CN110628947A - 一种快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法 - Google Patents

一种快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110628947A
CN110628947A CN201910929829.2A CN201910929829A CN110628947A CN 110628947 A CN110628947 A CN 110628947A CN 201910929829 A CN201910929829 A CN 201910929829A CN 110628947 A CN110628947 A CN 110628947A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
tomato
leaf curl
yellow leaf
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910929829.2A
Other languages
English (en)
Inventor
季英华
涂丽琴
周益军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Academy of Agricultural Sciences filed Critical Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201910929829.2A priority Critical patent/CN110628947A/zh
Publication of CN110628947A publication Critical patent/CN110628947A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法，属植物保护领域。根据番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒核苷酸序列设计三条引物，[A]TYTO_R，[B]TY_F，[C]To_R，其中A/C组合检测番茄褪绿病毒，A/B组合检测番茄黄化曲叶病毒。样品提取总RNA后，只需一次RT‑PCR，即可检测番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒两种病毒，实现了两种病毒的鉴别。由于番茄黄化曲叶病毒是一种DNA病毒，番茄褪绿病毒是一种RNA病毒，因此传统的检测方法往往需要分别提取DNA和RNA进行检测，该方法仅需提取样品RNA，即可实现两种病毒的同步检测，大大减少了成本，节约了时间，是一种特异、灵敏、经济而又方便的检测方法。

