CN105907892A - 检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan探针和引物及其应用 - Google Patents

检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan探针和引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan探针和引物及其应用。检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan探针，探针的5’端标记FAM，3’端标记BHQ1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan引物，该引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明针对传毒介体烟粉虱，选取ToCV保守序列设计TaqMan PCR引物及探针，建立快速检测单头烟粉虱体内携带ToCV病毒的TaqMan实时荧光定量PCR的方法，该扩增方法灵敏度高，特异性强，2小时内便可出结果，快速且检测结果可靠。

Description

检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan探针和引物及其 应用
技术领域
本发明涉及一种检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan探针和引物及其应用，属于生物技术技术领域。
背景技术
1998年，番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus，ToCV)首次在美国佛罗里达州的番茄上发现，目前在全球热带、亚热带、温带地区均有发生，广泛分布于欧洲、美洲、中东、非洲、以及亚洲等众多国家和地区。ToCV的寄主范围十分广泛，可以侵染来自15个属的30多种植物，给农业生产造成严重经济损失。近年来，在我国台湾、北京、山东、南京和天津等地相继发现ToCV为害辣椒、番茄作物，部分地区病株率达到20％-100％，作物减产10％-40％，ToCV在中国地区迅猛扩散的态势不容忽视。
ToCV是一种长线形病毒科(Closteroviridae)，毛形病毒属(Crinivirus)的RNA病毒。ToCV侵染植株后，导致感病植株的叶片由下部向上部逐步发病，发病初期，叶脉保持绿色，脉间发黄，叶片变厚；发病后期，整个叶片由边缘向内开始坏死，最后整个植株死亡。目前尚未育出效果突出的抗ToCV品种，ToCV病害的防治较困难，且病毒传播媒介本身的防控也存在很大难度，这使得病害的及时监测变得尤为重要。
ToCV无法通过种子、汁液等方法进行传毒，仅通过介体烟粉虱(Bemisia tabaci)、温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、纹翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)等进行传播，在国内主要靠烟粉虱以持久性方式进行传毒。目前，我国烟粉虱生物型有Q型、B型、FJ-1型、ZHJ-1型、ZHJ-2型和ZHJ-3型，其中Q型和B型烟粉虱(分别简称Q烟粉虱和B烟粉虱)是两种重要的入侵性烟粉虱。近年，Q烟粉虱逐渐取代B烟粉虱，在全国范围内大面积爆发，加快了ToCV的扩散蔓延，且带毒烟粉虱的虫口密度是导致ToCV流行的主要原因。
以往对ToCV的研究多集中在感病的植物组织，很少研究传毒介体烟粉虱。等人们在植株中观察或检测到ToCV时，ToCV往往已在田间流行起来，这时防控已晚。若在作物发病前，能有一种方法精准检测传毒介体烟粉虱的带毒情况，从而准确预测作物上的病害发生情况，为及时防控ToCV争取最佳时间，是控制ToCV发生流行的最好途径。现有的检测技术中，常用方法是血清学检测法和RT-PCR法，但暂无症状的ToCV植株或单头带毒烟粉虱，ToCV的含量很低，用血清学的方法常常会出现漏检和误检的情况；普通RT-PCR的检测方法，虽然检测灵敏度比血清学的方法高，但容易造成样品的交叉污染，对感病样品的带毒量也不能定量。而TaqMan探针实时荧光定量PCR方法比上述两种方法的灵敏性都要高，且可以准确定量样品中的病毒含量，目前还没有报道单头烟粉虱体内检测ToCV的TaqMan探针实时荧光定量法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan探针和引物及利用实时荧光定量PCR检测烟粉虱携带番茄褪绿病毒的方法。
术语说明：
FAM：是6-羧基荧光素，一种常用的荧光基团，用于标记核苷酸和核酸，发射光呈绿色。
BHQ1：是Biosearch Technologies公司的黑洞淬灭基团之一，对于双标探针、分子信标和FRET探针非常有效，对绿色至黑色发射光谱中的所有染料都有极好的光谱重叠效应。
本发明的技术方案如下：
检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan探针，探针的5’端标记FAM，3’端标记BHQ1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该TaqMan探针命名为ToCV-probe6724：
