuMV毒株C1、C3、C4，山东农业科学院蔬菜所提供的TuMV毒株Lu2。

TuMV毒株C1、TuMV毒株C3、TuMV毒株C4记载在：冯兰香、徐玲、刘佳、钮心恪、李秀生“北京地区大白菜芜菁花叶病毒株系的鉴定”《中国蔬菜》1988(4)：11-13；公众均可从北京农业生物技术研究中心获得。

TuMV毒株Lu2记载在：国家蔬菜抗病育种课题TuMV株系研究协作组“我国十省(市)十字花科蔬菜芜菁花叶病毒(TuMV)株系分化研究”《病毒学杂志》1990，5(1).82-87；公众可从北京农业生物技术研究中心获得。

将上述C1、C3、C4、Lu2分别在温室(25℃)条件下人工接种在四月慢油菜和汉王白萝卜，网罩隔离，得到分别感染C1、C3、C4、Lu2的四月慢油菜和分别感染C1、C3、C4、Lu2的汉王白萝卜，上述接种在四月慢油菜样本的叶片花叶皱缩、失绿，呈现出感染TuMV病毒的典型症状。接种在汉王白萝卜样本的表型极轻微，叶片无皱缩，有轻微的明脉。

负对照为未接种上述各种TuMV毒株的四月慢油菜和汉王白萝卜(生长状态正常，没有TuMV病毒感染病症)。

反转录酶M-MLV(产品目录号为D2639A)、Oligo d(T)18(产品目录号为D511)、Random Primer(产品目录号为D3801，含有6个碱基的随机序列引物，有4⁶种可能序列，5′末端磷酸化修饰。)为TaKaRa公司产品。DNA聚合酶EasyTaq(AP111)及DNA marker 100bp plus(BM311)为北京全式金生物技术有限公司产品。

实施例1、一步RT-PCR法中相关引物的设计及条件摸索

一、一步RT-PCR法中相关引物的设计

在自然条件下芜菁花叶病毒(TurnipMosaic Virus，TuMV)非常容易通过基因重组，产生变异。通过查阅文献获知在TuMV-6K1基因内没有发现基因重组位点，序列高度保守，且TuMV-CP基因的C端相对比较保守。

经对GenBank登录的122个TuMV株系进行序列比对，根据TuMV的6K1区段(GenBank号HQ446217.1(C4)编码区的第3526-3681位)及CP保守区(GenBank号HQ446217.1(C4)编码区的第9074-9450位)设计了两套特异性引物GSP1和GSP2(见表1)。所设计的引物经NCBI的BLAST检测，确保对TuMV检测的唯一性与准确性。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1为两套特异性引物序列

二、一步RT-PCR法检测芜菁花叶病毒相关条件摸索

1、RNA的获取

RNA的获取分两种不同的方法：

粗提法：在1.5ml的eppendorf管中加入200μL提取液，分别取接种20天后感染C1、C3、C4、Lu2的四月慢油菜病叶、接种20天后感染C1、C3、C4、Lu2的汉王白萝卜病叶、编号为1-5的待测样本(1为采自北京地区的1个表型叶片花叶皱缩、失绿的“白玉秋”萝卜病叶样本，2-5分别为采自北京地区的4个表型叶片花叶皱缩、失绿的“春甘3号”甘蓝病叶样本)约150mg加入离心管，室温(25℃)下用塑料研杵充分研磨，分别得到感染C1、C3、C4、Lu2的四月慢油菜病叶的粗提液(研磨液)、感染C1、C3、C4、Lu2的汉王白萝卜病叶的粗提液(研磨液)和编号为1-5的待测样本的粗提液(研磨液)，这些粗提液即为RNA粗提物(粗提物经浓缩后电泳检测如图3，为DNA和RNA的混合物)。

上述提取液由Tris、NaCl、EDTA、SDS和水组成；所述Tris在所述提取液中的终浓度为200mM，所述NaCl在所述提取液中的浓度为250mM，所述EDTA在所述提取液中的浓度为25mM，所述SDS在所述提取液中的浓度为0.5％(质量百分含量)；所述提取液的pH值为7.5。

