CN111394490A

CN111394490A - 用于土拉杆菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用

Info

Publication number: CN111394490A
Application number: CN202010411252.9A
Authority: CN
Inventors: 袁媛; 白欣茹; 王景林; 孙岩松; 辛文文; 康琳; 凤梓涵; 高姗
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2040-05-15
Also published as: CN111394490B

Abstract

本发明公开了用于土拉杆菌的CRISPR‑Cas12a检测引物组及其应用。本发明提供了用于检测土拉杆菌的引物组，由RPA引物对和crRNA组成；所述RPA引物对是根据土拉杆菌基因组中SEQ ID No.1所示核苷酸序列设计的；所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列能够与cas蛋白结合，所述向导序列与所述RPA引物对的扩增产物序列相匹配。本发明具有检测时间短、扩增效率高、灵敏度好且特异性强等特点，对土拉杆菌阳性质粒的检测灵敏度可达900拷贝/mL，对土拉杆菌基因组的检测灵敏度可达1260fg/mL。本发明在土拉杆菌的现场诊断方面具有广阔的应用前景。

Description

用于土拉杆菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于土拉杆菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用，更加具体的涉及用于土拉杆菌的CRISPR-Cas12a检测引物、crRNA及其用途。

背景技术

土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis，简称土拉杆菌)是一种革兰氏阴性菌，可引起土拉热。土拉杆菌根据其生化性质、毒力和地理分布可分为4个亚种，其中土拉亚种也被称为A型，全北极亚种被称为B型，广泛分布于北半球，可感染包括人类在内的250多种动物，引起土拉热暴发流行。土拉杆菌是潜在的生物恐怖武器，二战和冷战期间曾被用于细菌武器。到目前为止，我国分离株及分子流行病调查显示中国土拉杆菌均为B型。土拉杆菌可经多种途径感染：节肢动物叮咬，接触感染的组织，吸入污染的灰尘和饮用水都会引起人类的感染。快速诊断土拉杆菌感染是治疗和预防土拉热病的关键。目前土拉杆菌的检测方法主要是基于传统培养方法上的检测和PCR方法。基于纯培养物的生化鉴定实验效率低，无法满足当前检测工作中对样品进行快速检测的要求，因为培养土拉杆菌培养需要有生物安全3级实验室条件，而且该菌生长缓慢，营养要求苛刻，培养周期较长，容易延误诊断；基于抗原抗体免疫反应的胶体金免疫层析法，检测灵敏度和特异性又受限；土拉杆菌的荧光定量PCR和普通PCR国内外都有应用，但因其需要精密昂贵的检测仪器和良好的实验环境，很难用于基层实验室和野外现场等地区，急需有关土拉杆菌的快速检测方法。

重组酶聚合酶介导的扩增技术(RPA)是近年兴起的一种恒温扩增技术，通过三种酶的混合物，即能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右，整个过程一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。但是，从原理上，其单级扩增反应的本质并未改变，相较于目前市场上多数的实时定量PCR(Q-PCR)检测方式，并不能有实质性的灵敏度提升。

发明内容

针对上述问题本发明旨在提供一种用于土拉杆菌的CRISPR检测引物和crRNA，将此引物组及crRNA用于基于CRISPR技术的基因检测中可快速现场检测土拉杆菌，具有特异性好，灵敏度高，简易的优点

第一方面，本发明要求保护一种用于检测土拉杆菌的引物组。

本发明所要求保护的用于检测土拉杆菌的引物组，由RPA引物对和crRNA组成。

所述RPA引物对是根据土拉杆菌基因组中SEQ ID No.1所示核苷酸序列设计的。

所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列能够与cas蛋白结合，所述向导序列与所述RPA引物对的扩增产物序列相匹配。

进一步地，所述RPA引物对为能够以土拉杆菌基因组为模板扩增得到SEQ ID No.1的第678-840位所示DNA片段的引物对。所述crRNA中，所述锚定序列可为SEQ ID No.8的第1-21位，所述向导序列可为SEQ ID No.8的第22-45位。

更进一步地，所述RPA引物对为由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA组成的引物对。所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