ToCV-probe6724：5’(FAM)-TAACATTCGGCACTTCC-(BHQ1)3’；
检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan引物，该引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。上述引物核苷酸序列如下：
ToCV-F6680：5’-TTTCTCAAAGGATCAAGCTGTGTT-3’；SEQ ID NO.2
ToCV-R6799：5’-TGCGCTCCGGTATCAGTCTT-3’；SEQ ID NO.3
利用上述TaqMan探针和引物实时荧光定量PCR快速检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取单头待检测烟粉虱的RNA，经反转录，制得反转录产物；
(2)以步骤(1)制得的反转录产物为模板，利用上述TaqMan探针和引物，进行TaqMan实时荧光定量PCR分析，当有S型扩增曲线和Ct值出现时，则表示待检测烟粉虱中含有ToCV，否则，待检测烟粉虱中不含有ToCV。
根据本发明优选的，所述步骤(1)提取单头待检测烟粉虱的RNA，步骤如下：
1)将单头待检测烟粉虱置于含有80～150μL Trizol试剂的容器中，–80℃保存；检测时，置于冰上溶化，然后研磨后，加入250～400μL Trizol试剂，震荡混匀；
2)加入80～150μL氯仿，震荡混匀，4℃离心机13000rpm/min离心15min，取上清；
3)上清液中加入200～300μL异丙醇，震荡混匀，4℃离心机13000rpm/min离心15min，弃上清；
4)加入1mL由RNase free ddH2O配制的质量百分比浓度为75％的乙醇溶液，清洗RNA，4℃离心机13000rpm/min离心5min，弃上清，风干沉淀，制得RNA；
5)加入RNase free ddH2O，溶解RNA，即得。
所述步骤(1)中的反转录可采用市售反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagentKit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara：RR047a)进行反转录，具体操作步骤如下：
①基因组DNA的去除：在冰上配制反应液，使用10.0μL的反应体系，如下：
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，All Total RNA 7.0μL，RNase Free ddH20补至10.0μL；
反应条件：42℃2min；
②反转录：冰上配制反应液，20.0μL的反应体系，如下：
Reaction solution from Step 1 10.0μL，5×PrimeScript Buffer2 4.0μL,PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0μL,RT Primer Mix 1.0μL,RNase Free ddH20 4.0μL；
反应条件：37℃15min，85℃5s，-20℃保存；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，TaqMan实时荧光定量PCR的扩增体系如下，总体系20μL：
模板2.0μL；2×Premix ExTaq(Probe qPCR)10.0μL；10μM/μL ToCV-F6680 0.4μL；10μM/μL ToCV-F6799 0.4μL；10μM/μL ToCV-probe6724 0.8μL；ddH2O 6.4μL；
所述TaqMan PCR扩增程序如下：
95℃30s；95℃5s，57℃30s，40个循环。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，还包括根据Ct值与标准曲线进行对应，计算待检测烟粉虱中ToCV的具体含量；所述标准曲线按如下步骤建立：
(i)以感染ToCV植株的cDNA为模板，PCR扩增ToCV的基因片段；
所述PCR扩增的引物ToCV-F和ToCV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示：
ToCV-F：5’-CTGAAGTTCCTTTGGTGCAA-3’；SEQ ID NO.4
ToCV-R：5’-CCGCAGTGTAATCGAGAAAA-3’；SEQ ID NO.5
所述PCR扩增的反应体系如下所示，体系总体积20μL：
模板2.0μL；2.5mM/μL dNTP 2μL；Ex-Taq 0.2μL；10×Ex-Taq Buffer 2.0μL；10μM/μL ToCV-F 0.3μL；10mM/μL ToCV-R 0.3μL；ddH2O 13.2μL；
所述PCR扩增的程序如下：
95℃预变性4min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；4℃反应10min；
(ii)将步骤(i)制得的基因片段连接到pMD18-T Vector中，然后转化至大肠杆菌感受态细胞JM109中，筛选并提取阳性克隆的质粒且测序正确后，制得外参阳性质粒；
根据以下公式计算含有ToCV片段质粒拷贝数：
质粒拷贝数/μL＝(C×10-9)×阿氏常数/质粒分子量