浓缩纯化法：将上述粗提法得到的粗提液12000rpm离心10分钟，取上清用酚/氯仿/异戊醇抽提(上清和酚/氯仿/异戊醇的体积比为1∶1，酚/氯仿/异戊醇的体积比为25∶24∶1)，12000rpm离心10分钟。取上清液再按照上面的方法经氯仿抽提，12000rpm离心5分钟，吸取上清液，将上清液经2.5倍体积乙醇沉淀，稍干燥后溶于20μL的DEPC水，分别得到感染C1、C3、C4、Lu2四月慢油菜病叶的浓缩产物(溶解液)、感染C1、C3、C4、Lu2汉王白萝卜病叶的浓缩产物(溶解液)和编号为1-5的待测样本的浓缩产物(溶解液)，这些浓缩产物(溶解液)即为RNA浓缩物。

2、一步法RT-PCR检测及相关条件摸索

1)多种引物组合的检测TuMV病毒

采用一步法RT-PCR进行扩增，具体如下：

反应体系为0.25μL M-MLV(浓度为200U/μL，反应体系中的终浓度2.5U/μL)，0.25μL EasyTaq(浓度为5U/μL，反应体系中的终浓度0.0625U/μL)，2μL 10×EasyTaqBuffer，0.8μL dNTPs(每种2.5mM，反应体系中的终浓度0.1mmol/L)，按照如下表2中的引物组合分别加入，每种组合的每条引物均加入0.25μL，1μL模板(感染C4的四月慢油菜病叶的粗提液)，DEPC处理水补足总体积20μL。反应程序：42℃30min，94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环，72℃7min。

表2不同反应引物组合

引物组合	引物
		1	GSP1
2	GSP1+Random Primer
		3	GSP1+Oligo d(T)18Primers
4	GSP1+Oligo d(T)18Primers+Random Primer
		5	GSP2
6	GSP2+Random Primer
		7	GSP2+Oligo d(T)18Primers
8	GSP2+Oligo d(T)18Primers+Random Primer

注：上述各条引物在对应的反应体系中的终浓度如下：GSP1/GSP2的各条引物的终浓度均为0.125μmol/L；Random Primer终浓度均为1.25μmol/L；Oligo d(T)18Primers终浓度均为0.625μmol/L。

将上述各个引物组合获得的PCR产物分别在1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

若引物组合1-4得到的扩增产物为156bp大小，则感染病毒TuMV；

若引物组合5-8得到的扩增产物为377bp大小，则感染病毒TuMV；

结果如图1所示，其中，1为空白对照(不加入模板，引物为GSP1)，7为空白对照(不加入模板，引物为GSP2)；2为负对照(不感染病源的正常四月慢油菜，引物为GSP1)，8为负对照(不感染病源的正常四月慢油菜，引物为GSP2)；3为GSP1，9为GSP2；4为GSP1+Random Primer，10为GSP2+Random Primer；5为GSP1+Oligod(T)18Primers，11为GSP2+Oligo d(T)18Primers；6为GSP1+Oligo d(T)18Primers+Random Primer，12为GSP2+Oligo d(T)18Primers+Random Primer；M：100bpplus DNA ladder，可以看出，3-6得到156bp大小的片段，9-12得到377bp大小的片段；进一步证明样本为感染C4的四月慢油菜病叶。

再将上述两种大小的产物进行测序，经测序156bp大小的片段的核苷酸序列为序列表中的序列1(与GenBank号HQ446217.1(C4)6K1序列一致)，377bp大小的片段的核苷酸序列为序列表中的序列2(与GenBank号HQ446217.1(C4)CP保守区序列一致)；进一步说明3-6和9-12对应的样本感染病毒TuMV，说明引物组合1-4和引物组合5-8均能进行鉴定感染病毒TuMV的扩增。

