CN105132588A - 一种检测甘薯卷叶病毒的方法及其专用引物组 - Google Patents

一种检测甘薯卷叶病毒的方法及其专用引物组 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测甘薯卷叶病毒的方法及其专用引物组。本发明首先保护一种引物组，由序列1所示的单链DNA分子、序列2所示的单链DNA分子、序列3所示的单链DNA分子、序列4所示的单链DNA分子、序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成。引物组的功能为：鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒；检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒。采用本发明提供的引物组检测甘薯卷叶病毒，具有如下优点：(1)特异性强；(2)灵敏度高；(3)操作简便；(4)反应时间明显缩短；(5)克服了现有方法需要依赖昂贵仪器的不足。本发明具有较强的推广价值。

Description

一种检测甘薯卷叶病毒的方法及其专用引物组
技术领域
本发明涉及一种检测甘薯卷叶病毒的方法及其专用引物组，更具体涉及一种基于环介导等温扩增检测甘薯卷叶病毒的方法及其专用引物组。
背景技术
甘薯卷叶病毒(Sweetpotatoleafcurlvirus,SPLCV)，属双生病毒科(Germiniviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，主要寄主是甘薯、裂叶牵牛和圆叶牵牛，其引发的病害可导致甘薯发育异常、产量和质量严重受损及种性退化。20世纪80年代，该病害在中国台湾和日本的甘薯上发生。近几年，随着传播介体烟粉虱的种群及分布不断增加、人类的贸易及迁徙活动越发频繁，甘薯卷叶病毒的迅速扩散和广泛发生已经引起全球的关注。
目前，检测甘薯卷叶病毒的方法主要有PCR方法，弊端在于耗时长、依赖昂贵的检测设备。
近年来开发的环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification,LAMP)是一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和1个具有链置换特性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)，在等温条件下高效扩增靶基因。迄今尚未有应用该技术检测甘薯卷叶病毒的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测甘薯卷叶病毒的方法及其专用引物组。
本发明首先保护一种引物组，由序列表的序列1所示的单链DNA分子(SPLCV-F3)、序列表的序列2所示的单链DNA分子(SPLCV-B3)、序列表的序列3所示的单链DNA分子(SPLCV-FIP)、序列表的序列4所示的单链DNA分子(SPLCV-BIP)、序列表的序列5所示的单链DNA分子(SPLCV-LF)和序列表的序列6所示的单链DNA分子(SPLCV-LB)组成；所述引物组的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒；(b)检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒。
本发明还保护所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒；(b)检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒。
本发明还保护含有所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒；(b)检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所述引物组中的各条引物进行独立包装的步骤。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行环介导等温扩增；如果所述引物组可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为甘薯卷叶病毒；如果所述引物组不能实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为非甘薯卷叶病毒。
本发明还保护一种检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测生物样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，采用所述引物组进行环介导等温扩增；如果所述引物组可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，所述待测生物样本含有或疑似含有甘薯卷叶病毒；如果所述引物组不能实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，所述待测生物样本不含有或疑似不含有甘薯卷叶病毒。
所述待测生物样本为植物样本。所述植物具体可为番茄。
以上任一所述环介导等温扩增的初始反应体系中含有钙黄绿素和镁离子。
以上任一所述环介导等温扩增的初始反应体系中，SPLCV-F3和SPLCV-B3的浓度均为0.2μmol/L，SPLCV-FIP和SPLCV-BIP的浓度均为1.6μmol/L，SPLCV-LF和SPLCV-LB的浓度均为0.8μmol/L。
以上任一所述环介导等温扩增的初始反应体系(25μl)具体为：模板DNA，BstDNA聚合酶的浓度为0.32U/μL，SPLCV-F3和SPLCV-B3的浓度均为0.2μmol/L，SPLCV-FIP和SPLCV-BIP的浓度均为1.6μmol/L，SPLCV-LF和SPLCV-LB的浓度均为0.8μmol/L，钙黄绿素荧光染料的浓度为0.2μmol/L，甜菜碱的浓度为1mol/L，MgSO4的浓度为6mmol/L，dNTP的浓度为1.6mmol/L。