其中C表示质粒浓度，单位ng/μL；阿氏常数为6.02×1023；质粒分子量＝重组质粒碱基数×660dalton/bp；
(iii)测定步骤(ii)制得的外参阳性质粒的浓度，按10倍梯度稀释至109、108、107、106、105、104、103、102、101质粒拷贝数/μL，分别进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，得到动力学扩增曲线，然后制作PCR扩增循环阈值(Ct值)和初始病毒量对数相关的标准曲线。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(iii)中，TaqMan实时荧光定量PCR的扩增体系如下，总体系20μL：
模板2.0μL；2×Premix ExTaq(Probe qPCR)10.0μL；10μM/μL ToCV-F6680 0.4μL；10μM/μL ToCV-F6799 0.4μL；10μM/μL ToCV-probe6724 0.8μL；ddH2O 6.4μL；
所述TaqMan PCR扩增程序如下：
95℃30s；95℃5s，57℃30s，40个循环。
上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)。
有益效果
1、本发明针对传毒介体烟粉虱，选取ToCV保守序列设计TaqMan PCR引物及探针，建立快速检测烟粉虱体内携带ToCV病毒的TaqMan实时荧光定量PCR的方法，该扩增方法灵敏度高，特异性强，2小时内便可出结果，快速且检测结果可靠；
2、本发明可实现对单头烟粉虱携带ToCV的检测，精确度高；
3、利用本发明可对田间烟粉虱的ToCV带毒情况进行大规模调查，精确计算烟粉虱带毒率，可有效减少样品交叉污染，快速高效、灵敏特异，为番茄褪绿病毒的快速诊断、早期预测预报及科学防控提供技术支撑。
附图说明
图1 ToCV基因片段PCR扩增图
图中M：2000bp Ladder；1：ToCV基因片段；
图2以101～109copies的ToCV-pMD18-T质粒为模板建立的扩增曲线；
图中A～I：质粒稀释倍数依次为102～108倍；
图3以101～109copies的ToCV-pMD18-T质粒为模板建立的标准曲线和线性关系；
图4实验室ToCV番茄植株上单头烟粉虱ToCV TaqMan PCR扩增曲线；
图5田间单头烟粉虱ToCV TaqMan PCR扩增曲线。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明的技术内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中所述的RNA提取试剂Trizol采购于Invitrogen公司，cDNA的合成试剂RT reagent Kit和Premix Ex Taq(Probe qPCR)采购于TaKaRa公司，其它试剂均为普通市售试剂。
实施例1
ToCV检测的标准曲线的建立，步骤如下：
(i)以感染ToCV植株的cDNA为模板，PCR扩增ToCV的基因片段；
所述PCR扩增的引物是根据GenBank公布的番茄ToCV基因序列(Accessionnumber：KC709510.1)，从中选取ToCV外壳蛋白高度保守、特异区域设计获得的，引物序列如下所示：
ToCV-F：5’-CTGAAGTTCCTTTGGTGCAA-3’；SEQ ID NO.4
ToCV-R：5’-CCGCAGTGTAATCGAGAAAA-3’；SEQ ID NO.5
所述PCR扩增的反应体系如下所示，体系总体积20μL：
模板2.0μL；2.5mM/μL dNTP 2.0μL；Ex-Taq 0.2μL；10×Ex-Taq Buffer 2.0μL；10μM/μL ToCV-F 0.3μL；10mM/μL ToCV-R 0.3μL；ddH2O 13.2μL；
所述PCR扩增的程序如下：
95℃预变性4min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；4℃反应10min；
PCR产物用1.5wt％琼脂糖凝胶电泳检测，结果成像胶片在681bp处有一条条带出现(如图1)，对此条带产物进行测序，序列如SEQ ID NO.6所示。
(ii)将步骤(i)制得的基因片段通过T-A克隆连接到pMD18-T Vector中，然后转化至大肠杆菌感受态细胞JM109中，筛选并提取阳性克隆的质粒且测序正确后，制得外参阳性质粒；
根据以下公式计算含有ToCV片段质粒拷贝数：
质粒拷贝数/μL＝(C×10-9)×阿氏常数/质粒分子量
其中C表示质粒浓度，单位ng/μL；阿氏常数为6.02×1023；质粒分子量＝重组质粒碱基数×660dalton/bp；
经计算，步骤(ii)制得的外参阳性质粒的质粒拷贝数为8.3×1010copies/μL
(iii)测定步骤(ii)制得的外参阳性质粒的浓度，按10倍梯度稀释至109、108、107、106、105、104、103、102、101质粒拷贝数/μL，分别进行TaqMan PCR扩增；
所述TaqMan探针，结构如下：
ToCV-probe6724：5’(FAM)-TAACATTCGGCACTTCC-(BHQ1)3’；
所述TaqMan PCR引物核苷酸序列如下：
