CN114774565A

CN114774565A - 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN114774565A
Application number: CN202210331156.2A
Authority: CN
Inventors: 宫鹏涛; 李珊; 曹松高; 姜维娜; 李建华; 张西臣; 于艳辉; 曹利利; 李新; 王晓岑
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2022-03-30
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2022-07-22

Abstract

本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法，所述试剂盒包含一对用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对、用于CRISPRCas12a反应的crRNA、荧光报告基团、侧向流免疫层析报告基团和Cas12/13通用侧流层析试纸条，以及用于CRISPR反应的缓冲液和Cas12a蛋白，用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:11和16所示，用于CRISPRCas12a反应的crRNA互补的DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；该方法快速、可视，且特异性好，敏感度高，可作为一种临床检测阴道毛滴虫的工具，对设备要求较低，特别适用于大规模人群筛查，为公共卫生机构的监测提供良好的技术手段。

Description

一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及医学检测领域，具体为一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法。

背景技术

阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis，TV)是一种胞外寄生虫，属于单细胞鞭毛原生动物寄生虫，是一种微需氧寄生虫。通过对上皮细胞的粘附作用，从而寄生于宿主的阴道和尿道，TV的发病机制主要为：寄生虫对宿主细胞的杀灭、破坏阴道微生物稳态、通过激活宿主免疫反应引起炎症以及免疫逃避反应等。阴道毛滴虫侵入生殖系统或者泌尿系统后，不论对男性或是女性都会诱发感染，而造成较为严重的后果。该病可表现出生殖器症状，包括阴道红斑、瘙痒和气味，产生灰绿或黄绿色分泌物，排尿困难等。在女性感染中阴道毛滴虫除引起阴道炎外、宫颈炎、尿道炎、不育等，还与许多围产期并发症相关，引起胎膜早破、早产、低体重儿等；在男性感染中可引起阴道毛滴虫性疾病(包括非淋菌性尿道炎、前列腺炎等)，同时阴道毛滴虫感染增加人类免疫缺陷病毒(HIV) 的传播，并与宫颈癌和前列腺癌的发病率和严重程度有关。阴道毛滴虫是全世界最常见的非病毒性传播感染(STI)的病原体，每年将会引起大约2.7亿人感染，然而，没有表现出症状的感染比例估计在40％到80％之间，因此有效的诊断手段对阴道毛滴虫的防治尤为重要。

目前常用的阴道毛滴虫诊断方法有培养法、湿片镜检法等，近年来也陆续开发出酶联免疫法(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)、胶体金快速检测、直接荧光抗体试验(DFA)、胶乳凝集试验(LAT)等用于检测阴道毛滴虫的方法。临床上最常用的诊断方法是湿片镜检法，适用于有感染、分泌物、瘙痒或阴道异味症状的妇女，其操作简单、省时，但由于检测灵敏度跨度比较大，所以检测率浮动较大，不适用于经验不丰富的检验人员。培养法是目前临床诊断上公认的金标准，但其检测方法周期较长，费时费力，此外，培养法和湿片镜检法都需要显微镜人工检查，不能实现自动化批量检测，重复率较差。聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)是一种灵敏度高、特异性强、反应迅速的诊断技术。基于PCR技术已经建立了多种方法用于诊断阴道毛滴虫及基因型的鉴定，在PCR方法基础上，通过引入荧光标记的探针，可以实时检测靶标的扩增情况，称为Real time PCR，这种方法不仅是快速、灵敏，同时也可以进行定量分析，这些方法无论在灵敏度还是在特异性上，都具有其它方法不可比拟的优势，然而这种方法操作比较繁琐，不仅需要相关专业操作培训，还需采购体积较大、价格昂贵的设备，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。除了传统PCR，环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术也已被开发用于检测动物病原体。与传统 PCR相比，LAMP检测方法操作简单，但反应中的多对引物的加入使其可靠性降低，可能产生假阳性检测结果。RPA是一种新型的恒温核酸扩增技术，其最显著的优势就是可在37～42℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，可以在10～ 40min内完成数十亿的DNA拷贝。RPA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应，无需精密仪器，但具有容易出现假阳性等缺点。

