CN107385109A - 番茄黄化曲叶病毒鉴定用的引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

番茄黄化曲叶病毒鉴定用的引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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邓丛良
王振华
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Abstract

本发明公开了一种番茄黄化曲叶病毒鉴定用的引物、试剂盒及检测方法，番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定用的引物，其特征在于包括：正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，反向内引物BIP。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定用的引物；本发明另一个目的是提供一种包含上述引物的番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定用的试剂盒；本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测番茄黄化曲叶病毒的方法。

Description

番茄黄化曲叶病毒鉴定用的引物、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定用的引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
番茄黄化曲叶病毒学名:Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV),是蔬菜类危险性最大的病毒之一，其核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据；
番茄黄化曲叶病毒除南极洲外，各大洲均有分布。首先在中东地区、地中海盆地被发现,随后在意大利、西班牙发生，广泛分布于热带及亚热带地区，在美国及非洲和亚洲的热带地区和日本、澳大利亚也有报道，我国上海、浙江、广东、广西、云南、福建、江苏、河南以及台湾等地都有发生。寄主范围：番茄、烟草、南瓜、木薯、棉花等经济作物。
染病番茄植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片常稍褪绿发黄、变小，叶片边缘上卷，叶片增厚，叶质变硬，叶背面叶脉常显紫色。生长发育早期染病植株严重矮缩，无法正常开花结果；生长发育后期染病植株仅上部叶和新芽表现症状，结果数减少，果实变小，成熟期果实着色不均匀(红不透)，基本失去商品价值。
TYLCV的传播介体是烟粉虱Bemisia tabaci传播,该昆虫属于同翅目、粉虱科、小粉虱属，截止2005年，已被命名的烟粉虱生物型至少有26个，我国至少存在6种生物型(B,Q,ZHJ-1,ZHJ-2,ZHJ-3,FJ-1),其中B型在我国大部分地区、Q型在我国长江流域已经成为优势种群，给蔬菜、花卉和棉花生产造成了严重的危害。另外，还可以嫁接传播、在雌雄个体之间传播，经卵也可以传播，但是机械摩擦和种子不传播。烟粉虱各个龄期均能传毒，最短获毒时间是15-30min。
该病毒基因组为2.8kb左右的单链环状DNA，病毒基因组含有4个ORFs(AC1、AC2、AC3和AC4)：AC1编码的Rep蛋白在开启病毒环状DNA的滚环复制和选择感染部位上起关键作用；AC2编码转录激活蛋白Transcriptional activator protein，TrAP；AC3编码与增强病毒复制相关的蛋白Replication enhancer，REn，可以加快病毒积累，增强病毒侵染及发病能力；AC4编码的蛋白参与病毒的系统运动或症状形成。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定用的引物；
本发明另一个目的是提供一种包含上述引物的番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定用的试剂盒；
本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测番茄黄化曲叶病毒的方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定用的引物，其特征在于包括：
正向外引物F3：5'-AATACATGATCAACTGCTCTG-3'；
反向外引物B3：5'-ACGACATCATTTCCATTCAGA-3'；
正向内引物FIP：
5'-CTCAGACTGGTCATTTCTTAAGAGT-ACATTGTTAATGGAAATTACACC-3'；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5'-CTCAGACTGGTCATTTCTTAAGAGT-3'；
F2：5'-ACATTGTTAATGGAAATTACACC-3'；
反向内引物BIP：
5'-GCTGTAATGTCGTCCAAATTCGG-TAAGATTCAACCACAACATCAG-3'；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5'-GCTGTAATGTCGTCCAAATTCGG-3'；
B2:5'-TAAGATTCAACCACAACATCAG-3'。
2、一种番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定用的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：
3、根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：
4、根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
5、根据权利要求2至4所述的任一种试剂盒，其特征在于荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。
6、一种番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
A、植物组织总DNA提取；
B、LAMP检测：
采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA 5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA 5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应60min，最后80℃下保温5min以结束反应；
C、LAMP结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有番茄黄化曲叶病毒；若与阴性对照一样未发出荧光，则判定样品中没有携带番茄黄化曲叶病毒。
7、根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于步骤A中植物组织总DNA提取的具体步骤：
选取0.1g新鲜表现可疑症状的植物组织或者干重组织20mg，同时用0.1g健康组织作为对照，加液氮冷冻后充分研磨后在化冻前装入1.5mL Eppendorf离心管中；
在离心管中加入600μL 65℃预热的裂解液和12μLβ-巯基乙醇，涡旋混匀使样品完全悬浮，加入5μL DNAse A,65℃水浴30min，期间振荡混匀2-3次，保证充分裂解；
加入蛋白质沉淀液200μL，充分振荡混匀，再冰育10min，4℃12000g离心5min；
取上清，加入600μL异丙醇溶液，颠倒混合均匀，室温放置5min后，12000g离心5min；
小心取得上清，留沉淀，即为DNA沉淀，用500μL 70％冷乙醇洗涤一次，置于超净工作台上吹干，然后溶于50μL TE缓冲液中备用。
本发明中用到的仪器设备、用具及试剂
1.仪器设备
1.1 PCR扩增仪
1.2 台式高速冷冻离心机
1.3 电子分析天平
1.4 手持紫外灯(波长240-260nm，350-370nm)
2.用具
2.1 移液器(0.1-2μL,2-10μL,10-100μL,100-1000μL)
2.2 研钵
2.3 0.2mL、0.5mL、1.5mL离心管
2.4 紫外防护眼镜
