CN108707697A - 塞尼卡谷病毒的lamp检测引物对及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及塞尼卡谷病毒的LAMP检测引物对，还涉及使用上述引物对的检测方法。该方法特异性高，敏感性与荧光定量PCR一致，而且快速、便捷，可用于SVV的检测，具有较好应用前景。

Description

塞尼卡谷病毒的LAMP检测引物对及检测方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及塞尼卡谷病毒的LAMP检测引物对，还涉及使用上述引物对的检测方法。

背景技术

猪塞尼卡谷病毒（SVV）为最近国内外猪群中新流行的病原，对于养猪业产生较大的威胁。我国是养猪大国，也是最大的生猪生产基地，所以一旦有新的疾病的爆发如果不能加以制止，可能会对我国的养猪业产生巨大的影响，并且造成不小的经济损失。需要高度重视病原的流行动态，做到防患于未然。因此对新发病原建立简单有效的检测方法显得尤为重要。

塞尼卡谷病毒(Seneca Valley Virus)是一种阳性的单链RNA病毒，属小RNA家族。2002年美国马里兰州的盖瑟斯堡塞内卡谷(Seneca Valley)，在PER.C6（转化的胎儿成视网膜细胞）细胞中首次被发现。病毒名称由此而来，即塞尼卡谷病毒，又称塞尼卡病毒A(Senecavirus A，SVA)。加拿大和美国分别在2007年和2012年报告过与此病毒相关的水泡病病例，但是一直到2014年底，关于猪感染该病毒的流行病学、传播和发病机制、病理和临床症状以及诊断等方面的进展甚少，报告的病例也仅在北美国家出现。2015年初，在巴西、中国和泰国相继暴发了猪水泡性疾病，通过分离鉴定获得了塞尼卡谷病毒。与此同时，在美国也发生了新的病例，这引起了世界上很多国家的重视。

目前，常规RT-PCR(qRT-PCR)是最常用的病毒检测方法。qRT-PCR是快速、敏感和特异性强，是能够快速准确地诊断塞尼卡谷病毒的方法。但是，由于塞尼卡谷病毒基因遗传变异，导致病毒检测准确性和灵敏度降低，需要设计更为合适的引物序列用于塞尼卡谷病毒的分子检测，提高特异性和敏感性。

我国于2015年首次发现该病，并逐渐流行，引起我国学者和养猪业高度关注。目前，我国尚无快速诊断方法和商品疫苗。

发明内容

为了解决以上现有技术中塞尼卡谷病毒检测中存在的准确性和灵敏度的问题，本申请提供了一种准确性高、灵敏度强的塞尼卡谷病毒的LAMP检测引物对。

本发明还提供了一种塞尼卡谷病毒的LAMP检测方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

塞尼卡谷病毒的LAMP检测引物对，碱基序列如下：

外引物对F3：5^，-ACACTGCCATAAACACGCAA-3^，，

B3：5^，-TCCCTGTCTAGACAGGAAGG-3^，，

内引物对FIP：5^，-TGATCTGTGCTGCTGGACGGA-TGGGTGTGTTGTGTGCCTA-3^，，

BIP：5^，-CCATCGACAGGTGGTACACTGG-CGGCCTGAAAAGAGAAGGTT-3^，。

一种塞尼卡谷病毒的LAMP检测方法，待检样品使用权利要求1中的LAMP检测引物对使用LAMP方法进行检测。

所述的LAMP检测方法，优选25 μL最佳反应体系成分为：10×Thermopol Buffer2.5 μL，100 mmol·L^-1的MgSO₄ 1.5 μL，10 mmol·L^-1的dNTP 3.5 μL，5μmol·L^-1的外引物F3/B3 各1 μL，40μmol·L^-1的内引物FIP/BIP 各为1 μL，8000U·mL^-1的Bst DNA聚合酶1.5μL，甜菜碱2 μL，灭菌ddH2O 8.5 μL，模板cDNA 1.5 μL。