CRISPR-Cas技术是一种最新涌现的基因组编辑技术，具有很强的靶标特异性，其利用自身的RNA来和目标DNA进行序列配对，从而识别特异性序列。对于双链DNA来说，CRISPR系统需要额外识别目标DNA上的一个Protospacer Adjacent Motif(PAM)序列。Cas12a的PAM偏好于含有TTTN的序列，因此通过使用含有不同crRNA的CRISPR系统就可识别带有PAM序列并和cr RNA序列匹配的双链DNA。Cas12a蛋白在识别靶标后，它的单链DNA的酶活性被激活，并对体系中任意单链DNA进行无区别的切割，切割速度极快，达到大于1000 个分子每秒，且可以持续数小时以上。Cas12a被序列特异性的双链DNA激活后，切割系统中荧光团猝灭团标记的报道分子，并释放和测量荧光信号。2018年， Doudna团队基于此建立了基于CRISPR的核酸检测方法DETECTR。张峰团队将CRISPR技术与横向流动试纸条结合，开发出SHERLOCK技术，可在2h之内检测出寨卡病毒(ZIKV)和登革热(DHF)。

本发明通过RPA增强Cas12a检测灵敏度，并利用CRISPR-Cas12a的切割效应，弥补RPA易产生假阳性的检测结果，并结合侧向流免疫层析，对阴道毛滴虫进行灵敏、特异、无需昂贵设备和可视化检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种基于RPA-CRISPR-Cas12a 体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法，以解决上述背景技术提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于RPA-CRISPR-Cas12a 体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，包括试剂盒，所述试剂盒包含一对用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对、用于CRISPR Cas12a反应的 crRNA、荧光报告基团、侧向流免疫层析报告基团和Cas12/13通用侧流层析试纸条，以及用于CRISPR反应的缓冲液和Cas12a蛋白。

作为本发明的一种优选技术方案，所述Cas12a蛋白为pGEX-4T-1-Cas12a 重组蛋白。

作为本发明的一种优选技术方案，所述用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和16所示，用于CRISPR Cas12a 反应的crRNA互补的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

作为本发明的一种优选技术方案，所述用于CRISPR Cas12a反应的crRNA 的报告探针为含有TTATT的单链DNA报告序列；用于荧光检测时，荧光报告探针为5′6-FAM-TTATT-BHQ1-3′，用于侧向流免疫层析检测时，试纸条报告探针为5′6-FAM-TTATT-Biotin-3′。

作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒检测阴道毛滴虫时，RPA反应体系20μL：其中包括RPA上游扩增引物0.50μM，RPA下游扩增引物0.50μM， 1×RehydrationBuffer，MgOAc 14mM，待检测样本基因组DNA2μL，其余用水补足至20μL；RPA扩增程序为：恒温37℃或39℃，反应30min。

作为本发明的一种优选技术方案，所述用于CRISPR反应的缓冲液包括： Tris-HClpH＝8.020mM、KCl 100mM、MgCl₂5mM、DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL。

作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒检测阴道毛滴虫时，CRISPR Cas12a检测体系50μL：包含100ng RPA扩增靶基因产物，crRNA250nM、RNase Inhibitor 0.5μL、探针200nM、Tris-HCl pH＝8.020mM、KCl 100mM、MgCl₂5mM、 DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL、加ddH₂O补足至50μL；CRISPR程序为：使用EasyPGX定量PCR仪37℃反应40min，每隔2min采集一次FAM荧光，或在37℃水浴锅反应1h后加入无酶水补足至80uL后滴加于CRISPR Cas12a/Cas13a专用试纸条上肉眼观察结果。

一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的方法，将RPA 特异性扩增与crRNA特异性序列鉴定相结合，使增强的Cas12a检测更具特异性；并在37℃条件下进行检测，适合在缺乏PCR仪等仪器设备的实验室或现场使用；同时可以根据现有条件选取荧光法(通过仪器或蓝光激发肉眼观察)或侧流层析试纸条法(直接裸眼观察)。

本发明的有益效果是：

第一，增强的Cas12a检测不仅可以应用于荧光检测样品的分析，还可以与侧向流免疫层析检测相结合进行可视化，既可以应用于实验室，也可以应用于现场；

第二，增强的Cas12a检测具有更好的稳定性，虽然受到引物、模板等因素的影响，其效率是可变的，但是Cas12a的切活性可以弥补RPA的低效率，假阳性等不足，使增强的Cas12a检测达到令人满意的反应活性与特异性；

第三，在37℃条件下设计并实现了RPA与Cas12a检测的结合，使其易于在设备条件较差的实验室或现场使用，同时其单管反应，同时也避免了反应过程中开盖操作而引起的污染；

