CN118006623A - 一种神经肽CCHamide的基因序列及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种神经肽CCHamide的基因序列及制备方法和应用。所述神经肽CCHamide基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了神经肽CCHamide基因的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过构建烟粉虱MED隐种神经肽CCHamide基因的瞬时表达载体转化烟草，将BtCCH2蛋白在烟草中过表达，能够显著降低烟粉虱获取和传播番茄褪绿病毒的能力。烟粉虱神经肽CCHamide基因对烟粉虱获取和传播番茄褪绿病毒均起到明显的抑制作用，该基因的应用在针对虫媒植物病毒番茄褪绿病毒的阻截和防控中起到重要作用。

Description

一种神经肽CCHamide的基因序列及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种神经肽CCHamide的基因序列及制备方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）是一类隶属于长线形病毒科Closteroviridae 、毛形病毒属Crinivirus的入侵性植物RNA病毒。其寄主范围广，自2012年侵入我国内陆地区后给番茄、辣椒等蔬菜生产带来了严重的经济损失。ToCV在自然界仅能依靠媒介昆虫（粉虱）进行传播，已有研究表明ToCV在我国的快速蔓延同烟粉虱（Bemisia tabaci）MED隐种密切相关。植物病毒又称为植物的“癌症”，一旦发生，很难进行有效防控，常规化学防治又会带来诸如“3R”等一系列问题。因此，从病毒传播“路径”入手，寻找其传播“桥梁”——媒介昆虫体内传毒相关基因尤为重要，基于媒介昆虫的新型病毒阻截技术亟待开发。

目前媒介昆虫传毒特性和机制研究较为广泛，但大多集中于免疫调节通路方面，从神经调控角度挖掘媒介昆虫传毒新靶标相关报道相对较少。神经肽是昆虫体内最多样化的信号分子，全面调控昆虫的各种生理和行为过程。神经肽CCHamide是一个在昆虫基因组中保守的脑、肠神经肽前体家族，有研究表明其能够调控昆虫的取食，而取食是媒介昆虫获毒和传毒的“核心”环节。因此，调控虫媒植物病毒传播“核心”环节的上游神经肽是开发病毒阻截防控技术的潜在靶标。但是目前，尚未有针对烟粉虱MED隐种CCHamide基因以及应用于所传植物病毒阻截防控的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种神经肽CCHamide的基因序列及制备方法和应用，具体涉及一种昆虫烟粉虱MED隐种CCHamide基因（BtCCH2）序列，基于昆虫烟粉虱MED隐种CCHamide基因序列的dsRNA，以及包含昆虫烟粉虱MED隐种CCHamide基因序列的重组瞬时表达载体与重组菌。本发明的技术方案如下：

一种神经肽CCHamide的基因序列如SEQ ID NO.1所示；基于昆虫烟粉虱MED隐种CCHamide基因序列的dsRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。针对基于昆虫烟粉虱MED隐种CCHamide基因序列的dsRNA的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

进一步的，所述昆虫烟粉虱MED隐种CCHamide基因的制备方法，步骤如下：

提取烟粉虱总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增，扩增引物为BtCCH2-F和BtCCH2-R，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

进一步的，所述基于昆虫烟粉虱MED隐种CCHamide基因序列的dsRNA的制备方法，步骤如下：

以烟粉虱MED隐种cDNA为模板，上下游引物为dsBtCCH2-F和dsBtCCH2-R，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，上下游引物中带有T7启动子；PCR扩增得到转录模板；再将转录模板体外转录合成烟粉虱CCHamide基因BtCCH2的特异性dsRNA。

本发明还提供了一种提高烟粉虱MED隐种获取和传播番茄褪绿病毒能力的方法，将上述dsRNA导入烟粉虱MED隐种体内，从基因沉默的角度反向验证了神经肽CCHamide基因BtCCH2可以抑制烟粉虱MED隐种获取和传播番茄褪绿病毒。

本发明还提供了一种重组瞬时表达载体，所述重组瞬时表达载体包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因片段。

优选的是，所述重组瞬时表达载体为pCHF3-EGFP-BtCCH2。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌包含上述的重组瞬时表达载体。

