CN102286637B

CN102286637B - 采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法

Info

Publication number: CN102286637B
Application number: CN 201110205107
Authority: CN
Inventors: 成巨龙; 赵磊; 胡翠华; 郝兴安; 满建云; 吴云锋
Original assignee: SHAANXI TOBACCO INSTITUTE; Northwest A&F University
Current assignee: SHAANXI TOBACCO INSTITUTE; Northwest A&F University
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2011-07-21
Publication date: 2013-10-16
Anticipated expiration: 2031-07-21
Also published as: CN102286637A

Abstract

本发明涉及采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法，其中该方法包括烟草病毒总RNA提取，RT-LAMP反应和电泳检测，确定病毒种类，其中烟草病毒选自黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草花叶病毒(TMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)中的2种或2种以上。本发明根据烟草病毒的外壳蛋白基因保守区设计了LAMP引物，采用一步法反转录环介导等温扩增技术建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测烟草多种主要病毒的方法。为烟草病毒的快速检测提供了新的手段。

Description

采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及一种采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法。

背景技术

烟草是全世界最主要的经济作物之一，中国的种植面积居世界首位，每年为国家增加财政收入2000～3000亿元。然而，随着产业的发展和种植面积的不断扩大，20世纪70年代以后，烟草病毒病危害逐年加重。在烟草田间，常表现为多种病毒混合侵染，给烟草生产造成重大损失，重病田减产20％-50％，夏烟减产70％以上，并呈现出随栽培品种的单一化及栽种面积的不断扩大而逐步加重的趋势。

危害中国的烟草病毒主要有黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus，CMV)、马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)、马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)、烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)、烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)和烟草脉带花叶病毒(Tobacco Vein BandingMosaic Virus，TVBMV)等十几种病毒。其中CMV、PVY、TEV、TMV和TVBMV危害最严重，可影响烟叶的产量和质量，造成重大经济损失。

目前烟草病毒病日益呈现复合侵染的趋势，对危害烟草的病毒进行有效和快速检测在预防和控制烟草病毒病上具有十分重要的现实意义。准确灵敏的病毒检测方法是植物病毒防治的基础。目前普遍采用的检测方法主要有指示植物法、电镜技术、免疫学技术和分子生物学检测等。但上述方法均存在不同的缺点，例如，所需试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等。

环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermalmplification，LAMP)是由T.Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列(Notomietal，2000)。迄今已建立了针对多种病原性细菌、病毒、真菌、寄生虫等的LAMP检测方法，在耐药性基因检测、家畜早期胚胎性别判定等方面也有相关报道。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。本发明根据烟草病毒的外壳蛋白基因保守区设计了LAMP引物，采用一步法反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测烟草五种主要病毒的方法。为烟草病毒的快速检测提供了新的手段。

发明内容

本发明提供了一种采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法，其中该方法包括烟草病毒总RNA提取，RT-LAMP反应和电泳检测，确定病毒种类，其中烟草病毒选自黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草花叶病毒(TMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)中的2种或2种以上，优选地引物组包含如下5组引物中2组或2组以上引物的引物组：

第1组引物，用于CMV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.1：5’-TCTACCGTGTGGGTGACA-3’；

SEQ ID NO.2：5’-GAGCACGGCGTACTTTCG-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.3：5’-CCGTCCGCGAACATAGCAGAG-GTCCGTAAAGTTCCTGCCTC-3’；

SEQ ID NO.4：5’-GCTGCATCTGGAGTCCAAGCC-TGTCGCCAATATCAGCGC-3’；

第2组引物，用于PVY病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.5：5’-CGCGCTATGCCTTTGACTT-3’；

SEQ ID NO.6：5’-TTGGAGAGACATCCTCGGT-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.7：5’-CAATGCTGCGGCCTTCATTTGA-GGTCACATCACGAACACCAG-3’；

SEQ ID NO.8：5’-TCAGCCCAACCTCGACTTTTCG-GCCTCTCTGTGTTCTCCTCT-3’；

第3组引物，用于TEV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.9：5’-AAAACGCGCAGCCAACAT-3’；

SEQ ID NO.10：5’-CGTACTGCAGCAGCTTTCA-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.11：5’-GGCATGTATGGTCGTTCCCTGT-GACACACTTCAGTGACCTGG-3’；