第二方面，本发明要求保护一种用于检测土拉杆菌的试剂盒。

本发明所要求保护的用于检测土拉杆菌的试剂盒，含有前文所述的引物组。

进一步地，所述试剂盒还可含有如下中的全部或部分：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和醋酸镁。

进一步地，所述试剂盒还可含有cas12a蛋白和/或信号报告探针和/或阳性参考质粒。

在本发明的具体实施方式中，所述cas12a蛋白具体为LbCas12a蛋白。

更进一步地，所述信号报告探针的序列可如SEQ ID No.9所示，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在本发明的具体实施方式中，所述荧光报告基团具体为FAM，所述荧光淬灭基团具体为BHQ1。

即，所述信号报告探针为：5’-FAM-TTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。

更进一步地，所述阳性参考质粒可为含有SEQ ID No.1的第283-1219位所示DNA片段的质粒。如将SEQ ID No.1的第283-1219位所示DNA片段克隆到pEASY-T1载体后得到的重组质粒。

第三方面，本发明要求保护前文所述引物组或所述试剂盒在如下任一中的应用：

(A1)制备用于检测土拉杆菌的产品，或检测土拉杆菌；

(A2)制备用于诊断土拉杆菌感染的产品；

(A3)制备用于诊断土拉热的产品。

在(A1)中，所述检测土拉杆菌的应用为非疾病诊断治疗性应用。

第四方面，本发明要求保护一种检测土拉杆菌的方法。

本发明要求保护的检测土拉杆菌的方法，可包括如下步骤：

(b1)从待测样本中提取DNA；

(b2)以(b1)提取的DNA为模板，采用前文所述的RPA引物对进行RPA扩增，得到扩增产物；

(b3)取(b2)所得扩增产物，加入前文所述的信号报告探针、前文所述的cas12a蛋白和前文所述的crRNA，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，根据检测信号确定检测结果。

所述方法为非疾病诊断治疗性方法。

在本发明的具体实施方式中，步骤(b2)进行所述RPA扩增时的反应温度为39℃，反应时间为10～20min(如20min)。

在本发明的具体实施方式中，步骤(b3)进行所述CRISPR反应时的反应温度为37℃，反应时间为10～30min(如30min)。

在本发明的具体实施方式中，步骤(b3)每1min读取荧光值；使用累积荧光值作为信号强度，按照以下标准进行分析判定：

阴性判断标准：荧光量小于或等于阴性对照荧光量的2倍。阳性判断标准：荧光量大于阴性对照荧光量的2倍。阴性对照组为每个实验组对应设置的以加入非土拉杆菌DNA作为模板的阴性信号组。

进一步地，所述阴性信号组可以以水替代模板。

在本发明的具体实施方式中，所述阴性信号组中的非土拉杆菌DNA具体为12种非土拉杆菌细菌的核酸DNA混合物，所述12种非土拉杆菌细菌为鼠疫杆菌、炭疽芽孢杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、创伤弧菌、副溶血弧菌。

在本发明中，所述土拉杆菌具体为土拉杆菌A型或土拉杆菌B型。

在本发明的具体实施方式中，所述待测样本选自如下：土拉杆菌A型、土拉杆菌B型，12种非土拉杆菌细菌(鼠疫杆菌、炭疽芽孢杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、创伤弧菌、副溶血弧菌)。

本发明所提供的引物及crRNA涉及医用检查检验仪器及服务中的体外诊断用试剂，是针对土拉杆菌的特异性保守毒力基因tul4进行设计的，且利用CRISPR(Cluste redregularly interspaced short palindromic repeats，成簇规律间隔短回文重复序列)技术进行检测，在CRISPR Cas系统中，Cas蛋白在crRNA(CRISPR-derivedRNA)的引导下，识别目标序列后启动“附带切割”活性。在体系中加入荧光报告分子，借用Cas酶附带切割活性，实现待检序列信息向荧光信号的转化。通过RPA与Cas蛋白的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联”(Cas酶完成)的两级放大，从而超越Q-PCR这种单级扩增的灵敏度。此外，因为RPA扩增方式无需复杂的温度改变，从而摆脱了对Q-PCR仪等精密仪器的依赖，使得CRISPR-Cas技术在土拉杆菌的现场诊断方面具有广阔的应用前景。