ToCV-F6680：5’-TTTCTCAAAGGATCAAGCTGTGTT-3’；SEQ ID NO.2
ToCV-R6799：5’-TGCGCTCCGGTATCAGTCTT-3’。SEQ ID NO.3
所述TaqMan实时荧光定量PCR的扩增体系如下，总体系20μL：
模板2.0μL；2×Premix ExTaq(Probe qPCR)10.0μL；10μM/μL ToCV-F6680 0.4μL；10μM/μL ToCV-F6799 0.4μL；10μM/μL ToCV-probe6724 0.8μL；ddH2O 6.4μL；
所述TaqMan PCR扩增程序如下：
95℃30s；95℃5s，57℃30s，40个循环。
TaqMan PCR扩增后得到的动力学扩增曲线，如图2所示，然后制作PCR扩增循环阈值(Ct值)和初始病毒量对数相关的标准曲线，如图3所示。
实施例2
利用实时荧光定量PCR快速检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取单头待检测烟粉虱的RNA，经反转录，制得反转录产物；
所述提取单头待检测烟粉虱的RNA，步骤如下：
1)采集ToCV番茄植株饲养烟粉虱50头，分别将单头待检测烟粉虱置于含有100μLTrizol试剂的容器中，–80℃保存；检测时，置于冰上溶化，然后研磨后，加入300μL Trizol试剂，震荡混匀；
2)加入100μL氯仿，震荡混匀，4℃离心机13000rpm/min离心15min，取上清，将上清液转移至一新的1.5mL RNase free离心管中；
3)上清液中加入250μL异丙醇，震荡混匀，4℃离心机13000rpm/min离心15min，弃上清；
4)加入1mL由RNase free ddH2O配制的质量百分比浓度为75％的乙醇溶液，清洗RNA，4℃离心机13000rpm/min离心5min，弃上清，风干沉淀，制得RNA；
5)加入RNase free ddH2O，溶解RNA，即得；
经NanoPhotometer N50检测单头烟粉虱RNA的浓度在142.3ng/μL～313.88ng/μL之间，–80℃保存备用；
所述反转录采用反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)(Takara：RR047a)将制得的RNA进行反转录合成cDNA，制得反转录产物，具体操作步骤如下：
①基因组DNA的去除：在冰上配制反应液，使用10μL的反应体系，如下：
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，All Total RNA 7.0μL，RNase Free ddH20补至10.0μL。
反应条件：42℃2min。
②反转录：冰上配制反应液，20μL的反应体系，如下：
Reaction solution from Step 1 10.0μL，5×PrimeScript Buffer2 4.0μL,PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0μL,RT Primer Mix 1.0μL,RNase Free ddH20 4.0μL。
反应条件：37℃15min，85℃5s，-20℃保存。
(2)以步骤(1)制得的反转录产物为模板，利用TaqMan探针和引物，进行TaqMan实时荧光定量PCR分析：
所述TaqMan探针，结构如下：
ToCV-probe6724：5’(FAM)-TAACATTCGGCACTTCC-(BHQ1)3’；
所述TaqMan PCR引物核苷酸序列如下：
ToCV-F6680：5’-TTTCTCAAAGGATCAAGCTGTGTT-3’；
ToCV-R6799：5’-TGCGCTCCGGTATCAGTCTT-3’。
所述TaqMan实时荧光定量PCR的扩增体系如下，总体系20μL：
模板2.0μL；2×Premix ExTaq(Probe qPCR)10.0μL；10μM/μL ToCV-F6680 0.4μL；10μM/μL ToCV-F6799 0.4μL；10μM/μL ToCV-probe6724 0.8μL；ddH2O 6.4μL；
所述TaqMan PCR扩增程序如下：
95℃30s；95℃5s，57℃30s，40个循环。
对TaqMan实时荧光定量PCR数据进行分析，计算烟粉虱体内ToCV的含量(依据图3标准曲线计算病毒含量)与带毒率(带毒率＝阳性数/样品总数×100％)，检测结果如表1所示；
表1
注：表中“+”：ToCV检测为阳性；“—”：ToCV检测为隐性。
结果显示，50头烟粉虱样品均能扩增出S型曲线(如图4所示)，ToCV的Ct值在22.47～30.44之间，相对应的病毒含量1399～498519copies/μL(如表1所示)，经计算烟粉虱对ToCV的带毒率为100％，该烟粉虱可用于健康番茄的传毒试验。
实施例3
取采集于青岛市城阳区上马镇番茄温室大棚中的烟粉虱样品，按照实施例2所述的方法进行检测，检测结果如表2所示：
表2
注：表中“+”：ToCV检测为阳性；“—”：ToCV检测为隐性。
结果显示：50头烟粉虱样品中有15头能扩增出S型曲线(图5)，ToCV的Ct值在22.02～30.16之间，相对应的病毒含量1720～694648copies/μL(如表2所示)，经计算烟粉虱对ToCV的带毒率为30％，预测该地将有ToCV发生流行趋势，建议农药防治烟粉虱，预防ToCV的流行和爆发。