SEQ ID NO.12：5’-TTGTCACGCTATGCGTTCGACT-TTGCATATGCGCCTCCCT-3’；

第4组引物，用于TMV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.13：5’-GGAAACCTTCACCACAAGT-3’；

SEQ ID NO.14：5’-TATAGCGCTCCTTATGGC-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.15：5’-GCTGTGACTAACGGATCTAATACCG-AGGTTCCCTGACAGTGAC-3’；

SEQ ID NO.16：5’-GAAGTTGAAAATCAGGCGAACCC-TGCGTCGTCTACTCTACG-3’；

第5组引物，用于TVBMV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.17：5’-AACGGAATGTGGGTCATG-3’；

SEQ ID NO.18：5’-TGTCATGTCAGTCAAATTGC-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.19：5’-TGTTGGTTTGGCATGTTCCA-GATGGTGATGAACAGGTTG-3’；

SEQ ID NO.20：5’-TAGACAAATCATGGCACACTTTAGC-GGCATATACGGTTTCTCTGC-3’。

在一个具体的实施方案中，本发明所述的采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法，其包括如下步骤：

1)病毒总RNA的提取：

提取感染2种或2种以上病毒的烟草叶中的病毒总RNA；

2)RT-LAMP反应：

使用所述引物组中的外引物(F3和B3)和内引物(FIP和BIP)对病毒总RNA进行RT-LAMP反应，得扩增产物；

3)电泳检测：

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，判定烟草是否带毒。

1)病毒总RNA的提取：

提取感染2种或2种以上病毒的烟草叶中的病毒总RNA；

2)RT-LAMP反应：

3)SYBR Green I绿色荧光法检测扩增产物：

加入SYBR Green I后直接用肉眼观察，确定是否感染病毒。

在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中的引物浓度比例为：外引物(F3和B3)∶内引物(FIP和BIP)＝0.3-0.4∶1.2-1.6；优选地外引物(F3和B3)∶内引物(FIP和BIP)＝1∶4。

在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中的反应温度优选为59-65℃；对于PVY引物的反应温度更优选为65℃，对于CMV、TEV、TMV、和TVBMV引物的反应温度更优选为63℃。

在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中的Mg²⁺浓度优选为高于5mM，更优选为5mM。

烟草病毒病常为复合侵染，本发明经过优化和摸索实验条件建立了检测中国五种主要烟草病毒的方法，极大地提高检测效率，降低检测成本。本发明的方法具有快速、灵敏、高度特异性等特点。本发明的方法已经成功地应用于室内和田间烟草病毒病害复合侵染的同步检测。本发明证明了RT-LAMP是一种检测植物病毒的有效手段。

附图说明

图1为RT-LAMP结果电泳图，其中M1：MarkerIV，1为TEV感病样品，2为阴性对照，M2为Marker I；

图2为RT-LAMP荧光染料结果图，其中左边翠绿色为阳性，右边桔黄色为阴性对照；

图3为RT-LAMP结果电泳图，其中M1：MarkerIV，1-4TEV所用温度分别为65℃、63℃、61℃、59℃，M2：Marker I：

图4为RT-LAMP结果电泳图，其中M1：MarkerIV，1、2、3、4、5分别为CMV、PVY、TEV、TMV、TVBMV样品，6为阴性对照，M2为Marker I；

图5为RT-LAMP荧光染料结果图，其中1、2、3、4、5分别为CMV、PVY、TEV、TMV、TVBMV感病样品，6为阴性对照

图6为RT-PCR结果电泳图，其中M1：Marker I，1-6分别为pMD18-T-TEV质粒浓度为170ng/μl、130ng/μl、100ng/μl、75ng/μl、50ng/μl、25ng/μl，7-8为阴性对照，M2：MarkerIV；

图7为RT-LAMP结果电泳图，其中M1：MarkerIV，1-6分别为pMD18-T-TEV质粒浓度为170ng/μl、130ng/μl、100ng/μl75ng/μl、50ng/μl、25ng/μl，7为阳性对照，8为阴性对照，M2：Marker I；

图8为RT-PCR结果电泳图，其中M1：Marker I，1-7分别为用pMD18-T-TEV质粒稀释10³-10⁹倍做模板，8为阴性对照，M2：MarkerIV；

