CN112195257A

CN112195257A - 一种检测副溶血弧菌的引物组、试剂、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN112195257A
Application number: CN202011113310.6A
Authority: CN
Inventors: 董进法; 林春美; 赖宏祉; 梁耀极; 谢璐; 李俊博; 何颖; 张巍; 廖文
Original assignee: Liaoning Baihao Biotechnology Co ltd
Current assignee: Liaoning Baihao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-10-17
Filing date: 2020-10-17
Publication date: 2021-01-08

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种用于检测副溶血弧菌的引物组、试剂、试剂盒和检测方法。本发明的引物组特异性好、灵敏度高、检测时间短，且无需特殊的仪器，实验时间成本、操作的简便度和检测成本明显降低。

Description

一种检测副溶血弧菌的引物组、试剂、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，特别是涉及一种检测副溶血弧菌的引物组、试剂、试剂盒及检测方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，V.p)是一种革兰氏阴性嗜盐菌，是海水和江河口环境中的固有微生物。它能通过食物和水引起人类的疾病，同时也对生长在海水和江河口环境中的动物有致病性，包括养殖的动物。V.p广泛存在于各种海产品中，鱼体带菌率约为20％～90％。一般情况下，海产品体内外均带菌，但当海产品作为食品被捕捞后，体外菌体迅速死亡，体内的副溶血性弧菌会很快感染整个海产品。

中国水产品出口国主要集中在日本、美国、欧盟和韩国，仅这四大市场就占到了总出口量的85％左右。而这四个国家对进口水产品的安全要求中都明确规定副溶血性弧菌等致病菌一律不得检出。对原产自中国的进口水产品强制性要求进行V.p检测，检测结果为阳性时产品将被就地销毁，这给我国水产品的出口设置了贸易壁垒。

目前V.p的分子生物学检测方法主要有PCR技术，包括常规PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR等，这些方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时、对标本的纯度要求低、不需要分离细菌等特点，因此在国内外被研究人员广泛应用于V.p的检测。但传统基于PCR的方法需要变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的温度不一样，需要专门的热循环仪来进行，限制了其使用范围。并且，现有的用于检测副溶血弧菌的引物组，只适用于特定方法(如传统PCR)，并不适用于RPA扩增，因而不能与检测条件相匹配从而达到最好的检测效果。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种检测副溶血弧菌的引物组，本发明的第二目的在于提供一种检测副溶血弧菌的试剂，本发明的第三目的在于提供一种检测副溶血弧菌的试剂盒，本发明的第四目的在于提供上述引物组、试剂和试剂盒的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：本发明提供一种检测副溶血弧菌的引物组，所述引物组为RPA扩增副溶血弧菌引物组及cas12a检测中crRNA的引物组。

本发明还提供了一种检测副溶血弧菌的试剂，所述试剂包括上述的引物组。

本发明还提供了一种检测副溶血弧菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组或试剂。

进一步地，所述试剂盒还包括醋酸镁溶液、再水化缓冲液、冻干酶粉、CutSmartBuffer、Recombinant RNase Inhibitor、DNA荧光探针、Cas12a(Cpf1)、VP-crRNA。

本发明还提供了上述的引物组或试剂或试剂盒在制备检测待测样品是否感染副溶血弧菌的产品中的应用。

采用以上结构后，本发明具有如下优点：本发明提供一种检测副溶血弧菌的引物组，针对副溶血弧菌的保守序列，设计特异性扩增引物组，并基于该引物组建立了副溶血弧菌的 RPA-cas12a一步法检测方法，可对副溶血弧菌进行定性检测。通过试验证明：本发明的扩增引物组特异性强，同时兼具高灵敏度，使用本发明提供的引物组检测时间短、无需特殊的检测仪器，并且，其灵敏度与PCR方法不相上下，但是检测所用的成本和时间成本明显降低，此外还具有较强的操作简便度。含有该引物组的试剂或试剂盒可以特异性的检测、检测副溶血弧菌的RPA-cas12a的方法灵敏，结果准确，操作简便、快速，便于在基层医疗检疫机构推广。

附图说明

图1为本发明实施例中用于检测腹泻中副溶血弧菌RPA-cas12a的试剂盒的第一组验证结果；

图2为本发明实施例中用于检测腹泻中副溶血弧菌RPA-cas12a的试剂盒的第二组验证结果；

图3为本发明实施例2中用于检测副溶血弧菌的引物组特异性检测结果；

图4为本发明实施例5中用于检测副溶血弧菌的引物组灵敏度检测结果；

图5为本发明实施例6中荧光PCR灵敏度检测结果；

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是：

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于检测副溶血弧菌的引物组，所述引物组包括RPA 引物和cas12a crRNA引物。

VP-RPA引物：

VP-RPA-F:CGCTTTCTTCAGACTCAAGCTCAATTGAAGT VP-RPA-R:

TTCAACGATTGCGTCAGAAGACGTCGCTAAAG

VP-crRNA引物：

VP-crRNA-F:gaaattaatacgactcactataGGGTAAT

VP-crRNA-R:AATGACGCCTCTGCTAATGAGGT 24nt

本发明针对副溶血弧菌的保守序列，设计特异性RPA扩增引物组，本发明的扩增引物组特异性强，同时兼具高灵敏度，使用本发明提供的引物组检测时间短、无需特殊的检测仪器，并且，其灵敏度与PCR方法不相上下，但是检测所用的成本和时间成本明显降低，此外还具有较强的操作简便度。具体扩增序列如下：

CGCTTTCTTCAGACTCAAGCTCAATTGAAGTTGAAGAACCTGCTTCTGATAACAATGACGCCTCTGCTAATGAGGTAGAA ACGATCGTAGAGCCGCCTTTAGCGACGTCTTCTGACGCAATCGTTGAA

本发明还提供了一种检测副溶血弧菌的RPA-cas12a核酸检测方法，所述方法包括的RPA 试剂及cas12a检测试剂。

该检测方法利用本发明提供的引物组，能够特异性地快速检测出副溶血弧菌。

该试剂盒以上述引物组为检测基础，可以快速地、特异性地检测出副溶血弧菌。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括醋酸镁溶液、再水化缓冲液、冻干酶粉、 CutSmart Buffer、Recombinant RNase Inhibitor、DNA荧光探针、Cas12a(Cpf1)、VP-crRNA。

其中，醋酸镁溶液的浓度优选为280mmol/L，上述冻干酶粉、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)、醋酸镁溶液、CutSmart Buffer、Recombinant RNase Inhibitor、DNA荧光探针、 Cas12a(Cpf1)均可为市面上的市售成品。

另外，本发明还提供了一种鉴定副溶血弧菌的检测方法，用上述的引物组对待测样品进行RPA-cas12一步法扩增检测鉴定副溶血弧菌。

基于上述引物组建立了副溶血弧菌的RPA-as12a一步法检测方法，可对副溶血弧菌进行定性检测。该方法灵敏，结果准确，操作简便、快速，可以实现对副溶血弧菌的筛选及快速诊断，便于在基层医疗检疫机构推广。

需要说明的是，本发明提供的鉴定副溶血弧菌的检测方法为非疾病的诊断和/或治疗目的，例如该检测方法可以用于鉴定混合病毒中是否掺杂有副溶血弧菌等。

在一些优选的实施方式中，所述RPA-cas12a检测的条件包括：检测温度36-40℃，检测时间1h。

扩增温度典型但非限制性的为36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为37℃；检测时间典型但非限制性的为20min、30min、45min，1h。优选为1h。RPA-cas12a检测仅需要一步操作即可完成检测，避免了复杂的扩增后再检测过程，且反应温度恒定在较低的温度下进行，不需要特殊的热循环设备，能够有效节约成本，同时反应时间短，能够迅速得到检测结果。实现不依赖于专业人员、专业仪器及检测条件的快速检测试剂。

实施例1：引物组的设计

针对副溶血弧菌的保守序列，设计检测副溶血弧菌的RPA引物组，产物大小为128bp，具体引物组和扩增产物的序列如下：

表1引物组和RPA-cas12a扩增检测产物全长的序列

实施例2：用于检测副溶血弧菌的试剂盒

该试剂盒包括实施例1中的上游引物RPA-VP-F、下游引物RPA-VP-R、含冻干酶粉管、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)、醋酸镁溶液(280mmol/L)、CutSmart Buffer、Recombinant RNase Inhibitor、DNA荧光探针、Cas12a(Cpf1)、VP-crRNA。上述含冻干酶粉管、再水化缓冲液 (Rehydration Buffer)和醋酸镁溶液(280mmol/L)均来源于RPA扩增试剂盒TwistAmp Basic kits。

实施例3：鉴定副溶血弧菌的检测方法

RPA-cas12a荧光检测

以待测样品的DNA为模板，采用实例2中的试剂盒，利用RPA-VP-F和RPA-VP-R引物组及crRNA进行RPA-cas12a一步法检测。同时设置空白对照(DNA模板为无核酸酶水)。

RPA-cas12a检测体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、去离子水8.1μL、上、下游引物各1.5μL(引物浓度均为10μM)，CutSmart Buffer 9μL、Cas12a(Cpf1)(1nM)4.5μL、VP-crRNA 4.5μL、Recombinant RNase Inhibitor 4.5μL(用前与水以2:3比例稀释)、DNA荧光探针4.5μL(10nM) (用前与以水1:4比例稀释)，混匀离心，混液可分成三份，每份22.5μL于新的0.2mLEP 管中，再向管中分别加入模板DNA或阴性对照0.5μL，最后再加入醋酸镁溶液2μL(280mmol/L)。

RPA-cas12a反应条件：将上述体系充分混匀离心，置于37℃温箱孵育。

实施例4：用于检测致副溶血弧菌的试剂盒的验证

提取海产品中的副溶血弧菌及腹泻中的副溶血弧菌DNA样品，保存于-80℃冰箱备用。

以上述获得的DNA为模板，采用实例2中的试剂盒，利用RPA-VP-F和RPA-VP-R引物组及 crRNA进行RPA-cas12a一步法检测。同时设置空白对照(DNA模板为无核酸酶水)。

