CN103667530B - 一种番茄褪绿病毒的逆转录环介导等温检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种番茄褪绿病毒的逆转录环介导等温检测方法。本发明公开的一组引物，由如下（1）-（4）所示的DNA分子组成：（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。本发明公开的一种快速、灵敏、高度特异的检测番茄褪绿病毒的方法，为该病毒的快速检测提供了新的手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种番茄褪绿病毒的逆转录环介导等温检测方法。
背景技术
番茄褪绿病毒（Tomato Chlorosis Virus,ToCV）为长线形病毒科（Closteroviridae）毛型病毒属（Crinivirus）成员，主要侵染番茄和辣椒，在农业生产上造成严重危害。该病毒于1998年在佛罗里达州首次报道，然后在法国、意大利、巴西、以色列等世界各地相继发现，可侵染番茄等重要农作物，在番茄上产生的典型症状为发病初期叶片脉间变黄，后期叶片发红，叶脉颜色加深，叶片增厚，极大降低了番茄产量与品质。番茄褪绿病毒可通过多种方式传播，包括种苗调运、粉虱带毒等。
目前，ToCV在中国仅有2例报道，分别为山东和北京，且在山东多个番茄产区都已检测到，该病毒可造成番茄减产甚至绝产的严重后果。
环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)最早是由Notomi T等在2000年发明的，是一种基于高灵敏链置换技术的恒温核酸扩增方法，其工作原理为：针对靶基因的6个区域设计了4个特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶-Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，反应产物既可通过电泳紫外观察，亦可通过荧光染色直接目测。该方法操作简便，无需特殊仪器(如PCR仪)，而且检测结果准确，是一种快捷而有效的检测方法。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病的检测和快速诊断。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。
由于ToCV为国内新发现的病毒，所以国内对于该病毒的研究较少，目前国际上对于该病毒的检测还仅仅限于分子生物学检测方法，其中以RT-PCR最为常见，但是PCR需要30-35个循环反应（较费时）及特殊的仪器（PCR仪）且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员有较高的技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广。而LAMP方法很好的克服了当前这类方法的不足，LAMP技术反应时间短，无需特殊仪器，检测灵敏度高，特异性好，目前尚未见利用LAMP技术检测番茄褪绿病毒的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种番茄褪绿病毒的逆转录环介导等温检测方法。
本发明提供的一组引物，由如下（1）-（4）所示的DNA分子组成：
（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；
（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；
（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；
（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。
一种检测番茄褪绿病毒的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含所述的引物、反转录酶和Bst DNA聚合酶；
所述反转录酶为M-MLV反转录酶或AMV反转录酶。
一种检测番茄褪绿病毒的方法也属于本发明的保护范围，该方法是以待测样品的总RNA为模板，以所述的引物为引物进行逆转录环介导等温核酸扩增，若得到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选含有番茄褪绿病毒，若得不到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选不含有番茄褪绿病毒。
上述方法中，所述逆转录环介导等温核酸扩增产物是否得到的判断方法为如下（1）和/或（2）：
（1）将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为含有番茄褪绿病毒的样品，不具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为不含有番茄褪绿病毒的样品；
(2)将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物与SYBR Green I反应得反应液，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有番茄褪绿病毒的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有番茄褪绿病毒的样品。
上述任一所述的方法中，所述引物中SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为外引物，SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子为内引物；
所述外引物中SEQ ID No.1所示的DNA分子与SEQ ID No.2所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1；