实验证明，本发明所提供的CRISPR检测引物和crRNA以及相应的检测方法具有检测时间短、扩增效率高、灵敏度好且特异性强等特点，对土拉杆菌阳性参考质粒的检测灵敏度可达900拷贝/mL，对土拉杆菌基因组的检测灵敏度可达1260fg/mL。本发明在土拉杆菌的现场诊断方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为RPA引物对的筛选。N为阴性对照组。

图2为LbCas12a蛋白纯化后的SDS-PAGE图。

图3为crRNA的筛选。

图4为土拉杆菌CRISPR检测体系质粒拷贝灵敏度评价。

图5为土拉杆菌CRISPR检测体系基因组灵敏度评价。

图6为土拉杆菌CRISPR检测体系特异性评价。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所涉及的材料及仪器如下：

土拉杆菌A型和土拉杆菌B型，12种非土拉杆菌细菌(鼠疫杆菌、炭疽芽孢杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、创伤弧菌、副溶血弧菌)均由军事医学研究院微生物流行病研究所细菌学研究室提供。RPA引物、crRNA与信号报告探针由上海生工生物有限公司合成，LbCas12a蛋白表达质粒由上海吐露港生物科技有限公司免费无偿提供，LbCas12a重组表达蛋白由军事医学研究院微生物流行病研究所细菌学研究室纯化。土拉弗朗西斯菌tul4检测阳性参考质粒(pEASY-T1-Tul)由军事医学研究院微生物流行病研究所细菌学研究室构建，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

金属浴，离心机，涡旋仪，Genie III等温扩增荧光检测系统(英国OptiGene公司)等。

实施例1、用于土拉杆菌的CRISPR-Cas12a检测引物的设计及筛选

一、序列的设计

1、靶标序列选定

发明人在前期研究基础上，经过多番筛选和比对，选定土拉弗朗西斯菌的主要膜蛋白前体(tul4)基因的保守序列为靶标序列(如SEQ ID No.1所示)，该序列作为土拉弗朗西斯菌的特异性保守序列，可将土拉杆菌特异性检出。

2、扩增引物对和crRNA的设计

针对上述土拉弗朗西斯菌的tul4基因的特异性保守序列(如SEQ ID No.1所示)，采用软件设计得到很多理论可行的RPA扩增引物对和crRNA，但是经科学实验验证有相当一部分效果不佳，部分效果尚可的序列如表1所示。

表1本发明候选RPA扩增引物对和crRNA

序列名称	序列(5’-3’)	编号
			Rpa-Tul-F1	GTCATCTTGATCTTATCTTAGCGACTAATCCT	SEQ ID No.2
Rpa-Tul-R1	TATATGTCTTACAAGCAGTATCACTCGCCATA	SEQ ID No.3
			Rpa-Tul-F2	CAGCTACTACTGAGCAAGCTGCTGCTGTATCT	SEQ ID No.4
Rpa-Tul-R2	CACTTAGAACCTTCTGGAGCCTGCCATTGTAATC	SEQ ID No.5
			crRNA-Tul-1-1	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>CCUCCACUUGAGAUAAUUAAUCAA</u>	SEQ ID No.6
crRNA-Tul-1-2	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>UGGCGAGUGAUACUGCUUGUAAGA</u>	SEQ ID No.7
			crRNA-Tul-2	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AAUAAACUUGGUCAGGAUAAAAUA</u>	SEQ ID No.8

注：crRNA中下划线部分为向导序列(与RPA引物对的扩增产物序列相匹配)，之前的部分为锚定序列(用于结合cas蛋白)。

二、细菌基因组DNA和土拉杆菌Tul阳性参考质粒的制备

供试细菌：土拉杆菌A型和土拉杆菌B型，12种非土拉杆菌细菌(鼠疫杆菌、炭疽芽孢杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、创伤弧菌、副溶血弧菌)

将供试细菌1mL菌液进行热灭活处理，平板培养显示无活菌后采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，货号DP320)提取菌液基因组DNA，用100μL TE缓冲液洗脱，采用Qubit荧光法进行基因组核酸定量。