进一步的，所述重组菌为转化农杆菌。

本发明还提供了一种神经肽CCHamide，所述神经肽CCHamide是序列如SEQ IDNO.1所示的基因片段表达而获得。

本发明还提供了上述所得基因片段、重组瞬时表达载体、重组菌或神经肽CCHamide在制备抑制烟粉虱获取和传播番茄褪绿病毒的植物中的用途。

优选的，所述植物为烟草。

进一步的，本发明还包括所述神经肽CCHamide的基因序列在防控番茄褪绿病毒中的应用，抑制烟粉虱MED隐种获取和传播番茄褪绿病毒的方法为：利用前述的神经肽CCHamide（BtCCH2）瞬时表达植物饲喂或处理烟粉虱，调控其取食获毒及传毒。

相较于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明得到了烟粉虱MED隐种一种神经肽CCHamide基因（BtCCH2）的cDNA全长序列，采用饲喂法开展目的基因RNAi，优选出最佳干扰时间段，沉默烟粉虱BtCCH2基因，增强了烟粉虱获取和传播番茄褪绿病毒的能力，从基因沉默角度反向验证了神经肽CCHamide基因（BtCCH2）在烟粉虱获毒和传毒过程中的抑制作用；提供了一种重组CCHamide基因（BtCCH2）的瞬时表达载体以及重组菌，其在烟草中过表达后能够显著抑制烟粉虱对于番茄褪绿病毒的获取和传播。本发明的结果明确了神经肽CCHamide基因（BtCCH2）在烟粉虱MED隐种获取和传播番茄褪绿病毒中的重要作用，表明该基因在虫媒植物病毒的防控领域有着重要的应用价值，也暗示其可作为虫媒植物病毒防控阻截技术开发的潜在靶标。

附图说明

图1为烟粉虱MED隐种BtCCH2基因响应ToCV侵染的表达模式；

图2为饲喂dsRNA不同时间对烟粉虱MED隐种BtCCH2基因沉默效果；

图3为饲喂dsBtCCH2后对烟粉虱MED隐种获取ToCV能力的影响；

图4为饲喂dsBtCCH2后对烟粉虱MED隐种传播ToCV能力的影响；

图5为农杆菌注射本氏烟后荧光显微观察图；

图6为过表达BtCCH2对烟粉虱MED隐种获毒能力的影响；

图7为过表达BtCCH2对烟粉虱MED隐种传毒能力的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明内容，使本发明的优点和特点更加清楚。但实施例仅是范例性的，对本发明的范围并不构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和实质的情况下，可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均属于本发明的保护范围。

实施例1：烟粉虱MED隐种神经肽CCHamide基因（BtCCH2）的克隆

运用Trizol法完成烟粉虱总RNA提取，利用SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit WithgDNA Eraser试剂合成第一链cDNA。基于烟粉虱基因组和转录组数据库，运用BLAST等筛选鉴定出烟粉虱神经肽CCHamide基因序列，并结合Primer5.0软件设计BtCCH2基因的全长扩增引物，进行普通PCR扩增；扩增引物为BtCCH2-F和BtCCH2-R，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

PCR体系为25 μL：Gloria Nova HS 2 × Master Mix 12.5 μL，上下游引物BtCCH2-F/R各1μL，烟粉虱cDNA 1μL、最终用RNase Free H₂O补足至25 μL。PCR程序为：98℃预变性45 s，循环内98℃ 45 s，56℃ 30 s，72℃ 20 s，36循环，72℃ 2 min加长延伸。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得目的条带后，进行切胶、回收，并连接至pMD-18T（TaKaRa）载体，转化至大肠杆菌DH-5α感受态细胞中，经平板培养、挑斑、菌检后将阳性克隆进行测序。最终获得BtCCH2的cDNA全长序列，如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：烟粉虱MED隐种BtCCH2基因响应ToCV侵染的表达模式