图9为RT-LAMP结果电泳图，其中M1：Marker IV，1-7分别为用pMD18-T-TEV质粒稀释10³-10⁹倍做模板，8为阴性对照，M2：Marker I；

图10为RT-LAMP荧光染料结果图，其中1-7分别为用pMD18-T-TEV质粒稀释10³-10⁹倍做模板，8为阴性对照；

图11为RT-PCR结果电泳图，其中M1：Marker I，1-6为感病样品，7为健康样品，8为阴性对照，M2：Marker IV；

图12为RT-LAMP结果电泳图，其中M1：Marker IV，1-6为感病样品，7为健康样品，8为阴性对照，M2：Marker I；

图13为RT-LAMP荧光染料结果图，其中1-6为感病样品，7为健康样品，8为阴性对照。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但下述实施例并不限制本发明。

材料与试剂

烟草健康叶片，病株叶片(CMV、PVY、TEV、TMV和TVBMV)分别采自中国陕西泾阳、洛南等地，采集叶片保存于-80℃冰箱中。

主要试剂：

Bst DNApolymerase购自NEB公司；

Betaine，MgSO₄购自Sigma公司；

RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；

M-MLV反转录酶购自Promega公司；

Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；

SYBR GreenI购自Invitrogen公司；

大肠杆菌(Escherichia.coli)JM109，DNA标准Marker1购自Voson公司；

胶回收试剂盒购自Bioteke公司。

实施例1

1.引物设计

首先本发明人从NCBI上下载了烟草五种主要病毒的CP基因的序列，(CMV，EF424775)(PVY，AM236802)(TEV，AY787757)(TMV，AF318213)(TVBMV，AM236820)使用Primer4.0(http://primerexplorer.jp/e/v4_manual/index.html)设计了多组引物，然后根据引物所在序列区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体GC含量以及Tm值等综合因素选择了每种病毒的引物。最后为每种烟草病毒选择了4条引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)。所述引物参见SEQID NO.1-20。TEV的RT-PCR的引物，本发明使用郑轩等的引物，参见SEQID NO.21-22。所有引物的信息见表1。

表1引物序列SEQ ID NO.1-22的信息：

2、RNA抽提

使用多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒(离心柱形)(Bioteke)，按照操作说明书方法，分别提取病株烟草叶片和健康烟草叶片的总RNA，最后溶于30μl洗脱缓冲液中，保存于-80℃冰箱中。

3、RT-LAMP反应体系

反应体系(25μl)如下：10×ThermoPol缓冲液2.5μl(20mM Tris-HCl，10mMKCl，2mM MgSO₄，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton X-100)，引物(F3和B3)0.4μM，引物(FIP和BIP)1.6μM，dNTPs 1mM，MgSO₄5mM，betaine 1M，M-MLV 10u，BstDNApolymerase(NEB)10u，模板RNA 2μl。反应条件为：对PVY为65℃恒温1h，对CMV、TEV、TMV、TVBMV为63℃恒温1h。YanhuaLiu等的RT-LAMP实验显示Mg²⁺浓度在高于5mM时反应良好，所以本试验中，将Mg²⁺浓度设置为5mM，针对每组不同的引物测试了不同的温度对反应的影响。

反应结果通过2％的琼脂糖凝胶电泳和加入SYBR Green I后直接用肉眼观察两种方法来分析。

4、RT-LAMP与RT-PCR灵敏性与特异性比较

为了比较RT-LAMP与RT-PCR灵敏性，本发明使用郑轩等的一对特异的包含TEV部分CP基因的引物。

RT-PCR过程如下：

RT-PCR反应体系为12.5μl，包含3.5μlDEPC处理水、0.5μl下游引物、1μlTEV的RNA，然后70℃水浴5分钟，接着冰置5分钟，然后加入1.75μlDEPC处理水、2.5μldNTPs(10mM)、2.5μl 5×M-MLV缓冲液(50mM Tri s-HCL、75mM KCL、3mM MgCl₂、10mM DTT)、0.5μl M-MLV反转录酶、0.25μlRNA酶抑制剂，然后42℃反应1h，接着95℃5分钟。