所述的LAMP检测方法，优选反应温度为59℃，反应时间不少于35min。

所述的LAMP检测方法，优选采用SYBR GreenⅠ+HNB染料进行显色。

所述的LAMP检测方法，优选最低检测限为10copies/µL。

我们根据猪塞尼卡谷病毒（SVV）基因组的P1、P2和P3三个区域，设计三组特异性引物，并通过时间和温度的反应条件优化，建立了SVV RT-环介导等温核酸扩增（LAMP）检测方法。LAMP反应经59 ℃恒温扩增35 min，电泳观察即出现梯行条带，反应产物亦可通过SYBRGreenⅠ+HNB染色进行判断。

本发明的有益效果：

本研究成功建立了猪塞尼卡谷病毒LAMP检测方法。该方法特异性高，与PRRSV、PRV、CSFV、PCV2和猪流行性腹泻病毒（PEDV）等均无交叉反应。将10份临床样品，用优化好的SVV-LAMP方法和荧光定量PCR方法同步检测，结果6份为阳性，两者检测结果一致。敏感性与荧光定量PCR一致，最低检测限为10 copies·µL^-1，而且快速、便捷，可用于SVV的检测，具有较好应用前景。该方法对于条件的要求不高，不需要高昂价格的仪器设备，使用简单的水浴锅装置就能满足实验所需要的条件，具有良好的前景和应用价值。相对传统PCR而言，该方法敏感特异，简便快速，可用于SVV检测和临床诊断。

附图说明

图1 P1、P2和P3三组引物LAMP方法检测SVV毒株的反应产物的电泳图，A:引物P1；B:引物P2；C:引物P3；M: DL2000 DNA分子质量标准，

图2 P1、P2和P3三组引物LAMP方法检测SVV毒株的显色比较，A:引物P1；B:引物P2；C:引物P3，

图3 SVV LAMP反应条件优化结果，A:温度优化；B:时间优化；M: DL2000 DNA分子质量标准；N:阴性对照，

图4 LAMP两种染料可视化效果比较，A:SYBR Green Ⅰ显色结果；B:SYBR Green Ⅰ +HNB显色结果，

图5 LAMP特异性试验结果，1: SVV；2: PRRSV；3: CSFV；4: PCV2；5: PRV；6: PEDV；7:阴性对照，

图6 LAMP-SYBR GreenⅠ+HNB显色法的检测结果，1-7：10⁶ ~10⁰ copies/µL；8：阴性对照，

图7 荧光定量PCR方法的检测结果，1-6：10⁶ ~10¹ copies/µL。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1 材料和方法

1.1 病毒、重组质粒和病料

病毒：SVV L16毒株、PRRSV、PCV2、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）等均由南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室分离，-20°C保存。

重组质粒：pTOPO-SVV-A（含SVV P1基因片段），浓度为500 ng·μL^-1，基因拷贝数为1x10⁹ copies·μL^-1，由南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室构建并提供，-20°C保存。

临床样品：SVV临床发病猪蹄部水泡样品10份，由南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室收集，-20°C保存。

病毒核酸提取

采用TRIZOL试剂说明书方法提取SVV、PRRSV、PEDV及CSFV病毒核酸，并进行反转录制备cDNA作为模板，PCV2和PRV核酸提取按照DNA提取试剂盒说明书进行抽提，反应产物置-20°C保存。

引物设计与合成

根据SVV毒株P1、P2和P3这三个不同的区域，运用在线生物软件（https://primereexplorer.jp/）分别设计三组特异性引物，引物序列见表1，包括一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP，引物由Invitrogen公司合成。

表1 LAMP扩增引物

反应体系

LAMP反应体系25 μL，含10×Thermopol Buffer（NEB公司）2.5 μL、MgSO4（100 mmol·L-1）（NEB公司）1.5 μL、dNTP（10 mmol·L-1）（NEB公司）3.5 μL，内引物FIP/BIP（40 μmol·L-1）各为1 μL，外引物F3/B3（5 μmol·L-1）各1 μL，Bst DNA聚合酶（8000U·mL-1）（NEB公司）1.5 μL，甜菜碱（Betaine）（Sigma公司）2.0 μL，灭菌ddH₂O 8.5 μL，模板DNA 1.5 μL。

检测SVV

反应体系是：cDNA 2μL，Rox Reference Dye0.4μL，引物F/R 400nmol/L，2×PowerSYBR Green PCR Master Mix 10μL，双蒸水补齐至20μL。反应程序为：预变性95℃ 5min；95℃ 10s；60℃ 31s，循环数为40。