土拉杆菌基因组进行适当的倍比稀释后用于CRISPR检测体系基因组灵敏度的分析，12种非土拉杆菌细菌基因组及非土拉杆菌基因组混合液用于土拉杆菌CRISPR检测体系特异性的评价。

阳性参考质粒pEASY-T1-Tul的制备：利用Primer Premier 6软件对土拉弗朗西斯菌tul4基因设计PCR引物，使其扩增片段涵盖表1中RPA引物扩增所得的RPA扩增片段。以提取的基因组DNA为模板，利用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)对目的片段进行PCR扩增，利用A-overhang mixture(TaKaRa)对纯化产物3’端添加“A”碱基，随后加入pEASY-T1 Simple Cloning Vector(transgen)完成T-A克隆，采用PCR检测出阳性克隆并对其进行测序进一步确认。使用TIANprep Mini Plasmid Kit(TianGen)提取阳性参考质粒(pEASY-T1-Tul)，利用Qubit3.0核酸定量仪测定提取重组质粒的浓度，并换算出拷贝数浓度(拷贝数/μL)，对已知拷贝数浓度的质粒进行适当的倍比稀释后用于CRISPR检测体系灵敏度的分析。

三、土拉杆菌RPA扩增引物的筛选

将土拉杆菌Tul阳性参考质粒(pEASY-T1-Tul，将SEQ ID No.1的第283-1219位所示DNA片段克隆到pEASY-T1载体后得到的重组质粒。)原液按10倍梯度稀释至10拷贝/μL，以各梯度稀释液为模板按照RPA法扩增分别取1μL质粒稀释模板进行RPA扩增，同时以1μL H₂O为模板作为阴性对照，按奇天基因RAA试剂盒(货号：B00100)方法进行RPA的扩增反应：将所合成RPA引物100μmol/L母液稀释成10μmol/L工作液，按如下体系配成50μL反应体系：其中先配成如下46.5μL预混液并混合均匀：缓冲液25μL，正反向引物(10μmol/L)各2μL，ddH₂O17.5μL。向RAA试剂盒(奇天基因)中的每管基础反应单元(包含能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs等)中加入上述46.5μL预混液并溶解均匀，加入1μL模板DNA。吸取2.5μLMgAc于PCR管盖上，盖上盖子后稍离心，迅速放入Genie III等温扩增荧光检测系统进行RPA反应。反应条件：39℃，20min(1200s)，进行凝胶电泳检查扩增情况。

结果显示：表1中的RPA扩增引物对Rpa-Tul-F1/Rpa-Tul-R1和Rpa-Tul-F2/Rpa-Tul-R2能分别扩增出156bp和163bp的条带，扩增效率能达到100拷贝/μL(图1)，两对引物的扩增产物均可用于CRISPR检测反应。

四、土拉杆菌CRISPR检测体系的建立

LbCas12a蛋白的表达与纯化：将由上海吐露港生物科技有限公司提供的Cas12a表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将阳性克隆培养至OD600＝0.8，然后加入0.2mM的IPTG于16℃下诱导16h。对诱导后的菌体通过超声破碎并离心获取上清。通过Ni柱(GEHealthcare)纯化出上清里的重组表达蛋白LbCas12a(图2，纯化后的SDS-PAGE图)，PBS透析后，稀释至终浓度1mg/ml，分装后冻存于-80℃。

LbCas12a蛋白在上海吐露港生物科技有限公司也有销售，货号为32108。

上述RPA扩增产物(1μL)，LbCas12a蛋白1μL(74nM)，crRNA 1μL(1μM)，信号报告探针1μL(浓度0.5-1μM)，RNAinhibitor(10U)。

其中，信号报告分子为：5’-FAM-TTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’(SEQ ID No.9)。

在CRISPR Cas系统中，Cas12a蛋白在crRNA的引导下，识别目标序列后启动“附带切割”活性，切割体系中的信号报告分子，使荧光报告基团FAM解离出来，其发射的荧光不再被近距离的荧光淬灭基团(BHQ1)吸收，从而使FAM基团发出荧光，最终实现待检序列信息向荧光信号的转化。