综上所述，该方法快速、可视，且特异性好，敏感度高，可作为一种临床检测阴道毛滴虫的工具，对设备要求较低，特别适用于大规模人群筛查，为公共卫生机构的监测提供良好的技术手段。

附图说明

图1所示为CRISPR-Cas12a蛋白纯化后SDS-PAGE结果图；

图2所示为已报道的靶标基因和crRNA检测CRISPR-Cas12a蛋白活性结果图；

图3所示针对阴道毛滴虫保守区actin基因设计crRNA序列筛选的荧光结果图；

图4所示针对crRNA结合位点区域RPA引物筛选的核酸电泳结果图；

图5所示CRISPR-Cas12a检测系统对几种病原微生物的DNA样品与阴道毛滴虫基因组样品信号相比较的特异性检测结果图；

其中图5A为RPA扩增后核酸电泳结果图，图5B为荧光法检测结果图，图5C为侧向流免疫层析法结果图；

图6所示为pGEX-4T-1-actin重组质粒，双酶切鉴定结果图；

图7所示CRISPR-Cas12a检测系统敏感性分析结果图；

其中图7A为RPA扩增后核酸电泳结果图，图7B为荧光法检测结果图，图 7C为侧向流免疫层析法结果图；

图8所示在最优反应体系中阳性和阴性样品检测结果图；

其中图8A为样品荧光法检测结果图，图8B为样品侧向流免疫层析检测结果图，图8C-E为样品巢式PCR检测结果图。

图9所示为RPA-CRISPR-Cas12a检测阴道毛滴虫工作流程示意图；

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明提供一种技术方案：一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，试剂盒包含一对用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性 RPA引物对、用于CRISPR Cas12a反应的crRNA、荧光报告基团、侧向流免疫层析报告基团和Cas12/13通用侧流层析试纸条，以及用于CRISPR反应的缓冲液和Cas12a蛋白，其中，用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对的核苷酸序列如表3所示，用于CRISPR-Cas12a反应的crRNA互补的DNA的核苷酸序列如表2所示；

用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和16所示，用于CRISPR-Cas12a反应的crRNA互补的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

本发明的试剂盒，用于CRISPR-Cas12a反应的报告探针为含有TTATT的单链DNA报告序列；用于荧光检测时，所述的荧光报告探针为 5′6-FAM-TTATT-BHQ1-3′，用于侧向流免疫层析检测时，试纸条报告探针为 5′6-FAM-TTATT-Biotin-3′。

本发明的试剂盒，RPA反应体系20μL：其中包括RPA上游扩增引物0.50μM， RPA下游扩增引物0.50μM，1×Rehydration Buffer，14mM MgOAc，待检测样本基因组DNA 2μL，其余用无酶水补足至20μL；RPA扩增程序：恒温37℃反应30min。

本发明的试剂盒，CRISPR-Cas12a检测体系50μL：包含RPA扩增靶基因产物2μL，crRNA250nM、RNase Inhibitor 0.5μL、探针200nM、Tris-HCl pH＝8.0 20mM、KCl 100mM、MgCl₂5mM、DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL、加 ddH₂O补足至50μL。

本发明基于重组酶聚合酶扩增及CRISPR Cas12a系统，建立了可以应用于临床的快速检测阴道毛滴虫的检测方法，该方法将RPA特异性扩增与crRNA特异性序列鉴定相结合，使增强的Cas12a检测更具特异性；并在37℃条件下进行检测，适合在缺乏PCR仪等仪器设备的实验室或现场使用；同时可以根据现有条件选取荧光法(通过仪器或蓝光激发肉眼观察)或侧流层析试纸条法(直接裸眼观察)；

具体地，选取阴道毛滴虫特异性基因actin的保守区，依据crRNA结合位点附近需带有PAM序列的特性，在保守区内设计并筛选CRISPR Cas12a系统的 crRNA，并根据该crRNA的结合位点设计并筛选特异性RPA引物，以实现RPA 特异性靶基因扩增，以及CRISPR-Cas12a系统对报告基因的切割，建立可用于检测阴道毛滴虫的方法，对RPA体系和CRISPR-Cas12a反应体系进行优化，并对该方法的特异性，敏感性进行评价，结果表明：该方法检测阴道毛滴结果特异性良好，对白色念珠菌(Candida albicans)、人型支原体(Mycoplasmahominis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、人基因组(Human genome)、隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、贾第虫(Giardia lambila,)、弓形虫(Toxoplasmagondii)均无交叉反应，敏感性为1copy/μl，最快可在60min内获得检测结果，并减少凝胶染色时产生的染料污染。

