CN103820582A - 一种利用lamp快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)快速检测中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCCNV）的方法，包括反应体系及该反应体系中包含的特异性引物组，通过DNA提取、LAMP扩增、电泳检测或荧光染色等步骤实现。该方法具特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点，且无需PCR仪等特殊仪器及凝胶电泳等设备，便于实验室及田间病毒病样品的快速检测。

Description

一种利用LAMP快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法
技术领域
本发明涉及植物病害检测技术领域，特别是涉及环介导等温扩增(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)分子检测方法，具体是一种利用LAMP快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法。
背景技术
中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）是我国云南发现的双生病毒科（Geminivirade）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）的病毒。由于TYLCCNV的寄主种类多，可侵染烟草、番茄、南瓜、木薯、棉花等作物，且发生范围广泛，如四川、云南、广西、广东及福建等地区，因此建立该病毒快速有效的检测方法对于田间病毒病害的早期监测具有重要意义。目前检测TYLCCNV的方法主要为血清学方法和PCR技术，两种方法均具有速度快、灵敏度高及特异性好等特点。但是，血清学方法检测的缺点是易出现假阳性诊断结果，而PCR技术需依赖PCR仪及凝胶电泳设备才能完成，二者均不便于在田间开展大规模的病毒病样品检测。
LAMP是由Notomi于2000年开发的一种新型核酸扩增技术，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用的Bst DNA 聚合酶，在等温条件下进行靶序列高效扩增。该技术避免了常规 PCR对循环温度的特殊要求，并因其高效性、简易性、成本低廉且检测周期短等特点提升了它的应用价值。目前该技术应用于植物病毒检测方面的研究较少，还没有利用该技术检测TYLCCNV的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服传统TYLCCNV检测方法的不足，提供一种利用LAMP快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法，该方法灵敏度高、特异性强、不需要凝胶电泳设备及PCR仪，可用于TYLCCNV的田间早期诊断。
本发明采用的技术方案为：利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，进行靶序列高效扩增，建立简便、快速、成本低、灵敏度高和特异性强的TYLCCNV 的LAMP检测方法，便于在田间大规模快速检测应用。
本发明所述的一种利用LAMP快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法，通过如下步骤实现：
（1）采用CTAB法提取待测植株叶片的总DNA；
（2）以DNA为模板，采用以下特异性引物组进行LAMP扩增，得到扩增产物：
FIP 5′-ACTACAACCTGAGGAAAGCGTTAGTCCAGATTTTGCAGGTTAG-3′
BIP 5′-ACTTGTAATGTGATTATGTCGTGGTCAAAAATCCCCTTTATTTCAAGA-3′
F3 5′-AACGCAAGGTCTGAGGAT-3′
B3 5′-AGCAGAGAATGGCGTTTA-3′
（3）检测
电泳检测：取5 μL扩增产物经2% 琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳30 min，感染TYLCCNV的样品为明亮的呈弥散状的核酸泳带； 
荧光染色：在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ(1:1000) 2 μL，1-5 min后观察结果，感染TYLCCNV的样品由橙色变成绿色，未感染TYLCCNV的样品及空白对照保持染料的橙色。
步骤（2）LAMP扩增的反应体系为25 μL，所述反应体系中各组分的含量为：模板DNA 1.0 μL，其他组分的终浓度：Bst RNA 聚合酶8 U、 1×Reaction Buffer、2.4 mM/L MgSO4、0.2 mM/L dNTPs、0.8 M Betaine，特异性引物组的浓度分别为：FIP/BIP 1.6 μM/L、F3/B3 0.2 μM/L，加ddH2O补足25 μL，混匀，于63℃水浴锅中反应60 min，之后80 ℃下灭活 10 min 结束反应。
附图说明
图1为LAMP检测TYLCCNV的电泳结果：其中1为marker；2为待测样品；3为TYLCCNV阳性对照；4为阴性对照。
图2为LAMP检测TYLCCNV的染色结果：其中1为待测样品；2为TYLCCNV阳性对照；3为阴性对照。
图3为LAMP特异性检测TYLCCNV的电泳结果：其中1为marker；2为受TYLCCNV侵染的阳性样品；3-6为分别为被云南烟草曲叶病毒（Tobacco leaf curl Yunnna virus，TbLCYNV）、胜红蓟黄脉病毒（Ageratum yellow vein virus，AYVV）、烟草曲茎病毒（Tobaco curly shoot virus，TbCSV）、中国番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl China virus，PaLCuCNV）侵染的样品；7为阴性对照。
本发明的优点是：本发明的LAMP检测方法具特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点，无需凝胶电泳设备及PCR仪等特殊仪器，便于在田间开展病毒病样品的大规模检测应用，该方法为TYLCCNV田间监测构建了一个快速检测的技术平台。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明：
取常见烟草曲叶病病原如TYLCCNV、TbLCYNV、AYVV、TbCSV、PaLCuCNV侵染的烟草植株叶片，按本发明方法实施如下的检测，结果如图3所示。从该图可以明确判定只有在受到TYLCCNV侵染的植株中可以检测到LAMP特征性的呈弥散状的核酸条带，证实了本发明方法用于检测TYLCCNV的可行性和准确性。具体操作如下：
（1）采用CTAB法提取植株病叶的总DNA：
A、取0.2g植株病叶叶片，液氮充分研磨后加入预先放置有预热1mL CTAB提取液的1.5mL离心管中，涡旋混匀30s，65℃水浴30min；
B、加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，轻摇几分钟，离心10min；
C、取上清，重复步骤B；
D、取上清，加入0.2倍体积3 mol/L PH5.2 NaAC, 0.7倍体积遇冷异丙醇，不停轻摇至纤维丝成团，-20℃放置30min；
E、离心10min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤两次，然后加入40 μL ddH2O，轻轻涡旋混匀，得到模板DNA溶液。该DNA溶液可在-20℃或-80℃保存。
（2）LAMP扩增，配置反应体系为25 μL，所述反应体系中各组分的含量为：模板DNA 1.0 μL、其他组分的终浓度：Bst RNA 聚合酶8 U、 1×Reaction Buffer、2.4 mM/L MgSO4、0.2 mM/L dNTPs、0.8 M Betaine，特异性引物组的浓度分别为：FIP/BIP 1.6 μM/L、F3/B3 0.2 μM/L，加ddH2O补足25 μL，混匀，于63℃水浴锅中反应60 min，之后80 ℃下灭活 10 min 结束反应。
其中引物FIP 、BIP、F3、B3分别为:
FIP：5′-ACTACAACCTGAGGAAAGCGTTAGTCCAGATTTTGCAGGTTAG-3′
BIP：5′-ACTTGTAATGTGATTATGTCGTGGTCAAAAATCCCCTTTATTTCAAGA-3′
F3：5′-AACGCAAGGTCTGAGGAT-3′
B3：5′-AGCAGAGAATGGCGTTTA-3′
上述引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
同时以阴性样品和阳性样品作为对照。
（3）反应结束后，取5 μL产物经2% 琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳30 min，获取电泳结果，再向其产物中加入SYBR GreenⅠ(1:1000) 2 μL，1-5 min后观察结果，如图1和图2所示，阳性对照与待测植株样品出现了特异性的梯形条带，阴性对照无特异性条带，显色结果显示，阳性对照与待测植株样品出现了由橙色变为绿色，阴性对照仍保持染料的橙色。图3为TYLCCNV特异性检测结果，其中TYLCCNV阳性样品（泳道2）出现特征性梯状条带，结果呈阳性；其他烟草病毒样品（泳道3-6）未出现特征性条带，结果为阴性；样品7阴性对照未出现特征性梯状条带。
用引物F3/B3扩增的片段测序，通过NCBI进行对比，结果表明，该扩增片段特异，与TYLCCNV同源性达100%。该LAMP方法分别以TbLCYNV，AYVV，TbCSV，PaLCuCNV等烟草病毒的DNA为模板，以阴性样品和TYLCCNV的阳性样品做对照，电泳图3结果表明，只有TYLCCNV阳性样品出现了特异性的弥散条带，其他组均未出现条带，说明该方法特异性强；另外，通过TYLCCNV浓度稀释比对，进行了LAMP和普通PCR的灵敏度检测，结果发现LAMP的灵敏度明显强于PCR。