反应条件和时间：37℃反应0-30min，每1min读取FAM荧光值。

结果分析：使用荧光检测仪得到的累积荧光值作为信号强度，按照以下标准进行分析判定：

阴性判断标准：荧光量小于或等于阴性对照荧光量的2倍。

阳性判断标准：荧光量大于阴性对照荧光量的2倍。

阴性对照组为每个实验组对应设置的以加入12种非土拉杆菌细菌(鼠疫杆菌、炭疽芽孢杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、创伤弧菌、副溶血弧菌)的核酸DNA混合物作为模板的阴性信号组。

五、CRISPR检测反应crRNA的筛选

针对Rpa-Tul-F1/Rpa-Tul-R1引物对扩增产物1以及Rpa-Tul-F2/Rpa-Tul-R2引物对扩增产物2设计crRNA，在含有TTTN的PAM序列下游设计crRNA前导序列，在前导序列上游加入锚定序列，针对扩增产物1设计出两条crRNA：crRNA-Tul-1-1和crRNA-Tul-1-2(见表1)；针对扩增产物2设计出1条crRNA：crRNA-Tul-2(见表1)。将上述RPA扩增产物与crRNA组合，用步骤四中的CRISPR反应体系检测，荧光信号如图3，可见crRNA-Tul-1-1和crRNA-Tul-1-2对RPA扩增产物1均有较好的检测反应；crRNA-Tul-2对RPA扩增产物2也有强烈的检测反应。

六、土拉杆菌CRISPR检测体系灵敏度的测定

1、质粒灵敏度分析

将土拉杆菌Tul阳性参考质粒(pEASY-T1-Tul)原液按10倍梯度稀释，以梯度稀释液(9×10⁴～9×10^-2拷贝/μL)为模板按照前文建立的方法进行灵敏度的评价，如图4所示，以Rpa-Tul-F2/Rpa-Tul-R2引物对进行RPA扩增，以扩增产物为靶DNA，crRNA-Tul-2与Cas12a组合的CRISPR检测灵敏度最高，灵敏度可达到900拷贝/mL。

2、基因组灵敏度分析

将土拉杆菌(B型)提取基因组按10倍梯度稀释，以梯度稀释液(126000～0.126fg/μL)为模板按照前文建立的方法进行灵敏度的评价，如图5所示，以Rpa-Tul-F2/Rpa-Tul-R2引物对1μL基因组梯度稀释液进行RPA扩增，以扩增产物为靶DNA，crRNA-Tul-2与Cas12a组合的CRISPR检测灵敏度最高，灵敏度可达到1260fg/mL。

七、土拉杆菌CRISPR检测反应特异性鉴定

以Rpa-Tul-F2/Rpa-Tul-R2引物对各供试细菌基因组进行RPA扩增，crRNA-Tul-2和Cas12a组合反应对土拉杆菌的CRISPR检测反应进行特异性分析(具体方法参见前文)。结果如图6。从特异性实验结果可知，本发明建立的土拉杆菌CRISPR检测体系特异性良好，仅能检出土拉杆菌(包括其A型和B型)，与鼠疫杆菌、炭疽芽孢杆菌、鼻疽/类鼻疽伯克霍尔德菌、布鲁氏菌等细菌战剂无交叉反应，与创伤弧菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌等致病菌，与枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌等工程菌也无交叉反应，与上述非土拉杆菌的12种细菌混合基因组均无交叉反应。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 用于土拉杆菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用

<130> GNCLN201220

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1233

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gaattcatag tcgcctcaaa atatgtttag atatgttgtt aataagttat aatcttatat 60