将初羽化48 h的烟粉虱MED隐种雌成虫分别置于ToCV侵染番茄植株（5-6真叶期）上取食获毒6、12、24和48 h，对照组为在健康番茄植株（5-6真叶期）上取食相同时间的烟粉虱，每个处理至少设置3个生物学重复，提取烟粉虱样品总RNA，并反转录合成第一链cDNA，通过实时荧光定量PCR（qPCR）中的相对定量检测处理组和对照组烟粉虱体内BtCCH2基因的相对表达水平。

qPCR反应体系为10 uL：cDNA 1 μL，DEPC水3.2 μL，荧光染料2 × SYBR GreenqPCR Mix（Sparkjade）5 μL，上下游引物各0.4 μL。qPCR程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环。反应结束后使用2^-ΔΔCT法进行数据分析，运用SPSS 26.0软件进行差异显著性分析，干扰效率显著性采用t-test进行分析；BtCCH2定量引物分别为BtCCH2-qF和BtCCH2-qR，引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

内参引物SDHA-F和SDHA-R，引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；EF-1α- F和EF-1α-R，引物序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

结果如图1所示，烟粉虱获取ToCV，在6、12、24和48 h后BtCCH2基因的表达水平呈显著下降趋势，结果说明BtCCH2基因表达可被ToCV显著抑制。

实施例3：烟粉虱MED隐种BtCCH2基因特异性dsRNA的合成和纯化

（1）以实施例1得到的cDNA为模板，以dsBtCCH2-F和dsBtCCH2-R为引物进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，获得PCR产物；

（2）回收扩增产物，将目的基因与克隆载体pMD18-T连接，挑取单菌落送测序，得到与正确序列完全相同的克隆，提取质粒并以此为模板，用引物dsBtCCH2-F（SEQ ID NO.3）和dsBtCCH2-R（SEQ ID NO.4）扩增并纯化，以终浓度为1 μg/μL的扩增产物为合成dsRNA的模板。dsRNA合成试剂盒为T7 RNAi Transcription Kit（Vazyme）。

（3）根据dsRNA合成试剂盒说明书配置反应体系为：NTP Mix 8 μL，10 ×Transcription Buffer、T7 Enzyme Mix 各2 μL，模板1 μg，RNase-free H₂O定容至20 μL，混样后用移液器轻轻吹打混匀，将试剂短暂离心于管底后置于PCR仪中37℃反应2 h,进一步配置以RNase-free H₂O定容至40 μL的将上述反应产物与1 μL的DNase、2 μL的RNase T1（10 U/μL）混合的双酶消化体系，37℃孵育30 min，运用琼脂糖凝胶电泳进行检测，发现其条带大小在450 bp左右，且目的条带单一，证明合成目的基因dsRNA合成成功。

（4）根据dsRNA磁珠纯化试剂盒（Vazyme）说明书进行如下操作：向合成的dsRNA产物中加入80 μL的磁珠溶液，使用移液器吹打多次使溶液充分混匀；室温放置8 min，使磁珠与dsRNA充分结合；将2 mL无酶离心管置于磁力架约5 min，等溶液澄清后，小心吸取上清液，注意勿扰动到磁珠；保持2 mL无酶离心管始终放置于磁力架上，加入200 μL刚配制完成的80%的乙醇，室温放置30 s，小心吸取上清，重复一次此步骤；开盖空气干燥磁珠5-10min；取下磁力架上的2 ml无酶离心管，加入40 μL的 RNase-free H₂O，使用移液器将无酶离心管管壁的磁珠吹打至管底，充分混匀，并在室温条件下孵育3 min；将2 mL无酶离心管放置在磁力架上，待溶液变得澄清，小心转移上清至全新的无酶离心管中，勿碰触磁珠；测定dsRNA的A₂₆₀吸光值，确定其浓度，将纯化后的dsRNA置于-20℃保存。

实施例4：dsRNA饲喂与干扰效率检测

以dseGFP作为对照，让烟粉虱MED隐种取食用质量浓度为20%的蔗糖溶液稀释到800 ng/μL的实施例3获得的dsRNA，设置24、48、72 h三个时间段，收集取食后的烟粉虱并放入1.5 mL离心管中，液氮速冻后放入-80℃冰箱，每个时间段设置至少3个重复，采用qPCR检测烟粉虱体内BtCCH2基因表达水平的变化。反应体系、反应条件与数据处理同实施例2。