然后RT-PCR扩增产物用Biotake凝胶回收试剂盒回收后用DNA Ligation Kit(TaKaRa)连接到pMD18-T载体上，得到pMD18-T-TEV。将pMD18-T-TE转入大肠杆菌(Escherichia.coli)JM109中，培养后提取质粒，得到pMD18-T-TEV质粒。测得pMD18-T-TEV质粒初始浓度为170ng/μl。

进行了两组对照，一组中用pMD18-T-TEV质粒原浓度(170ng/μl)以及分别稀释到130ng/μl、100ng/μl、75ng/μl、50ng/μl、25ng/μl用来做RT-PCR与RT-LAMP的模板。另一组分别稀释10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹倍用来做RT-PCR与RT-LAMP的模板。

RT-PCR结果用2％的琼脂糖凝胶电泳分析，RT-LAMP结果用2％的琼脂糖凝胶电泳以及加入SYBR GreenI后直接用肉眼观察两种方法来分析。

在RT-PCR的特异性上，本发明用TEV的引物检测CMV、PVY、TEV、TMV和TVBMV的样品，结果只有TEV的为阳性，其他的都是阴性，表现为特异性良好。

在RT-LAMP的特异性上，本发明也采用TEV的LAMP引物来分别检测CMV、PVY、TEV、TMV和TVBMV的样品，结果也是只有TEV的为阳性，其他的为阴性，表现为特异性良好，即一组特异的LAMP引物只能检测对应的一种病毒。

实施例2、采用琼脂糖凝胶电泳法、SYBR Green I绿色荧光法检测RT-LAMP扩增产物

分别用琼脂糖凝胶电泳法、SYBR GreenI绿色荧光法检测RT-LAMP扩增产物。

RT-LAMP扩增产物在凝胶电泳图谱上阳性的呈梯状(图1，1)。

SYBR Green I荧光检测中，将SYBR GreenI的原液稀释10倍，取1μl加入反应管中，阳性为翠绿色(图2，左)，阴性为桔黄色(图2，右)。

本实验中采取两种方法检测RT-LAMP的结果，一种是加入SYBR GreenI直接用肉眼观察，另一种是用2％的琼脂糖凝胶电泳分析。在加入SYBR GreenI直接用肉眼观察时，本发明人发现阴性对照组在自然光照下一段时间后桔黄色会变浅，所以在实际操作中要注意不要长时间见光。一般情况下直接用第一种方法就可以很明显的区分出阴阳性的结果，在不确定时可用第二种方法验证。Mori Y等报道，可以根据LAMP在合成DNA时产生的大量焦磷酸根离子与镁离子形成的白色沉淀来判断LAMP的结果。在本实验中，在阳性管底观察到少量的白色沉淀，结果并不显著。

实施例3、不同温度对RT-LAMP反应的影响：

本发明对每组引物设置了不同的温度，现已TEV为例说明如下。对TEV在其它条件不变的情况下，分别用65℃、63℃、61℃、59℃这四个温度进行试验，结果在63℃和61℃时效果较好(图3)，用相同的方法，本发明找到了CMV、TMV、TVBMV的最佳温度为63℃，PVY为65℃。在最佳条件下五种病毒RT-LAMP凝胶电泳结果如图4，加入SYBR Green I荧光染料直接观察结果如图5。

实施例4、RT-LAMP与RT-PCR灵敏性比较：

进行两组对照，一组中用pMD18-T-TEV质粒原浓度(170ng/μl)以及分别稀释到130ng/μl、100ng/μl、75ng/μl、50ng/μl、25ng/μl用来做RT-PCR和RT-LAMP的模板。结果显示pMD18-T-TEV质粒浓度为170ng/μl时对RT-PCR没有影响(图6，1)，但是抑制了RT-LAMP反应(图7，1)。另一组分别稀释10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹倍用来做RT-PCR与RT-LAMP的模板。结果在稀释10⁸倍时RT-PCR已经检测不到(图8)，而RT-LAMP在稀释10⁹倍时还能检测到(图9)。RT-PCR在加入SYBR Green I荧光染料直接观察结果如图10。这也说明了RT-LAMP的灵敏性比RT-PCR要高100倍以上。