所述内引物中SEQ ID No.3所示的DNA分子与SEQ ID No.4所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1。
所述外引物与所述内引物在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比具体为1:4。
上述任一所述的方法中，所述逆转录环介导等温核酸扩增中的反应温度为60℃。
上述任一所述的方法中，所述逆转录环介导等温核酸扩增中的反转录酶的浓度为8U/μL；
所述反转录酶的商品名称具体为M-MLV反转录酶，购自TaKaRa公司，产品目录号为2641A。
上述任一所述的方法中，所述逆转录环介导等温核酸扩增的体系如下：
10×Thermopol buffer2.5μL，SEQ ID No.1所示的DNA分子0.2μM，SEQ ID No.2所示的DNA分子0.2μM，SEQ ID No.3所示的DNA分子0.8μM，SEQ ID No.4所示的DNA分子0.8μM，dNTPs2.5mM，MgCl24mM，反转录酶200U，Bst DNA聚合酶12U，所述待测样品的总RNA40ng，余量为ddH2O，体系25μL；
所述10×Thermopol buffer购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为M0275；
所述反转录酶为M-MLV反转录酶或AMV反转录酶；
所述Bst DNA聚合酶的商品名称为Bst DNApolymerase，购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为M0275；
所述逆转录环介导等温核酸扩增的反应条件为：60℃恒温1h；80℃5min。
上述任一所述的方法中，所述M-MLV反转录酶购自TaKaRa公司，产品目录号为2641A；
所述样品具体为待测样品的叶片。
上述引物在检测番茄褪绿病毒中的应用也属于本发明的保护范围；
和/或，
上述试剂盒在检测番茄褪绿病毒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明建立的一种快速、灵敏、高度特异的检测番茄褪绿病毒的方法，为该病毒的快速检测提供了新的手段。
附图说明
图1为RT-LAMP方法检测番茄褪绿病毒的引物筛选电泳结果。
图2为RT-LAMP方法检测番茄褪绿病毒的引物筛选荧光染色结果。
图3为RT-LAMP反应体系优化结果电泳检测。
图4为RT-LAMP反应体系优化结果荧光染色检测。
图5为电泳分析RT-LAMP方法检测番茄褪绿病毒的特异性。
图6为荧光染色分析RT-LAMP方法检测番茄褪绿病毒的特异性。
图7为电泳分析RT-LAMP方法检测番茄褪绿病毒的灵敏性。
图8为荧光染色分析RT-LAMP方法检测番茄褪绿病毒的灵敏性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
未感染任何病毒的番茄、感染番茄褪绿病毒的番茄、感染CMV（黄瓜花叶病毒）的番茄和感染TMV（烟草花叶病毒）的番茄均采自中国寿光，采集样品保存于-80℃冰箱中。
Bst DNApolymerase购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为M0275。
M-MLV反转录酶购自TaKaRa公司，产品目录号为2641A。
dNTPs购自TaKaRa公司，产品目录号为4019。
SYBR GreenⅠ购自Invitrogen公司。
10×Thermopol buffer购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为M0275。
实施例1、番茄褪绿病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法
一、引物设计：
根据NCBI上已报道的番茄褪绿病毒核酸序列，利用LAMP引物设计软件PrimerExplorer V4设计6套特异引物，引物序列如下：
第一组引物：
F3:5’-CCGGTCTTATTAAGCCTGAT-3’；
B3:5’-GCAACCAGTTATCGATGCA-3’；
FIP:5’-CATCTGAGATATTCATCAACGAACC-TCAAACATGGCGTATTACCAAG-3’；
BIP:5’-CTCGAACCTGCTTATGAAAAGAAAC-GTTAACGTTGTACAGTTCCTTGCC-3’。
第二组引物：
F3:5’-GGTTCGTTGATGAATATCTCAGATG-3’；
B3:5’-TAATAGAAACCCCCACCG-3’；
FIP:5’-ACAGTTCCTTGCCCTCGTTA-ACTTATCTCGAACCTGCT-3’；
BIP:5’-ACAACGTTAACCAACTTGCATC-GAGATCCTCTTGATCCTCAT-3’。
第三组引物：
F3:5’-AAGGACGACATAATGCGG-3’；
B3:5’-GCATTTTCGTAGACAAGACTCT-3’；
FIP:5’-ACTTTGGGAAAAGTCCCACCTT-GATGGTAAGACCAATTCAGCT-3’；
BIP:5’-ATCCCATCTACAATGATGTCAACC-TTCATAACCTCCGTGTGTC-3’。
第四组引物：
F3:5’-CCCATCTACAATGATGTCAAC-3’；
B3:5’-CTCGAAAAAGTGTCAGGAAT-3’；
FIP:5’-CGTGCATTTTCGTAGACAAGAC-CGTGGTTAGTATATCCAGACA-3’；
BIP:5’-GGTTGCTGATCATATCATAAGGGA-TGGTCAACCGATAAGTGTT-3’。
第五组引物：
F3:5’-CTGCCTCATCTCATTTGATG-3’；（SEQ ID No.1）