实施例1：

CRISPR-Cas12a重组蛋白的表达纯化及活性检测方法：

1.CRISPR Cas12a蛋白的诱导表达；

(1)将CRISPR-Cas12a基因与原核表达载体pGEX-4T-1连接，并将连接产物转入到表达感受态BL21中，挑取阳性菌落并置于事先分装并高压灭菌后的 LB培养基(5mL/管)中，同时加入5μl氨苄青霉素；转入37℃恒温振荡培养箱中，150r/min，振荡过夜；

(2)取振荡过夜的菌液转移至高压灭菌后的300mL LB培养基中同时加入 300μL的氨苄青霉素，封口后转入37℃恒温振荡培养箱中进行恒温振荡培养 1.5h～2h，OD值约0.6；

(3)加入300μl的IPTG进行诱导，转入16℃恒温振荡培养箱中，150r/min 18-20h后4℃离心机12000r/min 10min，收集菌体；

(4)将菌体重悬后制样，80μl菌液加入20μl蛋白buffer，沸水中煮10min，离心后进行SDS-PAGE；

(5)取PBS对菌体进行重悬，超声破碎，离心取上清。

2.CRISPR-Cas12a蛋白的纯化；

(1)收集超声后的上清，将其转入装有GST琼脂糖凝胶的层析柱中，上样完毕后静置2h，以便谷胱甘肽-S转移酶标签与填料充分结合；

(2)分别用10倍柱体积的漂洗缓冲液(1×PBS)过柱以洗去未结合的杂蛋白；

(3)用洗脱缓冲液(30mL 1×PBS，0.1g还原型谷胱甘肽)将CRISPR-Cas12a 蛋白洗脱下来。纯化的蛋白用0.22μm的滤膜除菌后，分别用200μL离心管分装， -80℃保存备用；

(7)SDS-PAGE电泳分析。

3.CRISPR-Cas12a蛋白活性检测；

(1)采取了已确定具有切割良好反应的T2位点作为测试位点；合成T2 靶标DNA；

T2-F5′-GACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGCTGTC TGTGGAATGCTA-3′

T2-R5′-TAGCATTCCACAGACAGCCCTCATAGTTAGCGTAACGATCTAA AGTTTTGTCGTC-3′

退火获得T2靶标双链DNA，寡核苷酸链退火体系：寡核苷酸链F10μL、寡核苷酸链R10μL(10μM)、10×NEB buffer3.15μL、dd H2O 25μL；

(2)设计crRNA：利用T7启动(TAATACGACTCACTATAGG)+LbCas12a 的scaffold序列(aatttctactaagtgtagat)+靶点序列(靶标DNA PAM序列后的 20-23bp)构成crRNA-F，反向互补为crRNA-R，其中，T7启动子使得退火得到的双链可被T7 RNA聚合酶识别并进行转录，scaffold序列可与LbCas12a结合；

T2-crRNA-F： 5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATGATCGTTACGCTAACTATGA-3′

T2-crRNA-R 5′-TCATAGTTAGCGTAACGATCATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3′

退火后得到DNA双链，再进行体外转录可获得检测所需的crRNA；

(3)据测量的DNA浓度，将退火合成的DNA加入1μg所需的体积，并按体外转录反应体系来准备所需试剂。按照反应体系(T7 polymerase 2μL、NTP Mix 10μL、退火后双链DNA1μg、RNase-Free dd H2O补至30μL)将试剂放在冰上融化，离心混匀，采用封口膜封口，于37℃水浴锅内孵育4h。向离心管内加入 DNaseⅠ(消化去除体系内的剩余的DNA)，于37℃水浴锅内孵育15min；

(4)按照miRNeasyMini Kit(Qiagen)纯化试剂盒进行下一步的产物纯化；

(5)取出2μL利用Nanodrop测浓度，2μL琼脂糖凝胶鉴定crRNA是否降解，保存至液氮；

(6)加入纯化后的Cas12a蛋白200nM、退火获得的T2 DNA靶标200nM、体外转录获得的T2 crRNA250nM、RNase Inhibitor 0.5μL、探针200nM、Tris-HCl pH＝8.020mM、KCl100mM、MgCl₂5mM、DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL、加ddH₂O补足至50μL。将反应体系加入200μL平盖八排管中充分混匀，在 EasyPGX定量PCR仪中37℃反应1h，每隔2min采集一次FAM荧光。同时设置不含靶标DNA或不含Cas12a、crRNA的阴性对照；