实施例5、RT-PCR和RT-LAMP检测田间样品：

分别用RT-PCR和RT-LAMP两种方法检测了多个田间样品，结果两种方法的检测结果是一致的。部分检测结果如图11，图12，图13。

RT-LAMP检测方法不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单，而且有快速高效、高特异性、高灵敏性的特点，其应用范围越来越广泛，已经在病原微生物检测中发挥出极大的优势，并成功应用于肿瘤基因的相关研究中。用本实验中描述的RT-LAMP方法与RT-PCR方法同时检测了多个烟草病株样品，其结果一致，很明显的是用RT-LAMP方法可以节省大量的时间，而且操作简单。总之，本发明建立了一套快速、简便、特异、灵敏的检测烟草上五种主要病毒的方法。因此，有理由相信RT-LAMP作为一种分子生物学的快速检测方法，将会有更广阔的应用前景。

本发明的方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

参考文献

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Claims

1.一种采用反转录环介导等温扩增技术检测多种烟草病毒的方法，其中该方法包括烟草病毒总RNA提取，RT-LAMP反应和电泳检测，确定病毒种类，其中烟草病毒选自黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草花叶病毒(TMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)中的2种或2种以上，其中RT-LAMP反应采用的引物是包含如下5组引物SEQID NO.1-20的引物组：

第1组引物，用于CMV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.1：5’-TCTACCGTGTGGGTGACA-3’；

SEQ ID NO.2：5’-GAGCACGGCGTACTTTCG-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.3：5’-CCGTCCGCGAACATAGCAGAG-GTCCGTAAAGTTCCTGCCTC-3’；

SEQ ID NO.4：5’-GCTGCATCTGGAGTCCAAGCC-TGTCGCCAATATCAGCGC-3’；

第2组引物，用于PVY病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.5：5’-CGCGCTATGCCTTTGACTT-3’；

SEQ ID NO.6：5’-TTGGAGAGACATCCTCGGT-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.7：5’-CAATGCTGCGGCCTTCATTTGA-GGTCACATCACGAACACCAG-3’；

SEQ ID NO.8：5’-TCAGCCCAACCTCGACTTTTCG-GCCTCTCTGTGTTCTCCTCT-3’；

第3组引物，用于TEV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.9：5’-AAAACGCGCAGCCAACAT-3’；

SEQ ID NO.10：5’-CGTACTGCAGCAGCTTTCA-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.11：5’-GGCATGTATGGTCGTTCCCTGT-GACACACTTCAGTGACCTGG-3’；

SEQ ID NO.12：5’-TTGTCACGCTATGCGTTCGACT-TTGCATATGCGCCTCCCT-3’；

第4组引物，用于TMV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.13：5’-GGAAACCTTCACCACAAGT-3’；

SEQ ID NO.14：5’-TATAGCGCTCCTTATGGC-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.15：5’-GCTGTGACTAACGGATCTAATACCG-AGGTTCCCTGACAGTGAC-3’；

SEQ ID NO.16：5’-GAAGTTGAAAATCAGGCGAACCC-TGCGTCGTCTACTCTACG-3’；

第5组引物，用于TVBMV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.17：5’-AACGGAATGTGGGTCATG-3’；

SEQ ID NO.18：5’-TGTCATGTCAGTCAAATTGC-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.19：5’-TGTTGGTTTGGCATGTTCCA-GATGGTGATGAACAGGTTG-3’；

SEQ ID NO.20：5’-TAGACAAATCATGGCACACTTTAGC-GGCATATACGGTTTCTCTGC-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该方法包括如下步骤：

1)病毒总RNA的提取：

提取感染2种或2种以上病毒的烟草叶中的病毒总RNA；

2)RT-LAMP反应：

3)电泳检测：

3.根据权利要求2所述的方法，其中RT-LAMP反应中的引物浓度比例为：外引物(F3和B3)∶内引物(FIP和BIP)＝0.3-0.4∶1.2-1.6。

4.根据权利要求3所述的方法，其中RT-LAMP反应中的引物浓度为外引物(F3和B3)∶内引物(FIP和BIP)＝1∶4。

5.权利要求2所述的方法，其中RT-LAMP反应中的反应温度为59-65℃。

6.权利要求5所述的方法，其中RT-LAMP反应中，对于PVY引物的反应温度为65℃，对于CMV、TEV、TMV、和TVBMV引物的反应温度为63℃。

7.权利要求2所述的方法，其中RT-LAMP反应中的Mg²⁺浓度高于5mM。