B3:5’-GTTTCATACTGTCCGGTCT-3’；（SEQ ID No.2）
FIP:5’-GTTCTGTGCAAAAATTGCATCC-GTCAACGATTTTATGTCAGTGG-3’；（SEQ IDNo.3）
BIP:5’-ACCTGTTGAGAAGATGGTCCTT-GCCAAGAATTTTCGAGACA-3’。（SEQ ID No.4）
第六组引物：
F3:5’-CGGTTGACCATTGAAGGT-3’；
B3:5’-GACCATCTTCTCAACAGGT-3’；
FIP:5’-GACCACTGACATAAAATCGTTGACT-CTGACACTTTTTCGAGACCT-3’；
BIP:5’-AACCCGGGATTAGCTTGGAT-GGCATGTCAAAATCACCATAC-3’。
二、提取感染番茄褪绿病毒的番茄叶片的总RNA为实验组，同时提取未感染任何病毒的番茄叶片的总RNA为阴性对照组。
三、逆转录环介导等温核酸扩增（RT-LAMP）反应
反应体系如下：
10×Thermopol buffer2.5μL（20mM Tris-HCl，10mM KCl，2mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，体积百分含量0.1%的Triton X-100），10μM的引物（F3和B3）各0.5μL，10μM的引物（FIP和BIP）各2.0μL，10mM的dNTPs2.5μL，25mM的MgCl24μL，200U/μL的M-MLV反转录酶0.5μL，8000U/mL的Bst DNApolymerase1.5μL，20ng/uL的模板RNA2.0μL，ddH2O补足体系至25μL。
反应条件：60℃恒温1h；80℃5min。
模板RNA分别为步骤二提取的实验组或阴性对照的总RNA。
经过上述反应得到实验组和阴性对照组的RT-LAMP反应产物。
四、RT-LAMP反应产物的检测
（一）电泳检测：分别取5μL实验组和阴性对照组的RT-LAMP反应产物经1.5％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和155V电压条件下电泳25min，将凝胶在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后置于凝胶成像系统中观察。
结果如图1所示。
图1中，M：Trans2K Plus DNA Marker，1-6依次为6组引物检测感染番茄褪绿病毒的番茄的RT-LAMP反应产物，7-12依次为6组引物检测未感染任何病毒的番茄（阴性对照组）的RT-LAMP反应产物。
图1表明，在以感染番茄褪绿病毒的番茄的叶片的总RNA为模板的6组引物中，可以观察到第5组引物的RT-LAMP反应产物呈弥散状的核酸泳带，而其余5组引物的RT-LAMP反应产物则没有弥散状核酸电泳带，在以未感染任何病毒的番茄的叶片的总RNA为模板的6组引物的RT-LAMP反应产物中均无核酸电泳条带。
（二）荧光染料检测：分别向20μL体积实验组和阴性对照组的RT-LAMP反应产物中加入2.5μL SYBR Green I(1∶1000)（1:1000是指按照取1μL SYBR Green I加入999μL ddH2O的比例稀释SYBR Green I），染色5min后观察结果。
结果如图2所示。
图2中，1-6依次为6组引物检测感染番茄褪绿病毒的番茄的RT-LAMP反应产物的荧光染色结果，7-12依次为6组引物检测未感染任何病毒的番茄的RT-LAMP反应产物（阴性对照组）的荧光染色结果。
图2表明，在以感染番茄褪绿病毒的番茄叶片的总RNA为模板的6组引物中，可以观察到第5组引物的RT-LAMP反应产物染色后呈翠绿色，反应为阳性，而其余5组引物的RT-LAMP反应产物以及以未感染任何病毒的番茄叶片的总RNA为模板的6组引物的RT-LAMP反应产物保持染料的橙色，反应为阴性。
实施例2、RT-LAMP检测体系的优化
通过实例1可以筛选出最优的引物为第五组引物，但是第五组引物的核酸电泳条带不是十分清晰，所以通过对构建体系的主要影响的两个因素M-MLV反转录酶浓度和内外引物浓度比筛选，确定最优检测体系。
反应体系(25μL)如下：
A：10×Thermopol buffer2.5μL（20mM Tris-HCl，10mM KCl，2mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，体积百分含量0.1%的Triton X-100），第五组引物中10μM的引物（F3和B3）各为0.5μL，第五组引物中10μM的引物（FIP和BIP）各为2.5μL，dNTPs2.5mM，MgCl24mM，200U/μL M-MLV反转录酶0.5μL，8000U/mL的Bst DNApolymerase1.5μL，20ng/μL的模板RNA2.0μL，ddH2O补足体系至25μL；
B：10×Thermopol buffer2.5μL（20mM Tris-HCl，10mM KCl，2mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，体积百分含量0.1%的Triton X-100），第五组引物中10μM的引物（F3和B3）各为0.5μL，第五组引物中10μM的引物（FIP和BIP）各为2.0μL，dNTPs2.5mM，MgCl24mM，200U/μL M-MLV反转录酶1.0μL，8000U/mL的Bst DNApolymerase1.5μL，20ng/μL的模板RNA2.0μL，ddH2O补足体系至25μL；
C：10×Thermopol buffer2.5μL（20mM Tris-HCl，10mM KCl，2mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，体积百分含量0.1%的Triton X-100），第五组引物中10μM的引物（F3和B3）各为0.5μL，第五组引物中10μM的引物（FIP和BIP）各为2.5μL，dNTPs2.5mM，MgCl24mM，200U/μL M-MLV反转录酶1.0μL，8000U/mL的Bst DNApolymerase1.5μL，20ng/μL的模板RNA2.0μL，ddH2O补足体系至25μL；