以上任一所述环介导等温扩增的反应条件具体为：63℃、60分钟，然后95℃、2min。
“所述引物组可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增”的判断标准具体如下：环介导等温扩增结束后，在正常光照条件下，反应体系呈黄绿色。
“所述引物组不能实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增”的判断标准具体如下：环介导等温扩增结束后，在正常光照条件下，反应体系呈橙色。
原理：钙黄绿素是一种螯合剂，反应前与试剂中的镁离子结合处于淬灭状态，环介导等温扩增的副产物焦磷酸离子与镁离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。
采用本发明提供的引物组检测甘薯卷叶病毒，具有如下优点：(1)特异性强；(2)灵敏度高，比普通PCR反应高出10倍；(3)操作简便；(4)反应时间明显缩短，整个检测1小时内完成，克服了现有方法中检测周期长的不足；(5)通过在反应体系中直接加入螯合剂-钙黄绿素，可实现肉眼观察判定结果，整个检测过程不需要复杂仪器设备，只需维持恒温的水浴锅或金属锅就可完成，克服了现有方法需要依赖昂贵仪器的不足，尤其适合在设备资源配备简单的田间开展现场检测。本发明具有较强的推广价值。
附图说明
图1为实施例2的结果。
图2为实施例3的结果(LAMP)。
图3为实施例3的结果(PCR)。
图4为实施例4的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
甘薯卷叶病毒(Sweetpotatoleafcurlvirus,SPLCV)：乔奇，张振臣，张德胜等.中国甘薯病毒种类的血清学和分子检测[J].植物病理学报，2012,42(1)：10-16.。
甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)：乔奇，张振臣，张德胜等.中国甘薯病毒种类的血清学和分子检测[J].植物病理学报，2012,42(1)：10-16.。
甘薯无症病毒(Sweetpotatosymptomlessvirus,SPSMV)：Mbanzibwa,D.R.,Tairo，F.,Gwandu,C.,Kullaya,A.,2011.Firstreportofsweetpotatosymptomlessvirus1andsweetpotatovirusAinsweetpotatoesinTanzania.PlantDis.95：224.。
甘薯病毒2号(Sweetpotatovirus2,SPV2；又称甘薯病毒2型)：包改丽，左瑞娟，饶维力等.云南甘薯病毒的检测及主要病毒的多样性分析[J].微生物学通报，2013,40(2)：236-248.。
甘薯G病毒(SweetpotatovirusG,SPVG)：乔奇，张振臣，张德胜等.中国甘薯病毒种类的血清学和分子检测[J].植物病理学报，2012,42(1)：10-16.。
甘薯C病毒(SweetpotatovirusC,SPVC)：包改丽，左瑞娟，饶维力等.云南甘薯病毒的检测及主要病毒的多样性分析[J].微生物学通报，2013,40(2)：236-248.。
实施例1、引物的设计和制备
基于大量序列比对，引物设计、引物筛选与效果验证，获得了一组效果最好的用于环介导等温扩增的引物组，引物组中的各条引物的序列如下：
SPLCV-F3(外侧上游引物，序列表的序列1)：5’-GGCTGAACTTCGAGACAG-3’；
SPLCV-B3(外侧下游引物，序列表的序列2)：5’-AATCCGAGACACAGACAAAC-3’；
SPLCV-FIP(内侧上游引物，序列表的序列3)：
5’-CTCTTCATCCGGACGCCTCCTACACTGGGAATGCTGTC-3’；
SPLCV-BIP(内侧下游引物，序列表的序列4)：
5’-GGTGACCGCATCCCGAAGTCTTGAACTCATAGTCCTGGA-3’；
SPLCV-LF(环上游引物，序列表的序列5)：5’-TAGCTTCGGGCAGCAATT-3’；
SPLCV-LB(环下游引物，序列表的序列6)：5’-ATGTGTTGGTCCCTGTAAGG-3’。
分别人工合成以上各条引物。
实施例2、特异性检测
选取甘薯卷叶病毒(SPLCV)、甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯无症病毒(SPSMV)、甘薯病毒2号(SPV2)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯C病毒(SPVC)作为待测病毒。上述病毒中，甘薯卷叶病毒为DNA病毒，其它病毒均为RNA病毒。
1、提取待测DNA病毒的基因组DNA，或，提取待测RNA病毒的总RNA并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA或cDNA为模板DNA，进行环介导等温扩增，然后在正常光照条件下观察并拍照。环介导等温扩增过程中，采用实时荧光PCR仪进行实时监测。设置用等体积水代替模板DNA的空白对照。
环介导等温扩增的反应体系(25μl)中，含200ng模板DNA，BstDNA聚合酶的浓度为0.32U/μL，SPLCV-F3和SPLCV-B3的浓度均为0.2μmol/L，SPLCV-FIP和SPLCV-BIP的浓度均为1.6μmol/L，SPLCV-LF和SPLCV-LB的浓度均为0.8μmol/L，钙黄绿素荧光染料的浓度为0.2μmol/L，甜菜碱的浓度为1mol/L，MgSO4的浓度为6mmol/L，dNTP的浓度为1.6mmol/L。
环介导等温扩增的反应条件：63℃、60分钟，然后95℃、2min。
结果见图1。
图1A为在正常光照条件下观察的照片(1、2：空白对照；3、4：SPLCV；5、6：SPVC；7、8：SPVG；9、10：SPSMV；11、12：SPV2；13、14：SPFMV)。只有SPLCV显示为黄绿色，空白对照与其它病毒均显示为橙色。
图1B为实时荧光图谱。只有SPLCV显示阳性扩增曲线，空白对照与其它病毒均显示为不扩增的荧光曲线。
实施例3、灵敏度检测