atagttaact atgttattat aatcaaggtt tttttgctat gatgacttta caagaagaaa 120

aaatacaagc gccagtattt tttaaagaat atgtcaaagg taggtttata cttaatatag 180

gtgagtataa tcatccattg attttatcag caactcaagt gcttgagtat caagataaaa 240

ttgatgatat ccaaagtatc aaaaaaagtc atcttgatct tatcttagcg actaatcctg 300

aaataatact cataggtacc ggtgaaaaac aacttttgcc tccacttgag ataattaatc 360

aaatcgcaaa agctggtaaa agtgttgatt ttatggcgag tgatactgct tgtaagacat 420

ataatttgct tgttaatgaa aatcgtaatg ttagctgtat catcatttaa taaactgctg 480

tttattttat tttaattaat gttataatcg atttgagtat atgtgaatat ttaaaaatag 540

gagtatctat atgaaaaaaa taattaagct tagtctttta tctttatcaa tcgcaggttt 600

agcgagctgt tctactctag ggttaggtgg ctctgatgat gcaaaagctt cagctaaaga 660

tactgctgct gctcagacag ctactactga gcaagctgct gctgtatcta agccaactgc 720

aaaagtaagt ttaaataaac ttggtcagga taaaataaaa gcaactgtat atacagcata 780

caataataac ccacaaggaa gtgtaagatt acaatggcag gctccagaag gttctaagtg 840

ccatgataca agcttcccaa ttactaagta tgctgagaag aacgataaaa cttgggcaac 900

tgtaacagtt aagcaaggta ataacttctg tagcggtaag tggacagcta atgtagttta 960

tgacaaagaa gtaatcgctt ctgattcaat aaatatttaa tttcttcaaa tatttataat 1020

tttctagttt ttgcttttct caaaaaaaaa taacggtgtg attaattttg cttagctaga 1080

ttagttgtac ttttaacttt ttactaaaaa gatttgctat aattgcttaa atataacaaa 1140

taaaaaagta atagtttaat gaaaaacatt atcttgttat taatgatatt ctcgatgtta 1200

gttgtactta gccatgtgca ccaaccacag ctg 1233

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gtcatcttga tcttatctta gcgactaatc ct 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tatatgtctt acaagcagta tcactcgcca ta 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

cagctactac tgagcaagct gctgctgtat ct 32

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

cacttagaac cttctggagc ctgccattgt aatc 34

<210> 6

<211> 45

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

uaauuucuac uaaguguaga uccuccacuu gagauaauua aucaa 45

<210> 7

<211> 45

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

uaauuucuac uaaguguaga uuggcgagug auacugcuug uaaga 45

<210> 8

<211> 45

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

uaauuucuac uaaguguaga uaauaaacuu ggucaggaua aaaua 45

<210> 9

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

tttttttttt tt 12

Claims

1.用于检测土拉杆菌的引物组，由RPA引物对和crRNA组成；

所述RPA引物对是根据土拉杆菌基因组中SEQ ID No.1所示核苷酸序列设计的；

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述RPA引物对为能够以土拉杆菌基因组为模板扩增得到SEQ ID No.1的第678-840位所示DNA片段的引物对；和/或

所述crRNA中，所述锚定序列为SEQ ID No.8的第1-21位，所述向导序列为SEQ ID No.8的第22-45位。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于：所述RPA引物对为由SEQ ID No.4和SEQID No.5所示的两条单链DNA组成的引物对；和/或

所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

4.用于检测土拉杆菌的试剂盒，含有权利要求1-3中任一所述的引物组及crRNA。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有如下中的全部或部分：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和醋酸镁。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有cas12a蛋白和/或信号报告探针和/或阳性参考质粒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述cas12a蛋白为LbCas12a蛋白；和/或

所述信号报告探针的序列如SEQ ID No.9所示，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；和/或

所述阳性参考质粒为含有SEQ ID No.1的第283-1219位所示DNA片段的质粒。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

9.权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4-8中任一所述的试剂盒在如下任一中的应用：

(A1)制备用于检测土拉杆菌的产品，或检测土拉杆菌；

(A2)制备用于诊断土拉杆菌感染的产品；

(A3)制备用于诊断土拉热的产品。

10.一种检测土拉杆菌的方法，包括如下步骤：

(b1)从待测样本中提取DNA；

(b2)以(b1)提取的DNA为模板，采用权利要求1-3任一中所述的RPA引物对进行RPA扩增，得到扩增产物；

(b3)取(b2)所得扩增产物，加入权利要求6-8任一中所述的信号报告探针、权利要求6-8任一中所述的cas12a蛋白和权利要求1-3任一中所述的crRNA，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，根据检测信号确定检测结果。