CN105087567A - 一种鉴别番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的双重pcr引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物及方法，步骤如下：(1)提取植株的总RNA；(2)以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA；(3)以cDNA为模板对ToCV和TYLCV衣壳蛋白编码的核酸序列进行PCR扩增；(4)对步骤(3)制得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明涉及上述PCR引物组合，利用双重PCR方法来进行ToCV与TYLCV的鉴定，结果准确、方法快速简便，节约检测成本，大大提高了病毒检测效率，具有良好的应用前景。

Description

一种鉴别番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物及方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物及方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)和番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)是番茄上的两种重要病毒，给番茄生产造成严重威胁。TYLCV属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的DNA病毒，染病番茄植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片常稍褪绿发黄、变小，叶片边缘上卷，叶片增厚，叶质变硬，是当前保护地番茄首要病害。而ToCV属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)的RNA病毒，染病番茄叶片褪绿黄化，叶脉深绿，感病叶片变脆且易折，叶片黄化疑似营养缺素症，近年来成为我国番茄生产中的又一重要病害。

随着两种病毒在田间的暴发为害，在我国山东、河北、北京等地发现大量ToCV和TYLCV(ToCV&TYLCV)共同侵染的番茄植株，较单种病毒单独为害情况，两种病毒共同侵染植株的发病症状更加明显，加速了病毒植株的死亡速度。随着TYLCV与ToCV的发生流行及其给番茄生产带来的重大经济损失，实现快速灵敏的分析鉴定，是预防与控制病毒病的首要选择。因此，开发快速准确、简便经济的可以同时检测TYLCV与ToCV两种病毒的方法，是一项重要而紧迫的任务。

传统的TYLCV的检测方法：抽取病株DNA，以DNA模板，利用TYLCV的特异引物进行常规PCR检测(周涛，师迎春，陈笑瑜等，2010.北京地区番茄黄化曲叶病毒病的鉴定及防治对策.植物保护，36(2):116-118.)。传统ToCV的检测方法：抽取病毒RNA，将RNA反转录成cDNA，再以cDNA模板，利用ToCV的特异引物进行常规PCR检测(赵黎明，李刚，刘永光等，2014.番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定.中国蔬菜，12：15-20；赵汝娜，王蓉，师迎春等，2014.侵染甜椒的番茄褪绿病毒的分子鉴定.植物保护，40(1)：128-130.)。利用上述传统方法检测TYLCV或ToCV侵染的植株，操作步骤繁琐且耗时。

多重PCR(multiplexPCR)技术又称多重引物PCR或复合PCR技术，是常规PCR技术的基础上改进和发展起来的一种新型的PCR扩增技术，是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个不同的DNA片段。本专利利用多重PCR技术，针对TYLCV和ToCV衣壳蛋白的核酸序列设计扩增TYLCV和ToCV双重PCR特异引物，仅需样品的cDNA作为模板，便可在同一PCR体系中快速鉴别TYLCV和ToCV两种病毒，尤其对TYLCV和ToCV混合感染的植株更为实用。这种方法既保留了常规PCR方法的特异性、敏感性，又减少了操作步骤及试剂用量，大大提高了检测的效率，节省了检测的人力、物力和财力，在田间TYLCV或ToCV病毒的监测上具有独特的优势和极高的使用价值。

目前利用双重PCR技术构建快速鉴别ToCV和TYLCV的方法未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物及方法。

一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物，所述引物为2对，分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的核苷酸序列与SEQIDNO.3、SEQIDNO.4与所示的核苷酸序列。

正义引物ToCV-F：5’-GGTCAATTATGAGGTCGTGAA-3’；SEQIDNO.1

反义引物ToCV-R：5’-CTCTGCCCAGACTTGTAATCA-3’；SEQIDNO.2

正义引物TYLCV-F：5’-ACTTCGACAGCCCATACAGC-3’；SEQIDNO.3

反义引物TYLCV-R：5’-GAAACCTATCCCGCAAATCA-3’；SEQIDNO.4

一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的方法，步骤如下：

(1)提取待测样品的RNA，制得RNA溶液；

(2)以步骤(1)制得的RNA为模板，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA；

(3)以步骤(2)制得的cDNA为模板，利用上述的2对引物对cDNA进行双重PCR扩增，制得双重PCR扩增产物；

(4)对步骤(3)制得的双重PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当双重PCR产物电泳图谱显示被测样品有231bp和471bp两条条带出现时，则该被检测样品为番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的植株；当电泳图谱显示被测样品有471bp的一条条带时，则该被检测样品为番茄黄化曲叶病毒侵染的植株；当电泳图谱显示被测样品有231bp的一条条带时，则该被检测样品为番茄褪绿病毒侵染的植株。

优选的，所述步骤(3)中20μLPCR扩增的体系(TaKaRa)为：

模板2.0μL；浓度为2.5mM的dNTP2.0μL；10×Taqbuffer2.0μL；rTaq0.3μL；浓度为10μM的引物各0.3μL；ddH₂O补至20μL。