内参基因SDHA、EF-1α及BtCCH2定量引物同实施例2。

结果如图2所示，饲喂烟粉虱MED隐种dsBtCCH2在24、48和72 h后，BtCCH2表达水平分别下调28%、46%和58%，同对照（饲喂dseGFP）相比差异均达到显著水平（P<0.01）。其中，相对于干扰24和48 h，干扰72 h后干扰效率最高，干扰效果最好（P<0.001），因此72 h作为BtCCH2基因的最优干扰时间段。

实施例5：沉默BtCCH2基因对烟粉虱MED隐种获取ToCV的影响

按照实施例4中方法，分别饲喂烟粉虱MED隐种dsBtCCH2和dsdseGFP，在72 h后，将其置于ToCV侵染番茄植株上取食，获毒48 h后分别将试虫取出，提取RNA，合成第一链cDNA，最终运用qPCR对烟粉虱的体内的ToCV含量进行检测。ToCV实时荧光定量检测引物为ToCV-qF和ToCV-qR，引物序列如如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；

如图3结果表明，干扰BtCCH2后，烟粉虱获毒能力显著提升，体内ToCV含量是对照组（饲喂dseGFP）的3.45倍，差异达到显著水平（P<0.001）。

实施例6：沉默BtCCH2基因对烟粉虱MED隐种传播ToCV的影响

将健康烟粉虱MED隐种获毒（ToCV）48 h，再分别进行dsBtCCH2和dsdseGFP饲喂，72h后，将其置于健康番茄植株上取食，待传毒48 h后取出烟粉虱，两周后运用qPCR对番茄叶片内的ToCV含量进行检测（检测方法同实施例5）。如图4结果表明，同对照相比，经沉默BtCCH2的烟粉虱取食传毒后，番茄叶片ToCV含量是对照组（饲喂dseGFP）的2.31倍，差异达到显著水平（P<0.001）。说明沉默BtCCH2基因能够显著提升烟粉虱MED隐种传播ToCV的能力。

实施例7：烟粉虱MED隐种BtCCH2基因瞬时表达

（1）基于瞬时表达基因BtCCH2的cDNA序列（实施例1获得的cDNA序列，核苷酸序列为SEQ ID NO.1），以及植物荧光表达载体pCHF3-EGFP图谱，选择双酶切位点（SacI和BamHI），选用限制性内切酶SacI和BamHI（NEB）对载体进行双酶切；

（2）设计BtCCH2基因扩增接头引物（PBtCCH2F/R），以烟粉虱MED隐种cDNA为模板并选用高保真酶Gloria Nova HS 2 ×Master Mix（ABclonal）进行PCR扩增，接头引物分别为PBtCCH2F和PBtCCH2R，引物序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；

（3）接头引物扩增得到的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳后，将目的条带回收，使用一步法无缝克隆试剂盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit, Vazyme）将酶切载体与目的片段连接，然后转化至大肠杆菌 DH-5α菌株，进行平板筛选（Spec抗性）；

（4）挑取平板上单菌落，放入液体培养基（Spec抗性）中培养，运用引物PBtCCH2F/R进行菌检筛选阳性转化子。将阳性转化子送测，测序引物使用GFP-N-R1，测序引物序列如SEQ ID NO.17所示；

（5）将测序比对成功的阳性转化子菌液加入液体培养基（Spec抗性）培养扩繁，运用质粒小量极速提取试剂盒（Sparkjade）完成质粒的提取；

（6）将质粒转化至农杆菌GV3101菌株中，进行平板筛选（Spec + Rif抗性）；

（7）挑取平板上单菌落，放入液体培养基（Spec + Rif抗性）中培养，运用引物PBtCCH2F/R验证阳性转化子（农杆菌）；

（8）将阳性菌液（转化子）加入液体培养基（Spec + Rif抗性）继续振荡培养过夜，条件为200rpm、28℃；

（9）取出过夜培养菌液，调整其OD值在1~ 2之间，4000 rpm常温离心10 min，弃上清，加同等体积的悬浮液混合，28℃静置3-4 h，以备注射使用；

（10）选取4-5叶期本氏烟进行农杆菌注射，做好对照（已转化空白载体的农杆菌株），2-3 d后使用荧光显微镜观察。

分别将转pCHF3-EGFP-BtCCH2载体和空载体（pCHF3-EGFP）的农杆菌注射本氏烟，2-3 d后，使用荧光显微镜观察，结果如图5所示，处理组（转pCHF3-EGFP-BtCCH2载体农杆菌注射）和对照组（转空载体农杆菌注射）叶片上均能检测到绿色荧光，证明BtCCH2基因在烟草中成功表达。

实施例8：过表达BtCCH2基因对烟粉虱MED隐种获取ToCV能力的影响

分别用转pCHF3-EGFP-BtCCH2载体和空载体农杆菌注射ToCV侵染的本氏烟。注射3d后，将30头初羽化48 h的烟粉虱成虫置于目的基因（BtCCH2）过表达的ToCV侵染的本氏烟叶片上取食，48 h后收集烟粉虱，对照亦如此，处理组和对照组均至少设置3个生物学重复。运用TRIzol法提取烟粉虱的总RNA并反转录合成第一链cDNA，进一步利用qPCR检测处理组与对照组烟粉虱体内ToCV含量。

如图6结果表明，同对照组相比，烟粉虱取食过表达BtCCH2的ToCV侵染本氏烟后，烟粉虱获毒能力显著下降，体内ToCV含量是对照组的0.56倍，差异达到极显著水平（P<0.001）。从结果可以看出过表达BtCCH2可显著降低烟粉虱MED隐种的获毒（ToCV）能力。

实施例9：过表达BtCCH2基因对烟粉虱MED隐种传播ToCV能力的影响

分别用转pCHF3-EGFP-BtCCH2载体和空载体农杆菌注射健康本氏烟。将初羽化48h的烟粉虱成虫，置于ToCV侵染烟草植株上获毒。待获毒48 h后，取出烟粉虱，并将其置于农杆菌注射的本氏烟上取食传毒，待传毒48 h后，将烟粉虱取出。处理组和对照组均至少设置3个生物学重复。2周后，运用TRIzol法提取本氏烟叶片的总RNA并反转录合成第一链cDNA，进一步利用qPCR检测处理组与对照组本氏烟叶片中ToCV含量。

如图7结果表明，经携毒烟粉虱传毒后，过表达BtCCH2烟草叶片中ToCV含量是对照组的0.41倍，差异达到极显著水平（P<0.001）。从结果可以看出过表达BtCCH2可显著降低烟粉虱MED隐种的传毒（ToCV）能力。

Claims (12)

1. 一种神经肽CCHamide的基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 基于昆虫烟粉虱MED隐种CCHamide基因序列的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3. 针对基于昆虫烟粉虱MED隐种CCHamide基因序列的dsRNA的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求1所述神经肽CCHamide的基因序列的制备方法，步骤如下：

提取烟粉虱总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增，扩增引物为BtCCH2-F和BtCCH2-R，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

5.如权利要求2所述基于昆虫烟粉虱MED隐种CCHamide基因序列的dsRNA的制备方法，步骤如下：

以烟粉虱MED隐种cDNA为模板，上下游引物为dsBtCCH2-F和dsBtCCH2-R，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，上下游引物中带有T7启动子；PCR扩增得到转录模板；再将转录模板体外转录合成烟粉虱CCHamide基因BtCCH2的特异性dsRNA。

6.一种提高烟粉虱MED隐种获取和传播番茄褪绿病毒能力的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：

将如权利要求2所述的dsRNA导入烟粉虱MED隐种体内。

7. 一种重组瞬时表达载体，其特征在于，所述重组瞬时表达载体包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因片段。

8.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包含如权利要求7所述的重组瞬时表达载体。

9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为转化农杆菌。

10. 一种神经肽CCHamide，其特征在于，所述神经肽CCHamide是序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段表达而获得。

11.如权利要求1所述的基因序列、如权利要求2所述的dsRNA、如权利要求7所述的重组瞬时表达载体、如权利要求8所述的重组菌或如权利要求10所述的神经肽CCHamide在制备抑制烟粉虱获取和传播番茄褪绿病毒的植物中的应用。

12.如权利要求10所述神经肽CCHamide在防控番茄褪绿病毒中的应用。