Claims (8)

1.检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan探针，探针的5’端标记FAM，3’端标记BHQ1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的TaqMan引物，该引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.利用权利要求1所述的TaqMan探针和权利要求2所述的引物进行实时荧光定量PCR快速检测单头烟粉虱携带番茄褪绿病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取单头待检测烟粉虱的RNA，经反转录，制得反转录产物；
(2)以步骤(1)制得的反转录产物为模板，利用TaqMan探针和引物，进行TaqMan实时荧光定量PCR分析，当有S型扩增曲线和Ct值出现时，则表示待检测烟粉虱中含有ToCV，否则，待检测烟粉虱中不含有ToCV。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)提取单头待检测烟粉虱的RNA，步骤如下：
1)将单头待检测烟粉虱置于含有80～150μL Trizol试剂的容器中，–80℃保存；检测时，置于冰上溶化，然后研磨后，加入250～400μL Trizol试剂，震荡混匀；
2)加入80～150μL氯仿，震荡混匀，4℃离心机13000rpm/min离心15min，取上清；
3)上清液中加入200～300μL异丙醇，震荡混匀，4℃离心机13000rpm/min离心15min，弃上清；
4)加入1mL由RNase free ddH2O配制的质量百分比浓度为75％的乙醇溶液，清洗RNA，4℃离心机13000rpm/min离心5min，弃上清，风干沉淀，制得RNA；
5)加入RNase free ddH2O，溶解RNA，即得。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，TaqMan实时荧光定量PCR的扩增体系如下，总体系20μL：
模板2.0μL；2×Premix ExTaq 10.0μL；10μM/μL ToCV-F6680 0.4μL；10μM/μL ToCV-F67990.4μL；10μM/μL ToCV-probe6724 0.8μL；ddH2O 6.4μL；
所述TaqMan PCR扩增程序如下：
95℃30s；95℃5s，57℃30s，40个循环。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，还包括根据Ct值与标准曲线进行对应，计算待检测烟粉虱中ToCV的具体含量。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述标准曲线按如下步骤建立：
(i)以感染ToCV植株的cDNA为模板，PCR扩增ToCV的基因片段；
所述PCR扩增的引物ToCV-F和ToCV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
所述PCR扩增的反应体系如下所示，体系总体积20μL：
模板2.0μL；2.5mM/μL dNTP 2μL；Ex-Taq 0.2μL；10×Ex-Taq Buffer 2.0μL；10μM/μLToCV-F 0.3μL；10mM/μL ToCV-R 0.3μL；ddH2O 13.2μL；
所述PCR扩增的程序如下：
95℃预变性4min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；4℃反应10min；
(ii)将步骤(i)制得的基因片段连接到pMD18-T Vector中，然后转化至大肠杆菌感受态细胞JM109中，筛选并提取阳性克隆的质粒且测序正确后，制得外参阳性质粒；
根据以下公式计算含有ToCV片段质粒拷贝数：
质粒拷贝数/μL＝(C×10-9)×阿氏常数/质粒分子量
其中C表示质粒浓度，单位ng/μL；阿氏常数为6.02×1023；质粒分子量＝重组质粒碱基数×660dalton/bp；
(iii)测定步骤(ii)制得的外参阳性质粒的浓度，按10倍梯度稀释至109、108、107、106、105、104、103、102、101质粒拷贝数/μL，分别进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，得到动力学扩增曲线，然后制作PCR扩增循环阈值(Ct值)和初始病毒量对数相关的标准曲线。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)中，TaqMan实时荧光定量PCR的扩增体系如下，总体系20μL：
模板2.0μL；2×Premix ExTaq 10.0μL；10μM/μL ToCV-F6680 0.4μL；10μM/μL ToCV-F67990.4μL；10μM/μL ToCV-probe6724 0.8μL；ddH2O 6.4μL；
所述TaqMan PCR扩增程序如下：
95℃30s；95℃5s，57℃30s，40个循环。
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