Claims (2)

1.一种利用LAMP快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于通过如下步骤实现：
（1）采用CTAB法提取待测植株叶片的总DNA；
（2）以DNA为模板，采用以下特异性引物组进行LAMP扩增，得到扩增产物：
FIP 5′-ACTACAACCTGAGGAAAGCGTTAGTCCAGATTTTGCAGGTTAG-3′
BIP 5′-ACTTGTAATGTGATTATGTCGTGGTCAAAAATCCCCTTTATTTCAAGA-3′
F3 5′-AACGCAAGGTCTGAGGAT-3′
B3 5′-AGCAGAGAATGGCGTTTA-3′
（3）检测
电泳检测：取5 μL扩增产物经2% 琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳30 min，感染TYLCCNV的样品为明亮的呈弥散状的核酸泳带； 
荧光染色：在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ(1:1000) 2 μL，1-5 min后观察结果，感染TYLCCNV的样品由橙色变成绿色，未感染TYLCCNV的样品及空白对照保持染料的橙色。
2.根据权利要求1所述的一种利用LAMP快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于步骤（2）LAMP扩增的反应体系为25 μL，所述反应体系中各组分的含量为：模板DNA 1.0 μL，其他组分的终浓度：Bst RNA 聚合酶8 U、 1×Reaction Buffer、2.4 mM/L MgSO4、0.2 mM/L dNTPs、0.8 M Betaine，特异性引物组的浓度分别为：FIP/BIP 1.6 μM/L、F3/B3 0.2 μM/L，加ddH2O补足25 μL，混匀，于63℃水浴锅中反应60 min，之后80 ℃下灭活 10 min 结束反应。
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