结果：

1.CRISPR-Cas12a蛋白纯化后SDS-PAGE；

纯化后的CRISPR cas12a蛋白，经SDS-PAGE电泳分析后，CRISPR cas12a 目的条带单一，大小为161.08KDa(图1)。

2.CRISPR-Cas12a蛋白活性检测；

使用文献中已确定过具有切割良好反应的T2位点作为测试位点，经荧光报实验结果表明只有当靶标基因CRIPR-Cas12a系统同时存在时会激活Cas12a 的DNA酶活性，证明CRIPR-Cas12a重组蛋白具有良好切割活性(图2)。

实施例2：

阴道毛滴虫靶标基因的选取、crRNA设计和RPA引物筛选方法：

1.阴道毛滴虫靶标基因选取、crRNA设计；

(1)阴道毛滴虫靶标基因信息获取：actin基因在阴道毛滴虫中高度保守，临床上常用于基因分型以及病原学检测因此本方法选择在actin基因中选择待检测的阴道毛滴虫靶标序列，同时进行BLAST，证明其特异性；

(2)靶标DNA合成：根据Cas12a的识别富含T的特性，设计了3个保守区切割位点，将靶标DNA的F和R退火合成双链靶标DNA。其具体序列如SEQ ID NO:1-NO:3所示；

(3)利用T7启动子(TAATACGACTCACTATAGG)+LbCas12a的scaffold 序列(aatttctactaagtgtagat)+靶点序列(靶标DNAPAM序列后的20-23bp)构成 crRNA-F，反向互补为crRNA-R。合成crRNA-F/R两条寡核苷酸链，其具体序列如SEQ ID NO:4-NO:6所示。crRNA-F/R退火后，按照实施例1方法体外转录及纯化来获得crRNA；

(4)三组靶标DNATV1、TV2、TV3及对应的crRNA分别加入纯化后的 Cas12a蛋白200nM、退火获得的DNA靶标200nM、体外转录获得的crRNA 250nM、RNase Inhibitor 0.5μL、探针200nM、Tris-HCl pH8.020mM、KCl 100mM、 MgCl₂5mM、DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL、加入ddH₂O补足至50μL；将反应体系加入200μL平盖八排管中充分混匀，在EasyPGX定量PCR仪中37℃反应1h，每隔2min采集一次FAM荧光；同时设置不含靶标DNA或不含Cas12a、crRNA的阴性对照。通过荧光报告实验过程中能否激发出荧光并结合荧光强度初步筛选出一条检测效果较好的crRNA；

2.阴道毛滴虫RPA引物筛选；

(1)依据crRNA结合位点使用Primer Premier 5.0软件设计RPA引物，设定参数为：引物长度28-36bp之间，扩增产物长度在100-200bp之间，GC含量在30-70％之间，Tm>50℃；

(2)初步选取满足上述参数的6个上游引物，4个下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-NO:13以及SEQ ID NO:14-NO:17所示；

(3)RPA扩增体系及程序：依照TwistAmp^TM Basic产品说明书，RPA反应体系20μL：其中包括RPA上游扩增引物0.50μM，RPA下游扩增引物0.50μM， 1×Rehydration Buffer，14mMMgOAc，待检测样本基因组DNA2μL，其余用水补足20μL。RPA扩增程序：恒温37℃反应30min，并依据核酸电泳结果筛选最佳RPA引物；

结果：

1.阴道毛滴虫靶标基因筛选；

根据Cas12a的识别富含T的特性，设计了3个保守区切割位点。三组靶标 DNATV1、TV2、TV3分别加入CRISPR-Cas12a反应体系在EasyPGX定量PCR 仪中37℃反应1h，每隔2min采集一次FAM荧光。同时设置不含靶标DNA或不含Cas12a、crRNA的阴性对照。荧光法结果表明：crRNA1-3均能在30min 时间内达到显著荧光差。且crRNA-2(互补DNA序列如SEQ ID NO:5所示)序列荧光值更高，因此，优选crRNA-2(互补DNA序列如SEQ ID NO:5所示)序列作为后续检测用crRNA(图3)，而crRNA-1、crRNA-3(互补DNA序列如SEQ ID NO:4、NO:6所示)也可作为备选crRNA。