RPA-cas12a反应条件：将上述体系充分混匀离心，置于37℃温箱孵育。1h后蓝光拍照观察结果

结果如图1(1-11：腹泻中的副溶血弧菌；-：阴性对照)图2(13-50：海产品中的副溶血弧菌；-：阴性对照)所示：副溶血弧菌的荧光照片出现荧光亮度，而阴性对照无条带。

实施例5：用于检测副溶血弧菌的引物组特异性检测

采用RPA扩增检测副溶血弧菌RPA引物特异性。

RPA扩增体系的配制方法如下：

向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5 μL、去离子水15μL、上、下游引物各1μL，混匀后分装在0.2mL新的离心管中，每管体积23.25μL。再分别向每管加入模板DNA、阴性对照0.5μL，最后再加入醋酸镁溶液1.25μL(280mmol/L)，每管总体积25μL。

RPA扩增反应条件：

将上述RPA扩增体系充分混匀，置于37℃恒温箱20min，得到RPA扩增产物。

RPA扩增产物的电泳检测：

RPA反应结束后，分别向RPA扩增产物中加入15μL去RNA酶水、8μL 6×loadingbuffer，充分混匀，轻离心，进行琼脂糖凝胶电泳，采用3％琼脂糖凝胶，160V，25min，凝胶成像系统观察结果。

结果如图3(M:maker；1：副溶血弧菌；2：阴性对照)所示：副溶血弧菌的RPA扩增产物含有1个条带，大小为128bp，而阴性对照无条带。

采用RPa-cas12a荧光法检测副溶血弧菌crRNAt特异性。结果如图2(43：副溶血弧菌标准菌株；12：溶藻弧菌；-：阴性对照)所示：从图中可以看出，只有副溶血弧菌的荧光照片出现荧光，溶藻弧菌和阴性对照荧光出现。

说明本发明提供的用于检测副溶血弧菌的引物组、试剂及试剂盒可以有效检测副溶血弧菌。

实施例6：用RPA-cas12a检测副溶血弧菌与荧光PCR检测灵敏度的对比

将实例4中提取海产品中的副溶血弧菌及腹泻中的副溶血弧菌DNA样品进行荧光PCR检测。

检验方法：参照副溶血弧菌TLH/TDH/TRH基因核酸检测试剂盒(荧光PCR法)说明书，每个荧光PCR体系包括PCR反应液5μL，酶混合液0.2μL，副溶血弧菌TLH/TDH/TRH基因反应液4μL，去RNA酶水10.8μL，每个PCR反应管中分别加入DNA、空白对照、阳性对照各5μL，终体积25μL。荧光PCR扩增检测条件见表2。

表2.荧光PCR扩增检测条件参照

荧光PCR反应结束后进行结果分析(FAM通道为VP TLH基因，VIC通道为VP TDH基因， ROX通道为VP TRH基因。(1)阳性：待测样本检测结果Ct≤35，曲线呈S型且有明显指数增长期。(2)阴性：待测样本检测结果Ct＞38或未检出)

从图1和图5中可以看出，本发明的RPA-cas12a检测方法灵敏度与荧光PCR相同，但耗时短。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 1

<120> 一种检测副溶血弧菌的引物组、试剂、试剂盒及检测方法

<130> 2020.9.29

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

cgctttcttc agactcaagc tcaattgaag t 31

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcaacgatt gcgtcagaag acgtcgctaa ag 32

<210> 3

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

cgctttcttc agactcaagc tcaattgaag ttgaagaacc tgcttctgat aacaatgacg 60

cctctgctaa tgaggtagaa acgatcgtag agccgccttt agcgacgtct tctgacgcaa 120

tcgttgaa 128

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaattaata cgactcacta tagggtaat 29

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 5

aatgacgcct ctgctaatga ggt 23

Claims

1.一种检测副溶血弧菌的引物组，其特征在于：所述引物组为RPA扩增特定引物组。

2.一种检测副溶血弧菌的试剂，其特征在于：所述试剂包括权利要求1所述的引物组及crRNA。

3.根据权利要求2所述的一种用于检测副溶血弧菌的试剂，其特征在于：所述试剂包括CutSmart Buffer、Recombinant RNase Inhibitor、DNA荧光探针、Cas12a(Cpf1)。

4.一种检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂。

5.根据权利要求4所述的一种检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括醋酸镁溶液、再水化缓冲液和冻干酶粉。

6.根据权利要求4所述的一种检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括cas12a检测试剂，包括CutSmart Buffer、Recombinant RNase Inhibitor、DNA荧光探针、Cas12a(Cpf1)、VP-crRNA。

7.一种副溶血弧菌的检测方法，用上述权利要求1-6中任意一项所述的引物组对待测样品进行RPA-cas12一步法扩增检测鉴定副溶血弧菌。