采用P1、P1和P3三组不同引物，分别进行LAMP，产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定（图1），同时用SYBR Green Ⅰ（Invitrogen公司）染料进行显色比较（图2），结果显示，P1组引物的LAMP效果最佳，所以选用P1组引物来进行实验。

反应条件优化

采用P1组引物，对LAMP体系内不同浓度组分进行优化，确定25 μL最佳反应体系成分为：10×Thermopol Buffer 2.5 μL，MgSO4（100 mmol·L-1）1.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）3.5 μL，外引物F3/B3（5μmol·L-1）各1 μL，内引物FIP/BIP（40μmol·L-1）各为1 μL，BstDNA聚合酶（8000U·mL-1）1.5 μL，甜菜碱（Betaine）2 μL，灭菌ddH2O 8.5 μL，模板cDNA1.5 μL。

反应温度优化时，将温度设置（59、61、63、65和67℃），反应时间设置为（45、40、35、30、25和20 min ）6个梯度，反应结束后取5 μL反应产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，根据条带扩增效果确定最佳反应条件。结果见图3，表明最佳反应温度为59℃，最短反应时间为35min。

可视性结果观察

采用上述优化反应条件进行LAMP，反应产物分别用SYBR GreenⅠ（Invitrogen公司）和SYBR GreenⅠ+HNB（源叶生物有限公司）两种染料进行显色比较，结果（如图4）显示：采用SYBR GreenⅠ+HNB染料颜色对比更加明显（图4B），阴性显示红色，阳性显示黄色。

特异性试验

取SVV、PRRSV、PCV2、PRV、CSFV和PEDV病毒样品，提取病毒基因组，用LAMP方法检测，采用SYBR GreenⅠ+HNB染料颜色进行检测鉴定。结果如图5所示，SVV管显示黄色，其他管样品均显示红色。

敏感性试验

将SVV重组质粒阳性质粒标准品稀释至10⁶ copies·μL^-1，按10倍倍比稀释至10⁰copies·μL^-1，用上述SVV-LAMP方法和荧光定量PCR方法同步进行敏感性比较。结果显示，1-6管均显示黄色，7和8管均显示红色，即LAMP反应可检测到10 copies/µL浓度的质粒（如图6），与荧光定量PCR灵敏度一致（如图7）。

临床样品的检测

将10份临床样品，用优化好的SVV-LAMP方法和荧光定量PCR方法同步检测，结果6份为阳性，两者检测结果一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.塞尼卡谷病毒的LAMP检测引物对，其特征在于碱基序列如下：

外引物对F3：5^，-ACACTGCCATAAACACGCAA-3^，，

B3：5^，-TCCCTGTCTAGACAGGAAGG-3^，，

内引物对FIP：5^，-TGATCTGTGCTGCTGGACGGA-TGGGTGTGTTGTGTGCCTA-3^，，

BIP：5^，-CCATCGACAGGTGGTACACTGG-CGGCCTGAAAAGAGAAGGTT-3^，。

2.一种塞尼卡谷病毒的LAMP检测方法，其特征在于待检样品使用权利要求1中的LAMP检测引物对使用LAMP方法进行检测。

3.根据权利要求2所述的LAMP检测方法，其特征在于25 μL最佳反应体系成分为：10×Thermopol Buffer 2.5 μL，100 mmol·L^-1的MgSO₄ 1.5 μL，10 mmol·L^-1的dNTP 3.5 μL，5μmol·L^-1的外引物F3/B3 各1 μL，40μmol·L^-1的内引物FIP/BIP 各为1 μL，8000U·mL^-1的Bst DNA聚合酶1.5 μL，甜菜碱2 μL，灭菌ddH2O 8.5 μL，模板cDNA 1.5 μL。

4.根据权利要求2所述的LAMP检测方法，其特征在于反应温度为59℃，反应时间不少于35min。

5.根据权利要求2所述的LAMP检测方法，其特征在于采用SYBR GreenⅠ+HNB染料进行显色。

6.根据权利要求2所述的LAMP检测方法，其特征在于最低检测限为10 copies/µL。