优选的，所述步骤(3)中PCR扩增的程序如下：

94℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。

上述步骤(1)中提取病毒植株总RNA、步骤(2)中RNA反转录为cDNA和步骤(4)中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)。

有益效果

1、本发明所述鉴别ToCV与TYLCV的双重PCR引物均针对病毒衣壳蛋白的核酸序列设计，特异性高，在同一个PCR反应体系中，仅需要样品的cDNA模板便可同时扩增模板中ToCV与TYLCV基因，此方法减少了操作步骤及试剂用量，降低了检测成本，大大提高了两种病毒检测效率。

2、本发明从分子水平探索了快速检测ToCV与TYLCV两种病毒的方法，探索建立了同时检测ToCV与TYLCV两种病毒的双重PCR技术，为今后ToCV与TYLCV的动态鉴定、发生预警及综合防治奠定了基础。

附图说明

图1是实施例1中双重PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图中M：2000bpDNALadder；1：健康植株；2：阳性对照；3：TYLCV与ToCV复合侵染植株；4：ToCV植株；5：TYLCV植株。

图2是实施例2中双重PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图中M：2000bpDNALadder；1：健康植株；2：ToCV与TYLCV复合侵染植株；3：ToCV植株；4：TYLCV植株；6-17：青岛上马田间ToCV或TYLCV疑似植株，其中5、7、8、10、12、14、15为ToCV与TYLCV复合侵染植株，6、9、11、13、16、17为TYLCV侵染植株。。

图3是实施例3中双重PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图中M：2000bpDNALadder；1：健康植株；2：ToCV与TYLCV复合侵染植株；3：ToCV植株；4：TYLCV植株；6-17：烟台莱阳田间ToCV或TYLCV疑似植株，其中6、7、10、12为ToCV与TYLCV复合侵染植株，5、9、11、13-17为TYLCV侵染植株，8为非TYLCV或ToCV侵染植株。

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1中所述的病毒疑似植株及健康植株为青岛农业大学入侵生物实验室长期饲养植株；利用本发明所设计的引物及方法对上述植株进行病毒检测，温室大棚中的植株为ToCV和TYLCV复合侵染植株。

实施例2中所述病毒疑似植株于2014年采集于山东省青岛市上马地区；对上述病毒疑似植株采用现有技术进行检测，采集于上马的植株一部分为ToCV与TYLCV共侵染植株，部分为TYLCV单独侵染植株，未检测到ToCV单独侵染植株。

实施例3中所述病毒疑似植株于2014年采集于山东省烟台市莱阳地区；对上述病毒疑似植株采用现有技术进行检测，采集于莱阳的植株一部分为ToCV与TYLCV共侵染植株，部分为TYLCV单独侵染植株，未检测到ToCV单独侵染植株。

实施例中所述的RNA提取试剂Trizol采购于invitrogen公司，cDNA的合成试剂PrimeScriptRTreagentKit采购于TaKaRa公司，其它试剂均为普通市售试剂。

实施例1

一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的方法，步骤如下：

(1)提取ToCV与TYLCV侵染病毒植株样品的RNA，制得RNA溶液；

按照Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)试剂的步骤抽提RNA，具体操作如下：

1)取植物组织，置于液氮中迅速研磨，将植株的粉末约200mg迅速转移至1mLTrizol中；

2)室温放置5min；

3)每样品中加0.2mL氯仿，盖紧盖子，剧烈震荡15s，室温放置3min；

4)4℃12,000g离心15min，将上清转移到一新离心管中；

5)加0.5mL异丙醇，混匀，室温放置10min；

6)4℃12,000g离心15min；

7)加1mL75wt％乙醇，清洗沉淀，4℃12,000g离心5min，移除上清，风干沉淀即为RNA；

8)加适量DEPC水溶解RNA，55℃10min；

9)1.2wt％的琼脂糖凝胶检测RNA完整性，ScanDrop250超微量核酸分析仪检测RNA浓度，-80℃保存备用。

(2)以步骤(1)制得的RNA为模板，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA；

cDNA的合成按照RTreagentKit试剂盒(TaKaRa公司)的步骤进行，具体操作如下：

1)基因组DNA去除反应：在冰上配制反应液，使用10.0μL的反应体系。包括：

2.0μL5×gDNAEraserBuffer，1.0μLgDNAEraser，1.0μgTotalRNA，RNaseFreeddH₂0至10.0μL。

反应条件：42℃2min。

2)反转录的反应：冰上配制反应液，20.0μL的反应体系。

包括ReactionsolutionfromStep110.0μL，Mastermix10.0μL(5XPrimeScriptBuffer24.0μL,PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1.0μL,RTPrimerMix1.0μL,RNaseFreeddH₂04.0μL)。反应条件：37℃15min，85℃5s，-20℃保存。

(3)以步骤(2)制得的cDNA为模板，利用上述的2对引物对cDNA进行双重PCR扩增，制得双重PCR扩增产物；

PCR扩增体系为：

cDNA溶液2μL，正义引物ToCV-F(10μM)0.3μL，反义引物ToCV-R(10μM)0.3μL，正义引物TYLCV-F(10μM)0.3μL，反义引物TYLCV-R(10μM)0.3μL，5U/μLTaq酶0.3μL，10×TaqBuffer2.0μL，2.5mMdNTP2μL，ddH₂O补至20μL；

引物序列如下：

正义引物ToCV-F：5’-GGTCAATTATGAGGTCGTGAA-3’；SEQIDNO.1

反义引物ToCV-R：5’-CTCTGCCCAGACTTGTAATCA-3’；SEQIDNO.2

正义引物TYLCV-F：5’-ACTTCGACAGCCCATACAGC-3’；SEQIDNO.3

反义引物TYLCV-R：5’-GAAACCTATCCCGCAAATCA-3’；SEQIDNO.4

PCR扩增条件如下：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

(4)用1.5wt％琼脂糖凝胶电泳对步骤(3)制得的双重PCR扩增产物进行检测，若是TYLCV植株均检测出一长度在471bp条带(如图1所示)，对该条带序列进行单向测序，TYLCV病毒植株得到的条带序列如SEQIDNO.5所示；若是ToCV植株均检测出一长度在231bp条带(如图1所示)，对该条带序列进行单向测序，ToCV病毒植株得到的条带序列如SEQIDNO.6所示；若是ToCV&TYLCV共侵染植株均检测出长度在231bp和471bp两条条带(如图1所示)。该检测结果与实际结果完全一致。

实施例2

一种鉴定ToCV或TYLCV的方法，步骤如下：

(1)将采集于山东省青岛市上马地区的病毒疑似植株的一片叶子置于液氮中充分研磨，使用Trizol进行RNA的抽提，得到疑似病毒植株的RNA溶液；

(2)以步骤(1)的RNA为模板，使用RTreagentKit试剂盒进行cDNA的合成；

(3)以步骤(2)中制得的cDNA溶液为模板，对模板中的ToCV与TYLCV基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

PCR扩增体系为：

cDNA溶液2μL，正义引物ToCV-F(10μM)0.3μL，反义引物ToCV-R(10μM)0.3μL，正义引物TYLCV-F(10μM)0.3μL，反义引物TYLCV-R(10μM)0.3μL，5U/μLTaq酶0.3μL，10×TaqBuffer2.0μL，2.5mMdNTP2μL，ddH₂0补至20μL；

引物序列如下：

正义引物ToCV-F：5’-GGTCAATTATGAGGTCGTGAA-3’；SEQIDNO.1

反义引物ToCV-R：5’-CTCTGCCCAGACTTGTAATCA-3’；SEQIDNO.2

正义引物TYLCV-F：5’-ACTTCGACAGCCCATACAGC-3’；SEQIDNO.3

反义引物TYLCV-R：5’-GAAACCTATCCCGCAAATCA-3’；SEQIDNO.4

PCR扩增条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。

(4)用1.5wt％琼脂糖凝胶电泳检测步骤(3)制得的PCR扩增产物，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像。

结果显示，被测样品在成像胶片上有231bp和471bp两条条带出现时，为ToCV&TYLCV共侵染植株；被测样品在成像胶片上有231bp一条带出现时，为ToCV侵染植株；被测样品在成像胶片上有471bp一条带出现时，为TYLCV侵染植株；被测样品在成像胶片上无条带出现时，为非TYLCV或ToCV侵染植株(如图2所示)。该检测结果与按现有技术检测的结果完全一致。

实施例3

如实例2所述鉴定ToCV或TYLCV的方法，不同之处在于，所述植物样品采集于山东省烟台市莱阳地区。

结果显示，被测样品在成像胶片上有231bp和471bp两条条带出现时，为ToCV&TYLCV共侵染植株；被测样品在成像胶片上有231bp的一条带出现时，为ToCV侵染植株；被测样品在成像胶片上有471bp的一条带出现时，为TYLCV侵染植株；被测样品在成像胶片上无条带出现时，为非TYLCV或ToCV侵染植株(如图3所示)。

Claims (4)

1.一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物，其特征在于，所述引物为2对，分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的核苷酸序列与SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。

2.一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)提取待测样品的RNA，制得RNA溶液；

(2)以步骤(1)制得的RNA为模板，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA；

(3)以步骤(2)制得的cDNA为模板，利用上述的2对引物对cDNA进行双重PCR扩增，制得双重PCR扩增产物；

(4)对步骤(3)制得的双重PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当双重PCR产物电泳图谱显示被测样品有231bp和471bp两条条带出现时，则该被检测样品为鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的植株；当电泳图谱显示被测样品有231bp的一条条带时，则该被检测样品为番茄褪绿病毒侵染的植株；当电泳图谱显示被测样品有471bp的一条条带时，则该被检测样品为番茄黄化曲叶病毒侵染的植株。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中20μLPCR扩增的体系为：

模板2.0μL；浓度为2.5mM的dNTP2.0μL；10×Taqbuffer2.0μL；rTaq0.3μL；浓度为10μM的引物各0.3μL；ddH₂O补至20μL。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增的程序如下：

94℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。