2.5反应试管
综上所述，本发明的有益效果：
本发明采用环介导核酸等温扩增即Loop-mediated isothermal amplification，LAMP技术检测植物中的番茄黄化曲叶病毒，它不需要昂贵的检测设备，只需要一台温箱即可，而且其检测灵敏度比普通PCR检测方法高，而且检测时间不超过一小时，结果直接目测即可，特别适合口岸一线检测。
本发明引物、试剂盒及检测方法检测番茄黄化曲叶病毒快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
实施例1
一种番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定用的引物，包括：
正向外引物F3：5'-AATACATGATCAACTGCTCTG-3'；
反向外引物B3：5'-ACGACATCATTTCCATTCAGA-3'；
正向内引物FIP：
5'-CTCAGACTGGTCATTTCTTAAGAGT-ACATTGTTAATGGAAATTACACC-3'；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5'-CTCAGACTGGTCATTTCTTAAGAGT-3'；
F2：5'-ACATTGTTAATGGAAATTACACC-3'；
反向内引物BIP：
5'-GCTGTAATGTCGTCCAAATTCGG-TAAGATTCAACCACAACATCAG-3'；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5'-GCTGTAATGTCGTCCAAATTCGG-3'；
B2:5'-TAAGATTCAACCACAACATCAG-3'。
实施例2
一种番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定用的试剂盒，包括有：
其中正向外引物F3：5'-AATACATGATCAACTGCTCTG-3'；
反向外引物B3：5'-ACGACATCATTTCCATTCAGA-3'；
正向内引物FIP：
5'-CTCAGACTGGTCATTTCTTAAGAGT-ACATTGTTAATGGAAATTACACC-3'；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5'-CTCAGACTGGTCATTTCTTAAGAGT-3'；
F2：5'-ACATTGTTAATGGAAATTACACC-3'；
反向内引物BIP：
5'-GCTGTAATGTCGTCCAAATTCGG-TAAGATTCAACCACAACATCAG-3'；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5'-GCTGTAATGTCGTCCAAATTCGG-3'；
B2:5'-TAAGATTCAACCACAACATCAG-3'。
实施例3
一种番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定用的试剂盒，包括有：
其中正向外引物F3：5'-AATACATGATCAACTGCTCTG-3'；
反向外引物B3：5'-ACGACATCATTTCCATTCAGA-3'；
正向内引物FIP：
5'-CTCAGACTGGTCATTTCTTAAGAGT-ACATTGTTAATGGAAATTACACC-3'；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5'-CTCAGACTGGTCATTTCTTAAGAGT-3'；
F2：5'-ACATTGTTAATGGAAATTACACC-3'；
反向内引物BIP：
5'-GCTGTAATGTCGTCCAAATTCGG-TAAGATTCAACCACAACATCAG-3'；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5'-GCTGTAATGTCGTCCAAATTCGG-3'；
B2:5'-TAAGATTCAACCACAACATCAG-3'。
所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：
所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。
实施例4
一种番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定方法，包括以下步骤：
A、植物组织总DNA提取；
a.选取0.1g新鲜表现可疑症状的植物组织或者干重组织20mg，同时用0.1g健康组织作为对照，加液氮冷冻后充分研磨后在化冻前装入1.5mL Eppendorf离心管中；
b.在离心管中加入600μL 65℃预热的裂解液和12μLβ-巯基乙醇，涡旋混匀使样品完全悬浮，加入5μL DNAse A,65℃水浴30min，期间振荡混匀2-3次，保证充分裂解；
c.加入蛋白质沉淀液200μL，充分振荡混匀，再冰育10min，4℃12000g离心5min；
d.取上清，加入600μL异丙醇溶液，颠倒混合均匀，室温放置5min后，12000g离心5min；
e.小心取得上清，留沉淀，即为DNA沉淀，用500μL 70％冷乙醇洗涤一次，置于超净工作台上吹干，然后溶于50μL TE缓冲液中备用。
B、LAMP检测：
采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA 5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA 5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应60min，最后80℃下保温5min以结束反应；
C、LAMP结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有番茄黄化曲叶病毒；若与阴性对照一样未发出荧光，则判定样品中没有携带番茄黄化曲叶病毒。
SEQUENCE LISTING
<110> 陈, 定虎
<120> 番茄黄化曲叶病毒鉴定用的引物、试剂盒及检测方法
<130> 番茄黄化曲叶病毒鉴定用的引物、试剂盒及检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Tomato yellow leaf curl virus
<400> 1
aatacatgat caactgctct g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Tomato yellow leaf curl virus
<400> 2
acgacatcat ttccattcag a 21
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> Tomato yellow leaf curl virus
<400> 3
ctcagactgg tcatttctta agagtacatt gttaatggaa attacacc 48
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Tomato yellow leaf curl virus
<400> 4
ctcagactgg tcatttctta agagt 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Tomato yellow leaf curl virus
<400> 5
acattgttaa tggaaattac acc 23
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Tomato yellow leaf curl virus
<400> 6
gctgtaatgt cgtccaaatt cggtaagatt caaccacaac atcag 45
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Tomato yellow leaf curl virus
<400> 7
gctgtaatgt cgtccaaatt cgg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Tomato yellow leaf curl virus
<400> 8
taagattcaa ccacaacatc ag 22