Description

一种快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种对番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒快速鉴别的方法，属植物保护领域。
背景技术
番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，是一种由粉虱传播的单链环状DNA病毒，由其导致的番茄黄化曲叶病近年来在世界各地肆虐发生，给番茄等多种作物造成了毁灭性的危害。TYLCV于1939年首次在以色列的约旦河地区被发现，1964年正式命名为番茄黄化曲叶病毒，近年来随着传毒介体烟粉虱的大发生，各地经贸往来的频繁及耕作模式的变换，TYLCV陆续扩散蔓延到世界上许多番茄产区，如葡萄牙，日本，墨西哥，希腊，意大利，荷兰，毛里求斯和阿塞拜疆等，给番茄等作物生产造成了严重的危害。在中国，TYLCV于2006年首次出现发生危害报道，之后随着病毒的扩散蔓延，目前上海、浙江、山东、河南、河北、广东等多个省市均出现该病毒危害报道，病害的肆虐发生对对当地番茄造成了毁灭性的损失，严重威胁到番茄产业的健康发展。
番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus，ToCV)为长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)成员之一，是一种RNA病毒，其基因组由两条正义RNA链组成，主要由粉虱传播，危害番茄在内的多种作物。ToCV于1998年首次在美国佛罗里达州发现，之后陆续扩散蔓延，目前世界多个国家和地区都出现该病毒发生危害报道，包括葡萄牙，西班牙，意大利，法国，巴西，墨西哥，苏丹，格鲁吉亚，约旦和尼日利亚等。在中国，ToCV于2013年首次在北京番茄上发现并报道，之后陆续传播扩散到其他地区，如山东、江苏和云南等等，对当地番茄造成了巨大的损失。
ToCV与TYLCV都属于烟粉虱传播的植物病毒，它们在侵染寄主番茄时会表现相近的症状：ToCV感染的番茄植株，其典型症状是叶片明显黄化，严重的整株褪绿变黄。而对于TYLCV感染的番茄植株，其典型症状也是叶片黄化、同时伴有出叶缘的向上和向内卷曲，植株生长缓慢、矮缩等症状。由于ToCV和TYLCV都可以感染番茄使其叶片呈现黄化症状，生产上单靠症状区分这两种病毒存在困难，尤其是在发病早期阶段。鉴于ToCV是一种RNA病毒，而TYLCV是一种DNA病毒，因此常规的分子检测方法通常需要分别提取DNA和RNA来检测这两种病毒，操作上较为不便。因此，需要一种可以同时检测两种病毒的简便、经济、有效的方法。本方法提供了一种了基于RT-PCR的快速检测技术，通过设计特异性的引物及简化操作步骤，只需一次RNA的提取，即可实现一种RNA病毒(ToCV)和一种DNA病毒(TYLCV)的快速同步检测。
发明内容
本发明提供了一种快速同步检测番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法，通过该方法可以快速诊断出植株是否携带病毒。
1、引物设计：
(1)根据NCBI上已报道的番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒核苷酸序列进行序列比对，结果显示，TYLCV与ToCV的RNA2区段之间存在一个小的保守基序，位于C3蛋白的3′末端，基于该基序的序列设计简并引物TYTO_R，基于ToCV(To_F)的CPm和TYLCV(TY_F)的C3的核苷酸序列分别设计两个正向引物引物序列如下：
TYTO_R：5′-AAT WCA TRR TCA ACT GCT CT-3′
To_F：5′-GGT TCA CAG ACA TCA TCA AAC C-3′
TY_F：5′-ATG GAT TCA CGC ACA GGG-3′
(2)引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：
2、总RNA提取：
取植物样品组织0.1g于2mL磨样管，液氮研磨后加入1mL Trizol reagent充分研磨，室温放置5min；加入氯仿200μL，涡旋混匀15sec后，室温静置3min；12000×g，4℃离心15min；取上层水相移入一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后于-20℃静置30min；12000×g，4℃离心10min，弃上清；加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀，8000×g，4℃离心5min；重复用1mL 75％乙醇洗涤一次，8000×g，4℃离心5min，弃上清；干燥RNA沉淀，而后加25μL DEPC处理水溶解沉淀，-20℃保存。
3、RT-PCR扩增：
(1)反转录(RT)：
取一200μL Eppendorf管，加入样品：提取的总RNA 2μL，dNTP Mixture 1μL，TYTO_R 2μL，RNase free ddH2O 5μL，置于65℃下变性5min，立即取出置于冰上放置1min。再依次加入下列试剂：
30℃10min，42℃1h，70℃15min，-20℃保存备用。
(2)聚合酶链式反应(PCR)：
以RT合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：
反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50sec、44-56℃退火50sec、72℃延伸50sec，30-40次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
4、电泳检测：
取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和130V电压条件下电泳25min，在0.5μg/mL的溴化乙锭中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在仅感染番茄黄化曲叶病毒的样品中可以观察到一条338bp的核酸条带，在仅感染番茄褪绿病毒的样品中可以观察到一条762bp的核酸条带，在同时感染番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的样品中可以观察到338bp和762bp两条核酸条带。
附图说明
附图是番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的电泳检测结果(M：标准分子量；1：健康番茄样品；2：番茄褪绿缩病毒样品；3：番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的复合样品；4：番茄黄化曲叶病毒样品)
具体实施方式
实例一：
以已知的感染番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的番茄混合样品和分别感染番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的番茄样品为检测对象，以健康番茄样品为阴性对照。
1、引物设计：
(1)根据NCBI上已报道的番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒核苷酸序列进行序列比对，结果显示，TYLCV与ToCV的RNA2区段之间存在一个小的保守基序，位于C3蛋白的3′末端，基于该基序的序列设计简并引物TYTO_R，基于ToCV(To_F)的CPm和TYLCV(TY_F)的C3的核苷酸序列分别设计两个正向引物引物序列如下：
TYTO_R：5′-AAT WCA TRR TCA ACT GCT CT-3′
To_F：5′-GGT TCA CAG ACA TCA TCA AAC C-3′
TY_F：5′-ATG GAT TCA CGC ACA GGG-3′
(2)引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：
2、总RNA提取：
取植物样品组织0.1g于2mL磨样管，液氮研磨后加入1mL Trizol reagent充分研磨，室温放置5min；加入氯仿200μL，涡旋混匀15sec后，室温静置3min；12000×g，4℃离心15min；取上层水相移入一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后于-20℃静置30min；12000×g，4℃离心10min，弃上清；加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀，8000×g，4℃离心5min；重复用1mL 75％乙醇洗涤一次，8000×g，4℃离心5min，弃上清；干燥RNA沉淀，而后加25μL DEPC处理水溶解沉淀，-20℃保存。
3、RT-PCR扩增：
(1)反转录(RT)：
取一200μL Eppendorf管，加入样品：提取的总RNA 2μL，dNTP Mixture 1μL，TYTO_R 2μL，RNase free ddH2O 5μL，置于65℃下变性5min，立即取出置于冰上放置1min。再依次加入下列试剂：
30℃10min，42℃1h，70℃15min，-20℃保存备用。
(2)聚合酶链式反应(PCR)：
以RT合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：
反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50sec、44-56℃退火50sec、72℃延伸50sec，30-40次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
4、电泳检测：
取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和130V电压条件下电泳25min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察。
5、结果分析：
在仅感染番茄黄化曲叶病毒的样品中可以观察到一条338bp的核酸条带，在仅感染番茄褪绿病毒的样品中可以观察到一条762bp的核酸条带，在同时感染番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的样品中可以观察到338bp和762bp两条核酸条带。