因此，表2的引物组合和上述PCR方法可以用来检测TuMV病毒，说明本发明的引物组合和鉴定方法正确。

从上述可以看出，用感染C4毒源的四月慢发病叶为试材，以第一种获得病毒RNA的方法，用单独GSP1或GSP2或者其组合物的引物检测，结果显示都能检测到病毒。当GSP引物与随机引物或Oligo d(T)18引物混合使用时，效果比只单独使用GSP引物要好，使用随机引物或Oligo d(T)18引物增加了反转录的效率，使得检测的灵敏性增强，如：GSP1+Random Primer搭配效果较好(泳道4)，这可能是因为6K1基因远离TuMV病毒RNA的3’端约6.2Kb所致，当RNA模板不完整时，Oligo d(T)18引物对6K1起不到增加反转录效率的作用，而随机引物可以反转出不同大小的cDNA片段，增强检测的灵敏性；GSP2+Oligo d(T)18Primers搭配效果较好(泳道11)，这可能是因为CP基因位于TuMV病毒RNA的3’端，且设计的GSP2引物更是靠近CP的C端。即使当RNA模板不完整时，Oligo d(T)18引物也能反转出CP的部分小片段，增强检测的灵敏性。因此，检测时同时添加随机引物和Oligo d(T)18引物则可以弥补上述不足。

因此，较好的鉴定引物为GSP1引物组合4或GSP2引物组合8。

2)病毒量对扩增效率的影响

在实际检测中发现被检植株的病症强弱和取样量直接影响了检测效果，因此下面分别进行检测摸索：

A、被检植株的取样量的影响

为了探讨取样量对检测效率的影响，选取发病较明显(表现为叶片花叶皱缩、失绿)感染C4毒源的四月慢油菜发病叶为试材，分别称取病叶30mg、50mg、80mg、100mg、150mg、200mg，分别用上述1的粗提法提取，得到不同质量梯度的粗提液作为模板，按照上述1)的反应体系和反应程序进行一步法RT-PCR扩增检测，分别用GSP1引物组合4和GSP2引物组合8进行检测。

结果如图2a所示，为取样量对扩增效率的影响，1-8：GSP1引物组合4；9-16：GSP2引物组合8。其中1，9：空白对照；2，10：负对照；3，11取样30mg；4，12：取样50mg；5，13：取样80mg；6，14：取样100mg；7，15取样150mg；8，16：取样200mg；M：100bp plus DNA ladder；结果显示，当取样量大于150mg时，两套引物均能很好地检测到病毒(GSP1引物组合4扩增产物大小为156bp，GSP2引物组合8扩增产物大小为377bp)，其中使用GSP1引物组合4在100mg取样量时，RT-PCR结果即可见微弱的条带。

进一步将上述150mg病叶取样量的粗提液进行稀释10-1000倍，按照上述1)的反应体系和反应程序进行一步法RT-PCR扩增检测，用GSP1引物组合4进行检测。

结果如图2b所示，为粗提液稀释后对扩增效率的影响，1：空白对照；2：负对照；3：150mg取样量的粗提液；4：150mg取样量的粗提液稀释10倍；5：150mg取样量的粗提液稀释100倍；6：150mg取样量的粗提液稀释1000倍；M：100bp plusDNA ladder；可以看出，所有稀释后的样品均不能检测到病毒。

因此，病叶的取样量应该大于或等于150mg。

B、被检植株的病症强弱的影响

由于同种毒源接种在不同宿主上表现出的致病力不尽相同，有些试材在人工接种后病症并不明显，如大部分的毒源在萝卜上表现轻微，有些表型极轻微的材料，尽管取样到200mg，用前述方法仍不能检测到病毒。

为了确定病毒是否真实存在，分别用上述1的两种提取方法提取感染Lu2的汉王白萝卜病叶(病症并不明显，表型极轻微，叶片无皱缩，有轻微的明脉)的RNA和感染C4的汉王白萝卜病叶(病症并不明显，表型极轻微，叶片无皱缩，有轻微的明脉)的RNA，分别得到感染Lu2的汉王白萝卜病叶的粗提液、感染Lu2的汉王白萝卜病叶的浓缩产物、感染C4的汉王白萝卜病叶的粗提液和感染C4的汉王白萝卜病叶的浓缩产物。

将感染C4的汉王白萝卜病叶的浓缩产物和感染Lu2的汉王白萝卜病叶的浓缩产物进行电泳检测，结果如图3所示，可以看出粗提液经纯化分离后得到的浓缩产物为较完整的DNA和RNA混合物。

分别以感染Lu2的汉王白萝卜病叶的粗提液、感染Lu2的汉王白萝卜病叶的浓缩产物、感染C4的汉王白萝卜病叶的粗提液和感染C4的汉王白萝卜病叶的浓缩产物为模板，按照上述1)的反应体系和反应程序进行一步法RT-PCR扩增检测，引物为GSP1组合4。

将上述的RT-PCR扩增产物进行检测，结果如图4所示，图为用粗提液与浓缩产物为模板进行检测的对比，1为空白对照；2为负对照；3为感染C4的汉王白萝卜病叶的粗提液；4为感染Lu2的汉王白萝卜病叶的粗提液；5为感染C4的汉王白萝卜病叶的浓缩产物；6为感染Lu2的汉王白萝卜病叶的浓缩产物；M：100bp plus DNA ladder，可以看出，对于病症并不明显、表型极轻微的接种病源的萝卜病叶来说，虽然泳道3也有轻微的条带，但只有浓缩产物(泳道5和6)才能很好地检测到目的片段(156bp)。

从上述结果推测，影响病症表型和检测效率的关键因素应该是和宿主叶片单位体积内病毒的含量有关。

3)、检测的准确性

按照上述1)的反应体系和反应程序进行一步法RT-PCR扩增检测，引物分别为GSP1组合4和GSP2组合8，模板分别为感染Lu2、C1、C3、C4的四月慢油菜病叶的粗提液和编号为1-5的待测样本的粗提液。

因所选检测病毒的部分序列保守性高，不同毒源用GSP1及其引物组合扩增序列相对序列表中的序列1的同源性在96.2％-97.4％(C4为100％)。用GSP2及其引物组合扩增序列相对序列表中的序列2的同源性在98.1-99.7％(C4为100％)，不同毒源相同引物的扩增片段大小一样，碱基数相同，只是序列上有个别位点有差异。

结果如图5和图6所示，图5为用GSP1组合4对TuMV的快速检测结果，其中，1：空白对照；2：负对照；3：感染Lu2的四月慢油菜(病症明显)病叶的粗提液；4：编号为1待测样本的粗提液；5：编号为2待测样本的粗提液；6：编号为3待测样本的粗提液；7：编号为4待测样本的粗提液；8：编号为5待测样本的粗提液；9：感染C1的四月慢油菜病叶的粗提液；10：感染C3的四月慢油菜病叶的粗提液；11：感染C4的四月慢油菜病叶的粗提液，M：100bp plus DNA ladder，可以看出，3-11中除了泳道4外均得到156bp大小的目的片段，说明编号2-5的待测样本均感染TuMV病毒。证明GSP1组合4检测的准确性高。泳道4可能是实验操作误差，造成模板不完全，重复试验获得156bp条带，说明编号为1的待测样本也感染TuMV病毒。

将泳道3-11得到的156bp大小的目的片段分别测序，结果如下：

泳道3的感染Lu2的四月慢油菜病叶的粗提液的156bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列1的同源性为96.8％。；

泳道4的编号为1待测样本的156bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列1的同源性为97.4％(结果为重复试验获得156bp条带后补测)；

泳道5的编号为2待测样本的粗提液的156bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列1的同源性为96.2％；

泳道6的编号为3待测样本的粗提液的156bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列1的同源性为96.2％；

泳道7的编号为4待测样本的粗提液的156bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列1的同源性为97.4％；

泳道8的编号为5待测样本的粗提液的156bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列1的同源性为97.4％；

泳道9的感染C1的四月慢油菜病叶的粗提液的156bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列1的同源性为96.2％；

泳道10的感染C3的四月慢油菜病叶的粗提液的156bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列1的同源性为96.2％；