D：10×Thermopol buffer2.5μL（20mM Tris-HCl，10mM KCl，2mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，体积百分含量0.1%的Triton X-100），第五组引物中10μM的引物（F3和B3）各为0.5μL，第五组引物中10μM的引物（FIP和BIP）各为2.0μL，dNTPs2.5mM，MgCl24mM，200U/μL M-MLV反转录酶0.5μL，8000U/mL的Bst DNApolymerase1.5μL，20ng/μL的模板RNA2.0μL，ddH2O补足体系至25μL。
提取感染番茄褪绿病毒的番茄叶片的总RNA为实验组，同时提取未感染任何病毒的番茄叶片的总RNA为阴性对照组，以各样品的RNA为模板分别进行上述反应，得到RT-LAMP反应产物。
反应条件：60℃恒温1h；80℃5min。
RT-LAMP反应产物的检测如实施例1中步骤四。
电泳检测结果如图3所示。
图3中，M：Trans2K Plus DNA Marker，1-4依次为以感染番茄褪绿病毒的番茄叶片的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应的产物，5-8依次为以未感染任何病毒的番茄叶片（阴性对照组）的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应的产物。
图3表明，以感染番茄褪绿病毒的番茄的总RNA为模板的B体系得到的RT-LAMP反应产物呈明亮的弥散状核酸电泳带，A体系的RT-LAMP反应产物的核酸电泳带较弱，C和D体系的RT-LAMP反应产物的核酸电泳带不清晰，阴性对照组中均无核酸电泳带。
荧光染色检测结果如图4所示。
图4中，1-4依次为以感染番茄褪绿病毒的番茄的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应的产物的荧光染色结果，5-8依次为以未感染任何病毒的番茄（阴性对照组）的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应的产物的荧光染色结果。
图4表明，以感染番茄褪绿病毒的番茄的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应的产物的荧光染色结果均呈现翠绿色，反应为阳性，其中B体系的RT-LAMP反应的产物的翠绿色荧光最强，以未感染任何病毒的番茄（阴性对照组）的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应产物的荧光染色结果均呈橙色，反应为阴性。
以上结果说明B体系为最优体系。
实施例3、RT-LAMP方法检测番茄褪绿病毒的特异性
提取感染番茄褪绿病毒的番茄、感染CMV（黄瓜花叶病毒）的番茄、感染TMV（烟草花叶病毒）的番茄和未感染任何病毒的番茄样品（阴性对照）的叶片的总RNA，按实施例2的方法采用B体系对各组样品进行RT-LAMP反应。
电泳检测结果如图5所示。
图5中，M为DNA marker；泳道1为感染番茄褪绿病毒的番茄的RT-LAMP反应产物；泳道2为感染CMV（黄瓜花叶病毒）的番茄的RT-LAMP反应产物；泳道3为感染TMV（烟草花叶病毒）的番茄的RT-LAMP反应产物；泳道4为阴性对照组的RT-LAMP反应产物。
图5表明，感染番茄褪绿病毒的番茄的RT-LAMP反应产物可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带，而未感染番茄褪绿病毒的番茄的RT-LAMP反应产物均没有核酸电泳条带。
荧光染色检测结果如图6所示。
图6中，1为感染番茄褪绿病毒的番茄的RT-LAMP反应产物的荧光染色结果；2为感染CMV（黄瓜花叶病毒）的番茄的RT-LAMP反应产物的荧光染色结果；3为感染TMV（烟草花叶病毒）的番茄的RT-LAMP反应产物的荧光染色结果；4为阴性对照组的RT-LAMP反应产物的荧光染色结果。
图6表明，感染番茄褪绿病毒的番茄的RT-LAMP反应产物荧光染色结果均呈现翠绿色，反应为阳性，其他未感染番茄褪绿病毒的番茄的RT-LAMP反应产物荧光染色结果均呈橙色，反应为阴性。
结果表明，按实施例2的方法采用B体系能够特异地检测番茄褪绿病毒，且与其它病毒无交叉反应。
实施例4、RT-LAMP方法检测番茄褪绿病毒的灵敏性
提取感染番茄褪绿病毒的番茄叶片的总RNA，RNA浓度为20ng/μL，用ddH2O将提取的RNA作101-108的倍比稀释，制成不同浓度的RNA。按照实施例2的方法采用B体系对各浓度的RNA以及ddH2O（作为空白对照）进行RT-LAMP反应。
电泳检测结果如图7所示。
图7中，M为DNA marker；泳道1为10倍稀释组；泳道2为102倍稀释组；泳道3为103倍稀释组；泳道4为104倍稀释组；泳道5为105倍稀释组；泳道6为106倍稀释组；泳道7为107倍稀释组；泳道8为108倍稀释组；泳道9为空白对照组。
图7表明，以各稀释度的感染番茄褪绿病毒的番茄的RNA为模板进行RT-LAMP反应的产物均可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带，而空白对照组没有核酸电泳条带。
荧光染色检测结果如图8所示。
图8中，1为10倍稀释组；2为102倍稀释组；3为103倍稀释组；4为104倍稀释组；5为105倍稀释组；6为106倍稀释组；7为107倍稀释组；8为108倍稀释组；9为空白对照组。