Claims (7)

1.一种番茄黄化曲叶病毒鉴定用的引物，其特征在于包括：
正向外引物F3：5'-AATACATGATCAACTGCTCTG-3'；
反向外引物B3：5'-ACGACATCATTTCCATTCAGA-3'；
正向内引物FIP：
5'-CTCAGACTGGTCATTTCTTAAGAGT-ACATTGTTAATGGAAATTACACC-3'；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5'-CTCAGACTGGTCATTTCTTAAGAGT-3'；
F2：5'-ACATTGTTAATGGAAATTACACC-3'；
反向内引物BIP：
5'-GCTGTAATGTCGTCCAAATTCGG-TAAGATTCAACCACAACATCAG-3'；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5'-GCTGTAATGTCGTCCAAATTCGG-3'；
B2:5'-TAAGATTCAACCACAACATCAG-3'。
2.一种番茄黄化曲叶病毒鉴定用的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
5.根据权利要求2至4所述的任一种试剂盒，其特征在于荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。
6.一种番茄黄化曲叶病毒LAMP鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
A、植物组织总DNA提取；
B、LAMP检测：
采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA 5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA 5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应60min，最后80℃下保温5min以结束反应；
C、LAMP结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有番茄黄化曲叶病毒；若与阴性对照一样未发出荧光，则判定样品中没有携带番茄黄化曲叶病毒。
7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于步骤A中植物组织总DNA提取的具体步骤：
选取0.1g新鲜表现可疑症状的植物组织或者干重组织20mg，同时用0.1g健康组织作为对照，加液氮冷冻后充分研磨后在化冻前装入1.5mL E ppendorf离心管中；
在离心管中加入600μL 65℃预热的裂解液和12μLβ-巯基乙醇，涡旋混匀使样品完全悬浮，加入5μL DNAse A,65℃水浴30min，期间振荡混匀2-3次，保证充分裂解；
加入蛋白质沉淀液200μL，充分振荡混匀，再冰育10min，4℃12000g离心5min；
取上清，加入600μL异丙醇溶液，颠倒混合均匀，室温放置5min后，12000g离心5min；
小心取得上清，留沉淀，即为DNA沉淀，用500μL 70％冷乙醇洗涤一次，置于超净工作台上吹干，然后溶于50μL TE缓冲液中备用。
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