泳道11的感染C4的四月慢油菜病叶的粗提液的156bp大小的目的片段的核苷酸序列为序列表中序列1；

进一步证明GSP1组合4的检测准确率高，且方法正确。

图6为用GSP2组合8对TuMV的快速检测结果，其中，1：空白对照；2：负对照；3：感染Lu2的四月慢油菜病叶的粗提液；4：编号为1待测样本的粗提液；5：编号为2待测样本的粗提液；6：编号为3待测样本的粗提液；7：编号为4待测样本的粗提液；8：编号为5待测样本的粗提液；9：感染C1的四月慢油菜病叶的粗提液；10：感染C3的四月慢油菜病叶的粗提液；11：感染C4的四月慢油菜病叶的粗提液；M：100bp plus DNA ladder。可以看出，3-11均得到377bp大小的目的片段，说明编号1-5的待测样本均感染TuMV病毒。证明GSP2组合8检测的准确性高。

将泳道3-11得到的377bp大小的目的片段分别测序，结果如下：

泳道3的感染Lu2的四月慢油菜(病症明显)病叶的粗提液的377bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列2同源性为99.2％；

泳道4的编号为1待测样本的粗提液的377bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列2的同源性为98.1％；

泳道5的编号为2待测样本的粗提液的377bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列2的同源性为99.7％；

泳道6的编号为3待测样本的粗提液的377bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列2的同源性为99.5％；

泳道7的编号为4待测样本的粗提液的377bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列2的同源性为99.2％；

泳道8的编号为5待测样本的粗提液的377bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列2的同源性为99.2％；

泳道9的感染C1的四月慢油菜病叶的粗提液的377bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列2的同源性为99.2％；

泳道10的感染C3的四月慢油菜病叶的粗提液的377bp大小的目的片段的核苷酸序列与序列表中序列2的同源性为98.1％；

泳道11的感染C4的四月慢油菜病叶的粗提液的377bp大小的目的片段的核苷酸序列为序列表中序列2。

进一步证明GSP2组合8的检测准确率高，且方法正确。

实施例2、一步法多重RT-PCR检测

为了简化检测方法，在一步法RT-PCR的基础上进一步开发了多重RT-PCR。两套GSP引物可以在同一体系内工作，互不影响，该一步法多重RT-PCR可应用于实际生产中TuMV的快速检测。

按照实施例1的二中2的1)的反应体系和反应程序进行一步法多重RT-PCR扩增检测，其中不同的是引物为GSP1、GSP2、Oligo d(T)18Primers和Random Primer共同加入体系，模板分别为编号为1的待测样本粗提液、编号为2的待测样本粗提液和感染C4的四月慢油菜病叶的粗提液，以不感染任何病源的四月慢油菜为负对照。

若扩增产物为156bp和/或377bp大小，则感染或候选感染病毒TuMV；

结果如图7所示，1：空白对照(不加入模板)；2：负对照；3：编号为1的待测样本粗提液；4：编号为2的待测样本粗提液；5：感染C4的四月慢油菜病叶的粗提液，M：100bp plus DNA ladder，可以看出，4和5均得到156bp和377bp大小的目的片段(测序结果与实施例1的无显著差异)，说明编号为2的待测样本感染病毒TuMV，也进一步说明GSP1、GSP2、Oligo d(T)18Primers和Random Primer组成引物组能快速检测TuMV；泳道3仅377bp大小的目的片段清楚(可能和实验操作误差有关，测序结果与实施例1的无显著差异)。GSP1、GSP2、Oligo d(T)18Primers和Random Primer引物组合可以有效、准确检测TuMV。

以上结果说明，两套GSP引物可以在同一体系内工作，互不影响；因模板的完整性的影响，有时两对引物只有其中一对有阳性结果。若只用一对引物检测，会影响检测的准确性。而同时使用两对引物检测，只要其中一对有阳性结果，即可确认待测样本感染TuMV病毒。两对引物的检测结果相辅相成，保证了检测的准确性，可以看出，该一步法多重RT-PCR可适用TuMV的快速检测。

采用本实施例的上述方法，不同的是加入引物为GSP1和GSP2组成的引物组，结果与上述无显著差异。

从上述可以看出，本研究根据TuMV序列的保守区设计了两套特异性引物，当所提取的病毒RNA模板不完整时，两对引物相辅相成，确保了检测的准确性；当被检材料病症较明显时，确定了取样量对检测效率的影响；确定影响病症表型和检测效率的关键因素应该是和宿主叶片单位体积内的病毒含量有关，对那些病症较轻微或几乎不显证的材料需进一步使用纯化、浓缩后核酸混合物为检测模板。

Claims (10)

1.一种检测芜菁花叶病毒的引物组，为如下引物组C、引物组A或引物组B：

所述引物组C包括引物对a和引物对b；

所述引物组A包括引物对a；

所述引物组B包括引物对b；

所述引物对a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成；

所述引物对b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子组成。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：

所述引物组C还包括随机引物和Oligo d(T)18；

所述引物组A还包括随机引物和/或Oligo d(T)18；

所述引物组B还包括随机引物和/或Oligo d(T)18。

3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于：

所述引物组C由所述引物对a、所述引物对b、所述随机引物和所述Oligo d(T)18组成；

所述引物组A由所述引物对a、所述随机引物和/或所述Oligo d(T)18组成；

所述引物组B由所述引物对b、所述随机引物和/或所述Oligo d(T)18组成。

4.一种检测芜菁花叶病毒的PCR试剂，为如下1)-3)中的任意一种：

1)由权利要求1-3中任一所述的引物组中的所述引物组C、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；

2)由权利要求1-3中任一所述的引物组中的所述引物组A、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；

3)由权利要求1-3中任一所述的引物组中的所述引物组B、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成。

5.根据权利要求4所述的PCR试剂，其特征在于：

所述反转录酶为M-MLV；

所述各引物组中的所述引物对a和所述引物对b的各条引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为0.125μmol/L；

所述引物组A或所述引物组B中的所述随机引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为1.25μmol/L；

所述引物组A或所述引物组B中的所述Oligo d(T)18在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为0.625μmol/L。

6.一种检测芜菁花叶病毒的试剂盒，包括权利要求4或5所述的PCR试剂。

7.权利要求1-3任一所述的引物组、权利要求4或5的所述的PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在鉴定或辅助检测芜菁花叶病毒中的应用；

或权利要求1-3任一所述的引物组、权利要求4或5的所述的PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在制备鉴定或辅助检测芜菁花叶病毒产品中的应用；

或权利要求1-3任一所述的引物组、权利要求4或5的所述的PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在鉴定或辅助检测待测植物是否感染芜菁花叶病毒中的应用；

所述待测植物具体为萝卜、甘蓝或四月慢油菜。

8.一种鉴定或辅助检测待测植物是否感染芜菁花叶病毒的方法，包括如下步骤：以待测植物组织的RNA提取物作为模板，分别用权利要求4或5的所述PCR试剂或权利要求6所述试剂盒中的所述的引物组C、所述的引物组A或所述的引物组B进行一步RT-PCR扩增，得到扩增产物，

检测扩增产物，

若所述引物组C扩增产物的大小为156bp和/或377bp，则待测植物为或候选为感染芜菁花叶病毒；

若所述引物组A扩增产物的大小为156bp，则待测植物为或候选为感染芜菁花叶病毒；

若所述引物组B扩增产物的大小为377bp，则待测植物为或候选为感染芜菁花叶病毒。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述大小为156bp的扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列1或与其同源性大于90％的核苷酸序列；

所述大小为377bp的扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列2或与其同源性大于90％的核苷酸序列；

所述一步RT-PCR扩增的退火温度为55℃；

所述检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳；

所述待测植物为萝卜、甘蓝或四月慢油菜；

所述组织为叶片；

所述待测植物组织的RNA提取物按照如下方法制备：将所述待测植物叶片在提取液中研磨，得到研磨液，即得到RNA提取物，所述提取液由Tris、NaCl、EDTA、SDS和水组成；所述Tris在所述提取液中的终浓度为200mM，所述NaCl在所述提取液中的浓度为250mM，所述EDTA在所述提取液中的浓度为25mM、所述SDS在所述提取液中的浓度为0.5％(质量百分含量)；所述提取液的pH值为7.5；

所述研磨在23℃-28℃条件下进行。

10.权利要求8或9所述方法中的所述提取液在提取RNA中的应用；所述提取的温度具体为23℃-28℃。

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