Claims (3)

1.一种快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法，包括以下步骤：
(1)引物设计：
①根据NCBI上已报道的番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒核苷酸序列进行序列比对，结果显示，TYLCV与ToCV的RNA2区段之间存在一个小的保守基序，位于C3蛋白的3′末端，基于该基序的序列设计简并引物TYTO_R，基于ToCV(To_F)的CPm和TYLCV(TY_F)的C3的核苷酸序列分别设计两个正向引物，引物序列如下：
TYTO_R：5′-AAT WCA TRR TCA ACT GCT CT-3′
To_F：5′-GGT TCA CAG ACA TCA TCA AAC C-3′
TY_F：5′-ATG GAT TCA CGC ACA GGG-3′
②引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：
(2)总RNA提取：
取植物样品组织0.1g于2mL磨样管，液氮研磨后加入1mL Trizol reagent充分研磨，室温放置5min；加入氯仿200μL，涡旋混匀15sec后，室温静置3min；12000×g，4℃离心15min；取上层水相移入一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后于-20℃静置30min；12000×g，4℃离心10min，弃上清；加入1mL75％乙醇洗涤沉淀，8000×g，4℃离心5min；重复用1mL75％乙醇洗涤一次，8000×g，4℃离心5min，弃上清；干燥RNA沉淀，而后加25μL DEPC处理水溶解沉淀，-20℃保存。
(3)RT-PCR扩增：
①反转录(RT)：
取一200μL Eppendorf管，加入样品：提取的总RNA 2μL，dNTP Mixture 1μL，TYTO_R 2μL，RNase free ddH2O 5μL，置于65℃下变性5min，立即取出置于冰上放置1min。再依次加入下列试剂：
30℃ 10min，42℃ 1h，70℃ 5min，-20℃保存备用。
②聚合酶链式反应(PCR)：
以RT合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：
反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50sec、44-56℃退火50sec、72℃延伸50sec，30-40次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
(4)电泳检测：
取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和130V电压条件下电泳25min，在0.5μg/mL的溴化乙锭中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在仅感染番茄黄化曲叶病毒的样品中可以观察到一条338bp的核酸条带，在仅感染番茄褪绿病毒的样品中可以观察到一条762bp的核酸条带，在同时感染番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的样品中可以观察到338bp和762bp两条核酸条带。
2.根据权利要求1所述的快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法，其特征在于PCR扩增中的退火温度为44-56℃。
3.根据权利要求1所述的快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法，其特征在于PCR扩增的循环次数为30-40次。
CN201910929829.2A 2019-09-27 2019-09-27 一种快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法 Pending CN110628947A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910929829.2A CN110628947A (zh) 2019-09-27 2019-09-27 一种快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910929829.2A CN110628947A (zh) 2019-09-27 2019-09-27 一种快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110628947A true CN110628947A (zh) 2019-12-31