表1靶标DNA候选序列：

SEQ ID NO.	Seq(5′-3′)	GC	Efficiency
				1	CCTCTACTCCTCTGGCCGTA	0.57	0.9816
2	GATGCTGGTCATGGTCTTTC	0.50	0.9390
				3	CCATCCGTTGTTGGCCGTCC	0.65	0.7099

表2 crRNA候选序列：

SEQ ID NO.	Seq(5′-3′)
		4	GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATCCTCTACTCCTCTGGCCGTA
5	GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATGATGCTGGTGATGGTGTTTC
		6	GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATCCATCCGTTGTTGGCCGTCC

1.阴道毛滴虫RPA引物筛选

在满足RPA引物设计要求的情况下，设计合成6个RPA上游引物和4个下游引物(见表3)，并依照TwistAmp^TM Basic产品说明书，使用TV基因组作为模板，选择2号下游引物筛查所有正向引物，挑选最佳正向引物，然后使用最佳正向引物筛选反向引物，以此找到良好的引物对(图4A、图4B)。

表3 RPA候选引物序列：

实施例3

CRISPR-Cas12a结合RPA对TV检测的灵敏性和特异性评估方法：

1.CRISPR-Cas12a结合RPA对TV检测的特异性实验；

(1)依照血液和组织样品基因组DNA提取试剂盒(DP304-02)对包括阴道毛滴虫、白色念珠菌、人型支原体、淋病奈瑟氏菌、大肠杆菌、人基因组、隐孢子虫、贾第虫、弓形虫在内的常见病原微生物进行基因组提取，并使用 Nanodrop为基因组进行定量；

(2)利用实施例2已筛选的RPA引物，扩增待检基因产物，RPA反应体系20μL：其中包括RPA上游扩增引物0.50μM，RPA下游扩增引物0.50μM， 1×Rehydration Buffer，14mMMgOAc，待检测样本基因组DNA2μL，其余用水补足20μL。RPA扩增程序：恒温37℃反应30min,。并依据核酸电泳结果判断引物特异性；

(3)取RPA扩增产物，加入CRISPR-Cas12a反应体系。50μL终体系中包含Cas12a蛋白200nM、2μL Targe(即RPA扩增靶基因产物)、实施例2中筛选的crRNA250nM、RNaseInhibitor 0.5μL、ssDNA-Reporter 200nM(所用的序列为5′-FAM-TTATT-BHQ1-3′)、Tris-HCl pH 8.020mM、KCl 100mM、MgCl₂ 5mM、DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL，加ddH₂O补足至50μL。将反应体系加入200μL平盖八排管中充分混匀，在EasyPGX定量PCR仪中37℃反应1h，每隔2min采集一次FAM荧光；

(4)取RPA扩增产物，加入CRISPR-Cas12a反应体系。50μL终体系中包含Cas12a蛋白200nM、2μL Targe(即RPA扩增靶基因产物)、实施例2中筛选的crRNA250nM、RNaseInhibitor 0.5μL、ssDNA-Reporter 200nM(所用的序列为5′6-FAM-TTATT-Biotin-3′)、Tris-HCl pH8.020mM、KCl 100mM、MgCl₂ 5mM、DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL，加ddH₂O补足至50μL。将反应体系加入200μL平盖八排管中充分混匀，在37℃水浴锅反应1h，然后将Cas12/13 专用核酸检测试纸条(Tiosbio Inc公司)放入溶液中，孵育5分钟后肉眼观察结果。

2.CRISPR-Cas12a结合RPA对TV检测的敏感性实验；

(1)根据TV保守区actin基因设计扩增带有同源重组位点的PCR引物：

P1:ccgcgtggatccccggaattcGGCTTCTCTGGCGATGAAGC

P2:ctcgagtcgacccgggaattcCTCCTTGGTGATAACCATCTGTGG

将扩增产物回收，并连接至pGEX-4T-1载体上以获得含有保守区的质粒，测定DNA浓度，根据公式拷贝数(copies/μL)＝6.02×10²³×质粒浓度(ng/μL) ×10^-9/(质粒碱基数×660)计算其拷贝数，并对其进行10倍连续稀释至1copy/μL，设立水为阴性对照；

(2)利用实施例2已筛选的RPA引物，扩增稀释后重组质粒，RPA反应体系20μL：其中包括RPA上游扩增引物0.50μM，RPA下游扩增引物0.50μM， 1×Rehydration Buffer，14mMMgOAc，待检测样本基因组DNA2μL，其余用水补足20μL。RPA扩增程序：恒温37℃反应30min；并依据核酸电泳结果判断其敏感性；

(3)取RPA扩增产物，加入CRISPR-Cas12a反应体系。50μL终体系中包含Cas12a蛋白200nM、2μL-Targe(RPA扩增靶基因产物)、实施例2中筛选的 crRNA 250nM、RNaseInhibitor 0.5μL、ssDNA-Reporter 200nM(所用的序列为 5′-FAM-TTATT-BHQ1-3′)、Tris-HCl pH8.020mM、KCl 100mM、MgCl₂5mM、DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL、加ddH₂O补足至50μL。将反应体系加入 200μL平盖八排管中充分混匀，在EasyPGX定量PCR仪中37℃反应1h，每隔 2min采集一次FAM荧光；

(4)取RPA扩增产物，加入CRISPR-Cas12a反应体系。50μL终体系中包含Cas12a蛋白200nM、2μL-Targe(RPA扩增靶基因产物)、实施例2中筛选的 crRNA 250nM、RNaseInhibitor 0.5μL、ssDNA-Reporter 200nM(所用的序列为 5′6-FAM-TTATT-Biotin-3′)Tris-HCl pH8.020mM、KCl 100mM、MgCl₂5mM、 DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL、加ddH₂O补足至50μL。将反应体系加入 200μL平盖八排管中充分混匀，在37℃水浴锅反应1h，然后将Cas12/13专用核酸检测试纸条(Tiosbio Inc公司)放入溶液中，孵育5分钟后肉眼观察结果。

结果：

1.CRISPR-Cas12a结合RPA对TV检测的特异性实验；

利用实施例2已筛选的RPA引物，依照TwistAmp^TM Basic产品说明书，分别扩增阴道毛滴虫、白色念珠菌、人型支原体、淋病奈瑟氏菌、大肠杆菌、人基因组、隐孢子虫、贾第虫、弓形虫基因组，经酚氯仿抽提后进行琼脂糖核酸电泳检测(图5A)；

取RPA扩增产物，加入CRISPR Cas12a反应体系，分别通过荧光报告实验的荧光曲线结果和侧流层析试纸条观察结果进行比较(图5B、图5C)；

结果表明：该检测方法阴道毛滴虫特异性良好，对白色念珠菌、人型支原体、淋病奈瑟氏菌、大肠杆菌、人基因组、隐孢子虫、贾第虫、弓形虫均无交叉反应；

2.CRISPR-Cas12a结合RPA对TV检测的敏感性实验；

扩增TV actin基因产物回收，连接至pGEX-4T-1载体上,进行双酶切鉴定(图6)，并对重组质粒进行倍比稀释。利用实施例2已筛选的RPA引物，依照 TwistAmp^TMBasic产品说明书，分别扩增稀释后重组质粒，经酚氯仿抽提后进行琼脂糖核酸电泳检测(图7A)。

取RPA扩增产物，加入CRISPR Cas12a反应体系，分别通过荧光报告实验的荧光曲线结果和侧流层析试纸条观察结果进行比较(图7B、图7C)。

结果表明：该阴道毛滴虫检测方灵敏性良好，最高敏感性可达1copy/μL。

实施例4

临床样品检验方法：

(1)从医院取30份人阴道拭子依照血液和组织样品基因组DNA提取试剂盒(DP304-03)提取基因组，并使用Nanodrop为基因组进行定量；

(2)利用实施例2已筛选的RPA引物，依照TwistAmp^TM Basic产品说明书，先用29.5uLrehydrationbuffer重悬蛋白冻干粉，之后分装于200uL离心管中，使每个RPA反应总体系20μL，上下颠倒混匀后离心使反应混合物置于管底。每50uL CRISPR Cas12a反应混合物包括纯化后的Cas12a蛋白200nM、退火获得的DNA靶标200nM、体外转录获得的crRNA250nM、RNase Inhibitor 0.5uL、报告探针200nM、Tris-HCl pH 8.020mM、KCl 100mM、MgCl₂5mM、DTT 1mM、 5％甘油、肝素50μg/mL。取20uL CRISPR Cas12a反应混合物滴加于离心管盖，将离心管放入37℃水浴锅中反应20min，然后进行瞬离使CRISPR-Cas12a反应体系与RPA反应体系混合。使用荧光检测手段，CRISPR-Cas12a反应体系中的报告探针ssDNA应选择5′6-FAM-TTATT-BHQ1-3′，并将离心管放入EasyPGX 定量PCR仪中37℃反应40min，每隔2min采集一次FAM荧光。若使用测流层析试纸条检测手段，CRISPR Cas12a反应体系中的报告探针ssDNA应选择 5′6-FAM-TTATT-Biotin-3′，并在37℃反应1h后加入无酶水补足至80uL后滴加于CRISPR Cas12a/Cas13a专用试纸条上肉眼观察结果；

(3)利用已建立的巢式PCR检测方法对其进行检测，对检出结果进行比较。

结果：

利用实施例2已筛选的RPA引物，依照TwistAmp^TMBasic产品说明书，扩增30份人阴道分泌物基因组，取RPA扩增产物，加入CRISPR Cas12a反应体系，30min后即可通过荧光报告实验的荧光曲线结果和侧流层析试纸条观察结果进行比较，阴道毛滴虫感染率均为26.67％(图8A-图8C)。

利用已建立的巢式PCR检测方法对其进行检测，阴道毛滴虫感染率为23.33%（图8D-图8E），并对对检出结果进行比较。结果表明荧光报告实验结果与侧流层析试纸条结果符合率为100%，该方法重复性良好可用于临床检测。

以上结果证明该检测方法可用于临床样品中阴道毛滴虫的快速检测，结合现场的实验条件和检测样品的数量可以采取不同的检测方法，在使用荧光检测仪操作时，在实验室预先制备样品基因组条件下，可在60min中内完成检测过程，而在通过试剂条检测时亦可在75min之内获得检测结果，相对于实验室常规PCR检测方法(扩增90min，琼脂糖凝胶电泳检测30min)，本发明的方法可以实现快速可视化检测，并减少凝胶染色时产生的染料污染。

以上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，包括试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含一对用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对、用于CRISPR Cas12a反应的crRNA、荧光报告基团、侧向流免疫层析报告基团和Cas12/13通用侧流层析试纸条，以及用于CRISPR反应的缓冲液和Cas12a蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于：所述Cas12a蛋白为pGEX-4T-1-Cac12a重组蛋白。

3.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于：所述用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和16所示，用于CRISPR Cas12a反应的crRNA互补的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

4.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法，其特征在于：所述用于CRISPR Cas12a反应的crRNA的报告探针为含有TTATT的单链DNA报告序列；用于荧光检测时，荧光报告探针为5′6-FAM-TTATT-BHQ1-3′，用于侧向流免疫层析检测时，试纸条报告探针为5′6-FAM-TTATT-Biotin-3′。

5.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒检测阴道毛滴虫时，RPA反应体系20μL：其中包括RPA上游扩增引物0.50μM，RPA下游扩增引物0.50μM，1×Rehydration Buffer，MgOAc 14mM，待检测样本基因组DNA2μL，其余用水补足至20μL；RPA扩增程序为：恒温37℃或39℃，反应30min。

6.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于：所述用于CRISPR反应的缓冲液包括：Tris-HCl pH＝8.020mM、KCl100mM、MgCl₂5mM、DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL。

7.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒检测阴道毛滴虫时，CRISPR Cas12a检测体系50μL：包含100ng RPA扩增靶基因产物，crRNA250nM、RNase Inhibitor0.5μL、探针200nM、Tris-HCl pH＝8.020mM、KCl 100mM、MgCl₂5mM、DTT1mM、5％甘油、肝素50μg/mL、加ddH₂O补足至50μL；CRISPR程序为：使用EasyPGX定量PCR仪37℃反应40min，每隔2min采集一次FAM荧光，或在37℃水浴锅反应1h后加入无酶水补足至80uL后滴加于CRISPR Cas12a/Cas13a专用试纸条上肉眼观察结果。

8.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的方法，其特征在于：将RPA特异性扩增与crRNA特异性序列鉴定相结合，使增强的Cas12a检测更具特异性；并在37℃条件下进行检测，适合在缺乏PCR仪等仪器设备的实验室或现场使用；同时可以根据现有条件选取荧光法(通过仪器或蓝光激发肉眼观察)或侧流层析试纸条法(直接裸眼观察)。