图8表明，当20ng/μL的感染番茄褪绿病毒的番茄叶片的总RNA在稀释108倍时，按实施例2的方法采用B体系进行RT-LAMP反应的产物SYBR Green I染色后，还能呈现特异的翠绿色荧光，说明采用实施例2的RT-LAMP方法采用B体系进行检测番茄褪绿病毒灵敏性很高。
Claims (7)
1.一组引物，由如下（1）-（4）所示的DNA分子组成：
（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；
（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；
（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；
（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。
2.一种检测番茄褪绿病毒的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物、反转录酶和Bst DNA 聚合酶；
所述反转录酶为M-MLV反转录酶或AMV反转录酶。
3.一种检测番茄褪绿病毒的方法，该方法是以待测样品的总RNA为模板，以权利要求1所述的引物为引物进行逆转录环介导等温核酸扩增，若得到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选含有番茄褪绿病毒，若得不到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选不含有番茄褪绿病毒；
所述逆转录环介导等温核酸扩增的体系如下：
10×Thermopol buffer 2.5μL， SEQ ID No.1所示的DNA分子0.2μM，SEQ ID No.2所示的DNA分子0.2μM，SEQ ID No.3所示的DNA分子0.8μM，SEQ ID No.4所示的DNA分子0.8μM，dNTPs 2.5mM，MgCl2 4mM，反转录酶 200U，Bst DNA 聚合酶12U，所述待测样品的总RNA 40ng，余量为ddH2O，体系25μL；
所述逆转录环介导等温核酸扩增的反应条件为：60℃恒温1h；80℃ 5min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述逆转录环介导等温核酸扩增产物是否得到的判断方法为如下（1）和/或（2）：
（1）将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为含有番茄褪绿病毒的样品，不具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为不含有番茄褪绿病毒的样品；
(2)将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物与SYBR Green I反应得反应液，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有番茄褪绿病毒的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有番茄褪绿病毒的样品。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述权利要求1所述的引物中SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为外引物，SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子为内引物；
所述外引物中SEQ ID No.1所示的DNA分子与SEQ ID No.2所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1；
所述内引物中SEQ ID No.3所示的DNA分子与SEQ ID No.4所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1；
所述外引物与所述内引物在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:4。
6.权利要求1所述的引物在检测番茄褪绿病毒中的应用。
7.权利要求2所述的试剂盒在检测番茄褪绿病毒中的应用。
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| Complete sequence of the RNA1 of a European isolate of tomato chlorosis virus;G. Lozano等;《Arch Virol》;20071231;第152卷;839-841 * |
| Rapid discrimination of Tomato chlorosis virus, Tomato infectious chlorosis virus and co-amplification of plant internal control using real-time RT-PCR;Lambros C. Papayiannis等;《Journal of Virological Methods》;20111231;第176卷;53-59 * |
| The complete nucleotide sequence and genome organization of tomato chlorosis virus;W. M.Wintermantel等;《Arch Virol》;20051231;第150卷;2287-2298 * |
| 环介导恒温扩增技术(LAMP)及其在植物病毒检测中的研究进展;秦文韬等;《中国农学通报》;20130731;第29卷(第21期);170-174 * |
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