1、提取甘薯卷叶病毒的基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板DNA，进行环介导等温扩增，然后在正常光照条件下观察并拍照。环介导等温扩增过程中，采用实时荧光PCR仪进行实时监测。设置用等体积水代替模板DNA的空白对照。
环介导等温扩增的反应体系(25μl)中，含BstDNA聚合酶的浓度为0.32U/μL，SPLCV-F3和SPLCV-B3的浓度均为0.2μmol/L，SPLCV-FIP和SPLCV-BIP的浓度均为1.6μmol/L，SPLCV-LF和SPLCV-LB的浓度均为0.8μmol/L，钙黄绿素荧光染料的浓度为0.2μmol/L，甜菜碱的浓度为1mol/L，MgSO4的浓度为6mmol/L，dNTP的浓度为1.6mmol/L。环介导等温扩增的反应体系(25μl)中，基因组DNA的浓度为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl或100ag/μl。
环介导等温扩增的反应条件：63℃、60分钟，然后95℃、2min。
结果见图2。
图2A为在正常光照条件下观察的照片(1、2：空白对照；3、4：基因组DNA的浓度为1ng/μl；5、6：基因组DNA的浓度为100pg/μl；7、8：基因组DNA的浓度为10pg/μl；9、10：基因组DNA的浓度为1pg/μl；11、12：基因组DNA的浓度为100fg/μl；13、14：基因组DNA的浓度为10fg/μl；15、16：基因组DNA的浓度为1fg/μl；17、18：基因组DNA的浓度为100ag/μl)。空白对照和基因组DNA的浓度为100ag/μl时显示为橙色，基因组DNA为其它各个浓度均显示为黄绿色。结果表明，灵敏度为1fg/μl。
图2B为实时荧光图谱。空白对照和基因组DNA的浓度为100ag/μl时显示不扩增的荧光曲线，基因组DNA为其它各个浓度均显示为阳性扩增曲线。结果表明，灵敏度为1fg/μl。
3、以步骤1得到的基因组DNA为模板DNA，进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图3。结果表明，灵敏度为10fg/μl。
PCR扩增的引物如下：
SPLCVF：5’-ATGACAGGGCGAATTCCCGTTTCCCG-3’；
SPLCVR：5’-GCAGGGTCTGATACACAGGATTGC-3’。
图3中，1-7依次代表基因组DNA的浓度为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl或1fg/μl
实施例4、应用本发明提供的引物组检测感染病毒的叶片
待测样本为感染甘薯卷叶病毒的甘薯叶片或未感染甘薯卷叶病毒的健康甘薯叶片。
1、提取待测样本的总DNA。
2、以步骤1提取的总DNA为模板，进行环介导等温扩增，然后在正常光照条件下观察并拍照。环介导等温扩增过程中，采用实时荧光PCR仪进行实时监测。设置用等体积水代替模板DNA的空白对照。
环介导等温扩增的反应体系同实施例2。
环介导等温扩增的反应条件同实施例2。
结果见图4。
图4A为在正常光照条件下观察的照片(1：空白对照；2：感染甘薯卷叶病毒的甘薯叶片；3：未感染甘薯卷叶病毒的健康甘薯叶片)。空白对照和未感染甘薯卷叶病毒的健康甘薯叶片显示为橙色，感染甘薯卷叶病毒的甘薯叶片显示为黄绿色。
图4B为实时荧光图谱。空白对照和未感染甘薯卷叶病毒的健康甘薯叶片显示不扩增的荧光曲线，感染甘薯卷叶病毒的甘薯叶片显示为阳性扩增曲线。

Claims (7)

1.引物组，由序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2所示的单链DNA分子、序列表的序列3所示的单链DNA分子、序列表的序列4所示的单链DNA分子、序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成；所述引物组的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒；(b)检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒。
2.权利要求1所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒；(b)检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒。
3.含有权利要求1所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒；(b)检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将所述引物组中的各条引物进行独立包装的步骤。
5.一种鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物组进行环介导等温扩增；如果权利要求1所述引物组可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为甘薯卷叶病毒；如果权利要求1所述引物组不能实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为非甘薯卷叶病毒。
6.一种检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测生物样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，采用权利要求1所述引物组进行环介导等温扩增；如果权利要求1所述引物组可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，所述待测生物样本含有或疑似含有甘薯卷叶病毒；如果权利要求1所述引物组不能实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，所述待测生物样本不含有或疑似不含有甘薯卷叶病毒。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述待测生物样本为植物样本。
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