Family

ID=68973233

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910929829.2A Pending CN110628947A (zh) 2019-09-27 2019-09-27 一种快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110628947A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101845514A (zh) * 2009-11-10 2010-09-29 江苏省农业科学院 侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别方法
CN102234643A (zh) * 2010-05-04 2011-11-09 北京市农林科学院 辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒的特异引物对及其应用
CN103820582A (zh) * 2014-03-19 2014-05-28 西南大学 一种利用lamp快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法
CN105018649A (zh) * 2015-08-19 2015-11-04 江苏省农业科学院 一种快速同步检测番茄黄化曲叶病毒及其伴随中国番茄黄化曲叶病毒卫星的方法
CN105087567A (zh) * 2015-08-28 2015-11-25 青岛农业大学 一种鉴别番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的双重pcr引物及方法
CN106305625A (zh) * 2016-08-15 2017-01-11 青岛农业大学 温室白粉虱在分离番茄褪绿病毒的应用
CN107385109A (zh) * 2017-07-28 2017-11-24 陈定虎 番茄黄化曲叶病毒鉴定用的引物、试剂盒及检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101845514A (zh) * 2009-11-10 2010-09-29 江苏省农业科学院 侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别方法
CN102234643A (zh) * 2010-05-04 2011-11-09 北京市农林科学院 辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒的特异引物对及其应用
CN103820582A (zh) * 2014-03-19 2014-05-28 西南大学 一种利用lamp快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法
CN105018649A (zh) * 2015-08-19 2015-11-04 江苏省农业科学院 一种快速同步检测番茄黄化曲叶病毒及其伴随中国番茄黄化曲叶病毒卫星的方法
CN105087567A (zh) * 2015-08-28 2015-11-25 青岛农业大学 一种鉴别番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的双重pcr引物及方法
CN106305625A (zh) * 2016-08-15 2017-01-11 青岛农业大学 温室白粉虱在分离番茄褪绿病毒的应用
CN107385109A (zh) * 2017-07-28 2017-11-24 陈定虎 番茄黄化曲叶病毒鉴定用的引物、试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周莹等: "河北省番茄黄化曲叶病毒病的分子鉴定初报", 《植物保护》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101875982B (zh) 一种同步检测多种烟草病毒的方法
Gambino Multiplex RT-PCR method for the simultaneous detection of nine grapevine viruses
CN102154526B (zh) 一种利用lamp快速检测中国番木瓜曲叶病毒的方法
CN105331743A (zh) 一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法
CN105018649A (zh) 一种快速同步检测番茄黄化曲叶病毒及其伴随中国番茄黄化曲叶病毒卫星的方法
Nematollahi et al. Phylogenetic analysis of new isolates of Cucumber mosaic virus from Iran on the basis of different genomic regions
CN101845514B (zh) 侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别方法
CN103540680A (zh) 一种鉴定h9n2亚型禽流感病毒的双重rt-pcr检测方法
CN103103288B (zh) 一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法
CN110628947A (zh) 一种快速鉴别番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的方法
CN103820582A (zh) 一种利用lamp快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法
CN103320534B (zh) 同步检测四种侵染番茄的烟粉虱传双生病毒的方法
Oosthuizen et al. First report of Grapevine Syrah virus 1 in South African grapevines
CN106367531A (zh) 一种齿兰环斑病毒rt‑lamp检测引物及其检测方法
CN102676695A (zh) 能够同时检测CymMV和ORSV的RT-PCR检测试剂盒及方法
Klimentov et al. Phlebovirus sequences detected in ticks collected in Russia: Novel phleboviruses, distinguishing criteria and high tick specificity
CN114032336A (zh) 一种检测黄瓜花叶病毒的方法及其试剂盒
Yan et al. Characterization of Citrus tristeza virus isolates by indicators and molecular biology methods
Kuroda et al. Multiplex reverse transcription polymerase chain reaction for simultaneous detection of viruses in gentian
CN102140555B (zh) 一种豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用rt-pcr检测用简并引物、检测方法及其应用
Shalaby et al. Development of a highly sensitive multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction (m-RT-PCR) method for detection of three potato viruses in a single reaction and nested PCR
Supakitthanakorn et al. Simultaneous and sensitive detection of CVB, CChMVd and CSVd mixed infections in Chrysanthemum using multiplex nested RT-PCR.
CN101705293A (zh) 大豆疫霉pcr检测特异引物对
CN106191302A (zh) 一种番茄黄曲叶病毒lamp检测试剂盒及检测方法
CN102206714A (zh) 一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用rt-pcr检测用简并引物、检测方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20191231

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication