CN115927677A - 基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌的检测方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌的检测方法与应用。具体地公开了用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异序列标签，所述特异序列标签为LC1和/或LC2，所述LC1是核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA，所述LC2是核苷酸序列为SEQ ID No.2的DNA。本发明利用生物信息学分析方法鉴定、筛选获得类鼻疽菌特异序列标签LC1和LC2，并以此为基础结合RPA‑CRISPR/Cas12a检测方法构建了两种基于特异序列标签的类鼻疽菌检测方法。本发明用于检测类鼻疽菌的引物对、组合物及检测方法具有快速便捷、特异性好，灵敏度高的特点，可快速准确的对类鼻疽菌和类鼻疽病进行鉴定与诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌的检测方法与应用。
背景技术
类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)简称为类鼻疽菌，由于具有侵入和在细胞内存活的能力而对人类致病，主要引起类鼻疽(Melioidosis)，曾在东南亚和澳大利亚北部地区流行，可通过皮肤接触、吸入或食入等途径发生感染。类鼻疽患者病死率高，临床表现为多发性脓肿、难治性肺炎及致死性败血症，严重的败血症性类鼻疽在24～48小时内就可导致患者死亡，世界范围内类鼻疽病例逐年的增加使之成为一项严重的公共卫生问题。
针对类鼻疽菌开发出特异、快速、灵敏的检测方法对类鼻疽防治，挽救患者生命具有积极作用。针对环境中类鼻疽菌检测的“金标准”是基于土壤和水体的微生物分离培养，而在临床中对类鼻疽的检测则是血液培养分离鉴定，但这些方法耗时耗力且需要专业人员操作。目前，分子鉴定如聚合酶链式反应技术(PCR)已成为病原细菌检测的常规技术方法。然而，类鼻疽菌与同属的姊妹物种(如鼻疽伯克霍尔德菌)有很大的相似性，因此很难鉴别。也有一些关于采用染色体上的特异序列来区分这两种菌，但实验室采用的菌株数目太少，引物特异性验证有限。
随着高通量测序技术的快速发展，使得短时间内能够获得大量类鼻疽相关基因组数据。这些海量数据使得通过生物信息学分析方法获得类鼻疽菌的核心基因组特异序列标签成为可能，与新兴的RPA-CRISPR快速检测技术结合可快速准确的对类鼻疽菌和类鼻疽病进行鉴定与诊断，目前在国内外还未见报道。
鉴于目前的检测方法仍不能满足临床检测的需求，敏感性和特异性还有待进一步提高，因此开发一种快速便捷、特异性好，灵敏度高的类鼻疽菌的检测方法能够为类鼻疽病的防控提供可靠、有效的技术保障。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速、特异和/或灵敏地检测类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异序列标签，所述特异序列标签可为LC1和/或LC2，所述LC1可为核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA，所述LC2可为核苷酸序列为SEQ ID No.2的DNA。
所述特异序列标签为本发明鉴定筛选得到的含有PAM序列(TTTN)的类鼻疽菌2条染色体上的特异序列标签，分别命名为LC1和LC2，LC1和LC2是能够用来检测类鼻疽菌存在和能区分其与其他病原菌的特异性核酸序列。
类鼻疽菌两条染色体，一条大染色体，与细菌基本的营养代谢活动相关；一条小染色体，与细菌的耐药、毒力和环境适应性相关。
本发明还提供了用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有由引物LC1-F2和引物LC1-R3组成的引物对、LC1-crRNA-1和ssDNA reporter，或含有由引物LC2-F4和引物LC2-R4组成的引物对、LC2-crRNA-2和ssDNA reporter，或含有由引物LC1-F2、引物LC1-R3、引物LC2-F4和引物LC2-R4组成的引物组合物、LC1-crRNA-1、LC2-crRNA-2和ssDNA reporter；所述引物LC1-F2为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子；所述引物LC1-R3为SEQ ID No.9所示的单链DNA分子；所述引物LC2-F4为SEQ ID No.14所示的单链DNA分子；所述引物LC2-R4为SEQ ID No.18所示的单链DNA分子；所述LC1-crRNA-1为SEQ IDNo.19所示的RNA分子，所述LC2-crRNA-2为SEQ ID No.22所示的RNA分子。
SEQ ID No.19的第1-21位为用于与Cas12a蛋白结合的锚定序列，SEQ ID No.19的第22-45位为靶向类鼻疽菌靶标序列(特异序列标签LC1，SEQ ID No.1)的向导序列，用于结合RPA引物对(引物LC1-F2和引物LC1-R3)的扩增产物。
SEQ ID No.22的第1-21位为用于与Cas12a蛋白结合的锚定序列，SEQ ID No.22的第22-45位为靶向类鼻疽菌靶标序列(特异序列标签LC2，SEQ ID No.2)的向导序列，用于结合RPA引物对(引物LC2-F4和引物LC2-R4)的扩增产物。
进一步地，所述ssDNA reporter的核苷酸序列可如SEQ ID No.23所示。
所述ssDNA reporter为报告DNA，所述报告DNA为具有信号报告功能的DNA分子，当所述DNA分子被降解时，能够报告阳性信号并被检测到。所述阳性信号可为荧光信号。在同一检测时间内，实验组荧光强度值比阴性对照(ddH2O)荧光强度值高1倍以上即判定为阳性结果(阳性信号)。
所述报告DNA可为单链DNA(ssDNA)。
在本发明的一个实施方案中，所述ssDNA的核苷酸序列可为：
FAM-CCCCCCCCCCCC-BHQ1(SEQ ID No.23)，由上海生工生物有限公司合成。
进一步地，所述试剂或试剂盒还可包括Cas12a蛋白。
进一步地，所述Cas12a蛋白可独立存在或与本发明所述的crRNA以复合物的形式存在。
进一步地，所述Cas12a蛋白可为LbCas12a蛋白。
所述引物LC1-F2和LC2-F4为正向引物(上游引物)，所述引物LC1-R3和LC2-R4为反向引物(下游引物)。
所述正向引物LC1-F2(SEQ ID No.4)和反向引物LC1-R3(SEQ ID No.9)为特异性扩增特异序列标签LC1(SEQ ID No.1)的引物对，即用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异引物对。
所述正向引物LC2-F4(SEQ ID No.14)和反向引物LC2-R4(SEQ ID No.18)为特异性扩增特异序列标签LC2(SEQ ID No.2)的引物对，即用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异引物对。
进一步地，所述试剂或试剂盒还可包括阳性对照模板，所述阳性对照模板可为携带(含有)特异序列标签LC1和/或特异序列标签LC2的重组载体，所述特异序列标签LC1的核苷酸序列为SEQ ID No.1，所述特异序列标签LC2的核苷酸序列为SEQ ID No.2。
进一步地，所述阳性对照模板可为质粒pEASY-T1-LC1和/或pEASY-T1-LC2，其中质粒pEASY-T1-LC1含有SEQ ID No.1所示的DNA分子，质粒pEASY-T1-LC2含有SEQ ID No.2所示的DNA分子。
进一步地，所述试剂或试剂盒还可包括阴性对照模板，所述阴性对照模板可为去离子水。
所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
进一步地，所述试剂盒还可包括记载有本文中所述检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本发明方法的试剂盒说明书(例如印刷形式的说明书)或在其上已记录了信息的计算机可读的介质(例如软盘、CD等)。
本发明还提供了本文中任一所述引物对，和/或，本文中任一所述crRNA的下述任一种应用：
D1)在检测类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；
D2)在检测特异序列标签LC1和/或LC2或制备用于检测特异序列标签LC1和/或LC2的产品中的应用；
D3)在鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；
D4)在制备用于诊断或辅助诊断类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；
D5)在筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病或制备筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；
D6)在鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌或制备用于鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌的产品中的应用；
D7)在类鼻疽防控中的应用。
本发明还提供了所述特异序列标签的下述任一种应用：
E1)在检测类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；
E2)在鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；
E3)在制备用于诊断或辅助诊断类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；
E4)在筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病或制备筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；
E5)在鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌或制备用于鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌的产品中的应用；
E6)在类鼻疽防控中的应用。
本文所述产品可为试剂、试剂盒、芯片或试纸。
本文所述其他病原菌可为鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、牛布鲁氏菌(Brucella abortus)、猪布鲁氏菌(Brucellasuis)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和/或伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)。
本文所述类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病可为类鼻疽(Melioidosis)。
本发明还提供了检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法，所述方法可包括使用所述试剂或试剂盒对待测样品进行重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)反应(RPA扩增反应)和CRISPR/Cas12a检测，根据检测结果确定待测样品中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌或待测样品是否为类鼻疽伯克霍尔德菌，所述方法的目的为非疾病诊断目的。
进一步地，所述RPA扩增反应可为实时荧光RPA反应。
进一步地，上述方法中，所述RPA扩增反应的体系可包括下述任一种：
M1)引物LC1-F2、引物LC1-R3、Primer Free Rehydration buffer、去离子H2O、MgOAc溶液和DNA模板；
M2)引物LC2-F4、引物LC2-R4、Primer Free Rehydration buffer、去离子H2O、MgOAc溶液和DNA模板。
进一步地，上述方法中，所述RPA扩增反应的条件可为：39℃，扩增30min(1800s)。
进一步地，针对M1)所述RPA扩增反应的体系，CRISPR/Cas12a检测的体系可包括：LbCas12a、ssDNA、RNA酶抑制剂、buffer(NEB)、LC1-crRNA-1和去离子H2O；针对M2)所述RPA扩增反应的体系，CRISPR/Cas12a检测的体系可包括：LbCas12a、ssDNA、RNA酶抑制剂、buffer(NEB)、LC2-crRNA-2和去离子H2O。
进一步地，所述CRISPR/Cas12a检测的条件可为：37℃，10min(600s)。
在本发明的一个实施方案中，所述RPA扩增反应的体系(50μL)为：引物LC1-F2(10μmol/L)2.4μL；引物LC1-R3(10μmol/L)2.4μL；Primer Free Rehydration buffer29.5μL；去离子H2O 10.7μL；MgOAc溶液3μL；DNA模板2μL。
在本发明的一个实施方案中，所述RPA扩增反应的体系(50μL)为：引物LC2-F4(10μmol/L)2.4μL；引物LC2-R4(10μmol/L)2.4μL；Primer Free Rehydration buffer29.5μL；去离子H2O 10.7μL；MgOAc溶液3μL；DNA模板2μL。
在本发明的CRISPR实施方案中，所述CRISPR/Cas12a反应体系(40μL)为：LbCas12a(75nM)0.3μL；ssDNA(500nM)2μL；RNA酶抑制剂0.5μL；buffer(NEB)3μL；LC1-crRNA-1(500nM)10μL；去离子H2O 4.2μL；RPA产物20μL。
上述方法中，根据检测结果确定待测样品中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌(类鼻疽菌)或待测样品是否为类鼻疽伯克霍尔德菌的方法可为：
在同一检测时间内，实验组荧光强度值比阴性对照(去离子H2O)荧光强度值高1倍以上即判定为阳性结果(阳性信号)。
根据阳性信号的有无判定待测样品中是否含有类鼻疽菌或是否为类鼻疽菌，和/或，根据阳性信号的强弱判定待测样品中类鼻疽菌的浓度：
如果有阳性信号，则判定待测样品中含有或者候选含有类鼻疽菌或为类鼻疽菌；如果无阳性信号，则判定待测样品中不含有或者候选不含有类鼻疽菌或不为类鼻疽菌；
阳性信号越强，表示待测样品中含有的类鼻疽菌含量越高；阳性信号越弱，表示待测样品中含有的类鼻疽菌含量越低。
进一步地，所述待测样品可为血液样品、组织样品、环境样品(如土壤、水或空气)等。
上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
本发明中所述检测类鼻疽伯克霍尔德菌可为鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌。
本文所述任一引物对或引物组合物也在本发明的保护范围内。
本文所述LC1-crRNA-1和/或LC2-crRNA-2也在本发明的保护范围内。
本发明首先利用生物信息学分析方法鉴定、筛选获得类鼻疽菌的核心基因组特异序列标签LC1和LC2，并以此为基础设计相应的引物、探针和crRNA，结合RPA-CRISPR/Cas12a检测方法构建了两种基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌检测方法(LC1-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法和LC2-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法)，并开发了相关试剂盒。本发明用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的引物对、组合物、试剂、试剂盒及其检测方法具有快速便捷、特异性好，灵敏度高的特点，可快速准确的对类鼻疽菌和类鼻疽病进行鉴定与诊断，为类鼻疽病的防控提供可靠、有效的技术保障。
附图说明
图1为类鼻疽菌LC1、LC2 RPA扩增引物交叉筛选。其中A为LC1 RPA扩增引物交叉筛选热图，引物组合LC1-F2/LC1-R3归一化值为0.76，引物组合LC1-F2/LC1-R4归一化值为1；B为LC2 RPA扩增引物交叉筛选热图，引物组合LC2-F4/LC2-R3归一化值为0.66，引物组合LC2-F4/LC2-R4归一化值为1。
图2为类鼻疽菌CRISPR检测反应LC1、LC2 crRNA筛选。其中A为LC1-RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的建立，引物组合LC1-F2/LC1-R3与LC1-crRNA-1结合归一化值为1；B为LC2-RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的建立，引物组合LC2-F4/LC2-R4与LC2-crRNA-2结合归一化值为1。
图3为类鼻疽菌RPA-CRISPR/Cas12a检测方法灵敏度评价。A为LC1-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法灵敏度评价，左图为质粒拷贝数灵敏度，n＝4，±SEM，t检验，****(p值＜0.0001)，ns(不显著)；右图为类鼻疽菌基因组DNA灵敏度，n＝3，±SEM，t检验，200fg/反应：**(p值＝0.0028)，100fg/反应：****(p值＜0.0001)，20fg/反应：**(p值＝0.0069)，10fg/反应：*(p值＝0.0292)，ns(不显著)。B为LC2-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法灵敏度评价，左图为质粒拷贝数灵敏度，n＝4，±SEM，t检验，****(p值＜0.0001)，ns(不显著)；右图为类鼻疽菌基因组DNA灵敏度，n＝3，±SEM，t检验，200fg/反应：**(p值＝0.0078)，100fg/反应：**(p值＝0.0013)，20fg/反应：**(p值＝0.0041)，ns(不显著)。
图4为类鼻疽菌RPA-CRISPR/Cas12a检测方法特异性评价。A为LC1-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法特异性评价，n＝3，±SEM，t检验，****(p值＜0.0001)，ns(不显著)。Ⅰ表示类鼻疽菌基因组DNA，Ⅱ表示非类鼻疽菌混合基因组DNA。B为LC2-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法特异性评价，n＝3，±SEM，t检验，****(p值＜0.0001)，ns(不显著)。Ⅰ表示类鼻疽菌基因组DNA，Ⅱ表示非类鼻疽菌混合基因组DNA。
图5为类鼻疽菌RPA-CRISPR/Cas12a检测方法模拟临床样本实用性评价。图5中1-10分别表示1-10号样本。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的14种病原菌类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)、牛布鲁氏菌(Brucella abortus)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)均由军事医学研究院微生物流行病研究所提供。
上述14种病原菌的基因组DNA制备方法如下：将上述1mL热灭活供试细菌菌液采用QIAamp DNA Mini Kit基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)提取菌液全基因组DNA，用100μL AE缓冲液洗脱，采用Qubit 4.0核酸浓度测量仪进行基因组核酸定量。分别得到类鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA(类鼻疽基因组DNA)、鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA、羊布鲁氏菌基因组DNA、牛布鲁氏菌基因组DNA、猪布鲁氏菌基因组DNA、犬布鲁氏菌基因组DNA、土拉弗朗西斯菌基因组DNA、炭疽芽孢杆菌基因组DNA、鼠疫耶尔森菌基因组DNA、霍乱弧菌基因组DNA、金黄色葡萄球菌基因组DNA、创伤弧菌基因组DNA、副溶血弧菌基因组DNA和伤寒沙门氏菌基因组DNA。
TIANprep Mini Plasmid Kit为中国天根生化有限公司产品；荧光RPA扩增试剂盒(TwistAmp exo Kit)为英国TwistDx公司产品，货号TAEXO02KIT；荧光RPA扩增试剂盒(TwistAmp Basic Kit)为英国TwistDx公司产品，货号：TAEXO03KIT；核酸快速扩增检测系统(Genie II)为OptiGene公司产品；Qubit4.0核酸浓度测量仪为美国Thermo FisherScientific公司产品。
下述实施例中的阳性参考质粒、引物、探针及crRNA由上海生工生物工程股份有限公司合成。
下述实施例中LbCas12a为上海吐露港生物科技有限公司产品(货号32108)。
实施例1、类鼻疽菌的特异序列标签的鉴定
本实施例用于生物信息学分析的类鼻疽基因组序列：共计1723条类鼻疽基因组序列用于本研究，包括13条新测序的全基因组序列和1710条公共基因组序列。类鼻疽公共基因组序列从NCBI(Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#！/pro karyotes/476/)下载。
利用Illumina MiSeq(Illumina，San Diego，CA，USA)测序仪对类鼻疽伯克霍尔德菌(简称类鼻疽菌)和鼻疽伯克霍尔德菌(简称鼻疽菌)进行全基因组的从头测序，使用FASTX-Toolkit软件对测序获得的原始短读序列进行质量过滤，然后使用SPAdes3.0软件进行组装。使用Prokka软件对1723株类鼻疽菌和92株鼻疽菌的基因组进行注释生成GFF3文件，用Roary软件鉴定出类鼻疽的泛基因组序列，然后使用Python编程从泛基因组中筛选出所有存在于类鼻疽菌，但不存在于鼻疽菌的核心基因组序列。最后通过本地NCBI核酸数据库对核心基因组进行筛选，然后使用在线NCBI核酸数据库对上述基因组进行进一步验证，获得与所有类鼻疽菌基因组序列100％匹配，而与其他细菌不匹配的特异序列标签。
实施例2、类鼻疽菌靶标筛选
对实施例1鉴定到的类鼻疽菌特异序列标签进行分析，选定含有PAM序列(TTTN)的类鼻疽菌2条染色体上的特异序列标签LC1和LC2为靶标序列进行后续RPA-CRISPR/Cas12a的设计。
筛选获得的特异序列标签LC1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，特异序列标签LC2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例3、RPA扩增引物和crRNA的设计
针对实施例2获得的特异序列标签LC1(SEQ ID No.1)，设计多条RPA扩增引物，LC1-F1、LC1-F2、LC1-F3、LC1-F4、LC1-R1、LC1-R2、LC1-R3和LC1-R4，以及对应特异性识别LC1的RPA荧光探针LC1-P。针对实施例2获得的特异序列标签LC2(SEQ ID No.2)，设计多条RPA扩增引物，LC2-F1、LC2-F2、LC2-F3、LC2-F4、LC2-R1、LC2-R2、LC2-R3和LC2-R4，以及对应特异性识别LC2的RPA荧光探针LC2-P。当完成理想RPA引物筛选之后，以其扩增序列为靶标，寻找TTTN(PAM序列)，设计对应的crRNA：LC1-crRNA-1和LC1-crRNA-2(针对特异序列标签LC1)LC2-crRNA-1和LC2-crRNA-2(针对特异序列标签LC2)。以上所有的RPA引物、荧光探针和crRNA的序列如下表所示：
表1、候选RPA扩增引物对和crRNA
注：探针LC1-P和LC-P2中下划线部分为标记基团位点(LC1-P中TCGT修饰标记为FAM-dT—THF—G—BHQ1-dT，即LC1-P的第31位碱基T标记FAM，第32位碱基C用四氢呋喃(THF)取代，第34位碱基T碱基标记淬灭基团BHQ1及3’端标记C3-spacer；LC2-P中TACT修饰标记为FAM-dT—THF—C—BHQ1-dT，即LC2-P的第31位碱基T标记FAM，第32位碱基C用四氢呋喃(THF)取代，第34位碱基T碱基标记淬灭基团BHQ1及3’端标记C3-spacer；crRNA(SEQ IDNO.19～SEQ ID NO.22)中下划线部分为向导序列(与RPA引物对的扩增产物序列相匹配)，下划线之前的碱基部分为锚定序列(用于结合Cas12a蛋白)。SEQ ID NO.23所示的ssDNAreporter序列的5’末端碱基标记FAM，3’末端标记淬灭基团BHQ1。
实施例4、RPA扩增引物和crRNA的筛选
1、类鼻疽菌检测靶标基因阳性参考质粒的制备
针对特异序列标签LC1(SEQ ID No.1)和特异序列标签LC2(SEQ ID No.2)分别构建类鼻疽菌检测靶标基因阳性参考质粒pEASY-T1-LC1和pEASY-T1-LC2(质粒标准品)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，合成质粒产品通过安全与质量检测。其中质粒pEASY-T1-LC1含有SEQ ID No.1所示的DNA分子，质粒pEASY-T1-LC2含有SEQ ID No.2所示的DNA分子，pEASY-T1-LC1为
Cloning Vector(简称pEASY-T1，购自北京全式金生物技术有限公司)与LC1(SEQ ID No.1)通过TA克隆获得的重组载体；pEASY-T1-LC2为
Cloning Vector与LC2(SEQ ID No.1)通过TA克隆获得的重组载体。
2、数据分析与统计分析方法
从Genie II仪器中采集反应10分钟荧光信号，按照以下方法进行数据处理和制图：(1)将所得的每组实验数据经过归一化处理后做成直观热图，通过比较在相同模板DNA浓度条件下荧光信号高低，图中颜色深浅对应不同的归一化值，颜色越深表示归一化值越接近1.00，说明该组荧光信号越强，则效果越好，归一化：(每组反应荧光信号-组中荧光信号最小值)/(组中荧光信号最大值)；(2)将所得的每组数据中，无模板对照(NTC)组的荧光信号值平均值作为分母，每组反应荧光值作为分子，相除之后的到一个倍数变化值，根据分组归纳做成对应的倍数变化图。
3、类鼻疽菌RPA扩增引物的筛选
将所合成引物探针100μmol/L母液稀释成10μmol/L工作液备用，稀释类鼻疽基因组DNA至10aM，分别取2μL各10aM基因组DNA为模板DNA，同时取2μL去离子H2O作为NTC，按照TwistAmp exo Kit(货号：TAEXO02KIT)Quick Guide方法进行实时荧光RPA反应。配成如下45μL预混液并混合均匀：Primer Free Rehydration buffer 29.5μL，Primer A(上游引物)和Primer B(下游引物)(10μmol/L)各2.1μL，TwistAmp exo Probe(探针，10μmol/L)0.6μL，去离子H2O 10.7μL。向每管基础反应单元中加入上述45μL预混液并溶解均匀，加入2μL模板DNA(10aM)。吸取3μL醋酸镁(MgOAc)溶液(16.8mM)于管盖上，盖上盖子后稍离心。总反应体系体积50μL，迅速放入Genie II核酸快速扩增检测系统进行RPA反应，反应条件：39℃，20min(1200s)，记录10min反应荧光值。按照上述反应条件，使用RPA荧光探针LC1-P和LC2-P对设计的RPA引物LC1-F1、LC1-F2、LC1-F3、LC1-F4、LC1-R1、LC1-R2、LC1-R3和LC1-R4(SEQID No.3-SEQ ID No.10)和LC2-F1、LC2-F2、LC2-F3、LC2-F4、LC2-R1、LC2-R2、LC2-R3和LC2-R4(SEQ ID No.11-SEQ ID No.18)进行交叉筛选。LC1 RPA引物筛选结果如图1中A所示，引物组合LC1-F2(SEQ ID No.4)/LC1-R3(SEQ ID No.9)和引物组合LC1-F2(SEQ ID No.4)/LC1-R4(SEQ ID No.10)具有较高的归一化值，作为LC1候选RPA扩增引物。LC2 RPA引物筛选结果如图1中B所示，引物组合LC2-F4(SEQ ID No.14)/LC2-R3(SEQ ID No.17)和引物组合LC2-F4(SEQ ID No.14)/LC2-R4(SEQ ID No.18)具有较高的归一化值，作为LC2候选RPA扩增引物。
4、CRISPR检测反应crRNA的筛选
以步骤3中筛选出的LC1和LC2候选RPA扩增引物组合引导的扩增序列中设计crRNA，方法为在含有TTTN的protospacer adjacent motif(PAM)序列3’端设计crRNA间隔序列，然后于间隔序列5’端加入一段相同的重复序列，于LC1 RPA扩增序列中设计出LC1-crRNA-1(SEQ ID No.19)和LC1-crRNA-2(SEQ ID No.20)，于LC2 RPA扩增序列中设计出LC2-crRNA-1(SEQ ID No.21)和LC2-crRNA-2(SEQ ID No.22)。将类鼻疽菌靶标基因阳性参考质粒(pEASY-T1-LC1和pEASY-T1-LC2)原液按10倍梯度稀释至1～1000拷贝数/反应备用，分别取2μL各梯度系数的质粒作为模板DNA，同时以2μL去离子H2O作为无模板对照(NTC)，按照TwistAmp Basic Kit(货号：TAEXO03KIT)Quick Guide方法进行基础扩增：反应体系(50μL)为：Primer A(上游引物，10μmol/L)2.4μL；Primer B(下游引物，10μmol/L)2.4μL；PrimerFree Rehydration buffer 29.5μL；去离子H2O 10.7μL；MgOAc溶液3μL；DNA模板2μL；反应条件为：39℃，扩增30min(1800s)得到RPA扩增产物。然后立即将20μL RPA扩增产物置入20μL CRISPR检测体系预混液中：LbCas12a(75nM)0.3μL；ssDNA(500nM)2μL；RNA酶抑制剂0.5μL；buffer(NEB)3μL；crRNA(500nM)10μL；去离子H2O 4.2μL，总反应体积40μL，迅速放入Genie II核酸快速扩增检测系统进行CRISPR检测反应，反应条件：37℃，10min(600s)，记录反应荧光值。设置pEASY-T1-LC1浓度20拷贝数/反应作为模板DNA，分别筛选引物组合LC1-F2/LC1-R3、引物组合LC1-F2/LC1-R4与LC1-crRNA-1、LC1-crRNA-2，结果如图2中A所示，引物组合LC1-F2/LC1-R3与LC1-crRNA-1结合有最大的归一化值，故以引物组合LC1-F2/LC1-R3与LC1-crRNA-1(SEQ ID No.19)建立类鼻疽菌LC1-RPA-CRISPR/Cas12a检测体系。设置pEASY-T1-LC2浓度20拷贝数/反应作为模板DNA，分别筛选引物组合LC2-F4/LC2-R3、引物组合LC2-F4/LC2-R4与LC2-crRNA-1、LC2-crRNA-2，结果如图2中B所示，引物组合LC2-F4/LC2-R4与LC2-crRNA-2结合有最大的归一化值，故以引物组合LC2-F4/LC2-R4与LC2-crRNA-2(SEQ ID No.22)建立类鼻疽菌LC2-RPA-CRISPR/Cas12a检测体系。
LC1-crRNA-1的核苷酸序列为SEQ ID No.19，其中SEQ ID No.19的第1-21位为用于与Cas12a蛋白结合的锚定序列，SEQ ID No.19的第22-45位为靶向类鼻疽菌靶标序列(特异序列标签LC1，SEQ ID No.1)的向导序列，用于结合RPA引物对(引物LC1-F2和引物LC1-R3)的扩增产物。
LC2-crRNA-2的核苷酸序列为SEQ ID No.22，其中SEQ ID No.22的第1-21位为用于与Cas12a蛋白结合的锚定序列，SEQ ID No.22的第22-45位为靶向类鼻疽菌靶标序列(特异序列标签LC2，SEQ ID No.2)的向导序列，用于结合RPA引物对(引物LC2-F4和引物LC2-R4)的扩增产物。
实施例5、基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌检测方法
本发明鉴定、筛选的类鼻疽菌特异序列标签(LC1和LC2)是能够用来检测类鼻疽菌存在和能区分其与其他病原菌的特异性核酸序列。基于特异序列标签LC1和LC2，并结合RPA-CRISPR/Cas12a检测系统构建了两种类鼻疽菌RPA-CRISPR/Cas12a检测方法：LC1-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法和LC2-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法。
检测原理为：利用RPA扩增技术将包含PAM位点的类鼻疽菌特异序列标签进行核酸扩增，当类鼻疽菌核酸与Cas12a蛋白、crRNA形成三元复合体时，该复合物中Cas12a蛋白的RuvC结构域行使DNase活性，可对RPA扩增产物进行精准酶切反应，切割带荧光信号标记的报告DNA，即单链DNA(ssDNA reporter)，因此，可通过有无可被crRNA特异性识别的PAM位点判读结果：通过检测荧光，利用荧光报告基团的显色情况进行结果判定，即可得知待测样品中是否含有类鼻疽菌。
5-1、LC1-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法
(1)提取待测样品基因组DNA
利用基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA，提取方法根据试剂盒说明书。
(2)RPA-CRISPR/Cas12a检测
以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，采用引物LC1-F2(SEQ ID No.4)、引物LC1-R3(SEQ ID No.9)和LC1-crRNA-1(SEQ ID No.19)对待测样品进行RPA-CRISPR/Cas12a检测：先以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，利用引物LC1-F2和引物LC1-R3进行RPA扩增，得到RPA扩增产物，再将RPA扩增产物(20μL)置于CRISPR/Cas12a检测体系(20μL)中进行检测。其中：
RPA扩增反应体系(50μL)为：引物LC1-F2(10μmol/L)2.4μL；引物LC1-R3(10μmol/L)2.4μL；Primer Free Rehydration buffer 29.5μL；去离子H2O 10.7μL；MgOAc溶液3μL；DNA模板2μL。
RPA扩增反应条件为：39℃，扩增30min(1800s)。
CRISPR/Cas12a检测体系(20μL)为：LbCas12a(75nM)0.3μL；ssDNA(500nM)2μL；RNA酶抑制剂0.5μL；buffer(NEB)3μL；LC1-crRNA-1(500nM)10μL；去离子H2O 4.2μL。
CRISPR/Cas12a检测条件为：37℃，10min(600s)。
(3)结果判定
在同一检测时间内，实验组荧光强度值比阴性对照(ddH2O)荧光强度值高1倍以上即判定为阳性结果(阳性信号)。
根据阳性信号的有无判定待测样品中是否含有类鼻疽菌，和/或，根据阳性信号的强弱判定待测样品中类鼻疽菌的浓度：
如果有阳性信号，则判定待测样品中含有或者候选含有类鼻疽菌；如果无阳性信号，则判定待测样品中不含有或者候选不含有类鼻疽菌；
阳性信号越强，表示待测样品中含有的类鼻疽菌含量越高；阳性信号越弱，表示待测样品中含有的类鼻疽菌含量越低。
5-2、LC2-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法
(1)提取待测样品基因组DNA
利用基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA，提取方法根据试剂盒说明书。
(2)RPA-CRISPR/Cas12a检测
以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，采用引物LC2-F4(SEQ ID No.14)、引物LC2-R4(SEQ ID No.18)和LC2-crRNA-2(SEQ ID No.22)对待测样品进行RPA-CRISPR/Cas12a检测：先以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，利用引物LC2-F4和引物LC2-R4进行RPA扩增，得到RPA扩增产物，再将RPA扩增产物(20μL)置于CRISPR/Cas12a检测体系(20μL)中进行检测。
RPA扩增反应体系除了将5-1中RPA扩增反应体系中的引物LC1-F2替换为引物LC2-F4，引物LC1-R3替换为引物LC2-R4以外，其余均同5-1中的RPA扩增反应体系。
CRISPR/Cas12a检测体系除了将5-1中CRISPR/Cas12a检测体系中的LC1-crRNA-1替换为LC2-crRNA-2以外，其余均同5-1中的CRISPR/Cas12a检测体系。
RPA扩增反应条件和CRISPR/Cas12a检测条件同5-1。
(3)结果判定
同5-1中步骤(3)。
实施例6、类鼻疽菌RPA-CRISPR/Cas12a检测方法灵敏度及特异性评价1、质粒拷贝数灵敏度评价和基因组DNA灵敏度评价
设置pEASY-T1-LC1浓度梯度(20～0.02拷贝数/反应)和类鼻疽菌基因组DNA浓度(200～2fg/反应)作为模板DNA，同时以2μL去离子H2O作为无模板对照(NTC)，按照实施例5中5-1的方法，评价类鼻疽菌LC1-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的灵敏度。结果如图3中A所示，质粒拷贝数灵敏度可达0.2拷贝数/反应，基因组DNA灵敏度为10fg/反应。设置pEASY-T1-LC2浓度梯度(200～0.02拷贝数/反应)和类鼻疽菌基因组DNA浓度(200～10fg/反应)作为模板DNA，同时以2μL去离子H2O作为无模板对照(NTC)，按照实施例5中5-2的方法，评价类鼻疽菌LC2-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的灵敏度。结果如图3中B所示，质粒拷贝数灵敏度可达2拷贝数/反应，基因组DNA灵敏度为20fg/反应。该实验中，每个反应体系的体积是50μL。
2、基因组特异性评价
设置类鼻疽菌基因组DNA浓度200fg/反应，非类鼻疽菌混合基因组DNA浓度200pg/反应，非类鼻疽菌混合基因组DNA由13种其他病原细菌基因组DNA组成，包括：鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA、羊布鲁氏菌基因组DNA、牛布鲁氏菌基因组DNA、猪布鲁氏菌基因组DNA、犬布鲁氏菌基因组DNA、土拉弗朗西斯菌基因组DNA、炭疽芽孢杆菌基因组DNA、鼠疫耶尔森菌基因组DNA、霍乱弧菌基因组DNA、金黄色葡萄球菌基因组DNA、创伤弧菌基因组DNA、副溶血弧菌基因组DNA和伤寒沙门氏菌基因组DNA。同时以2μL去离子H2O作为无模板对照(NTC)，按照实施例5中两个检测方法评价类鼻疽菌LC1-RPA-CRISPR/Cas12a和LC2-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的特异性。结果如图4所示，图4中A和图4中B分别为LC1-RPA-CRISPR/Cas12a和LC2-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的特异性评价，均表现出对类鼻疽菌的良好特异性。该实验中，每个反应体系的体积是40μL。
实施例7、类鼻疽菌RPA-CRISPR/Cas12a检测模拟临床样本评价实用性
分别在相同体积的正常人全血(100μL)中加入类鼻疽菌基因组DNA稀释液(100μL)，得到含有不同浓度类鼻疽菌基因组DNA(100、25、10fg/μL)的人全血模拟临床样本，在正常人全血(100μL)中加入相同体积(100μL)PBS为空白对照组样本(BC组)，总计10个样本对其进行随机编号；然后对上述10个人全血模拟临床样本采用QIAamp DNA Mini Kit提取基因组DNA，将其作为模板DNA。以公开发表文献中的实时荧光PCR检测方法(Supaprom,C.,D.Wang,C.Leelayuwat,et al.Development of real-time PCR assays and evaluationof their potential use for rapid detection of Burkholderia pseudomallei inclinical blood specimens[J].Journal of clinical microbiology,2007.45(9):p.2894-901.)对各临床样本模板DNA进行了实时荧光PCR检测(RT-PCR)，同时将上述各临床样本模板DNA使用本发明类鼻疽菌RPA-CRISPR/Cas12a检测方法(实施例5中5-1的LC1-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法和实施例5中5-2的LC2-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法)进行检测，记录反应10min时的荧光信号，经过归一化处理后做成直观热图，比较两种方法阳性检出率。结果如图5所示，类鼻疽菌RPA-CRISPR/Cas12a检测方法和RT-PCR方法均能检出编号2、4、8、9的阳性样本，均未检出编号5的空白对照样本，但本发明的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法能够检出编号1、3、6、7、10的低浓度阳性临床样本，而RT-PCR方法未能检出，说明在类鼻疽菌人全血模拟临床样本检验中RPA-CRISPR/Cas12a检测方法优于RT-PCR方法，说明类鼻疽菌RPA-CRISPR/Cas12a检测方法具有良好的实际实用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (9)
1.用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异序列标签，其特征在于，所述特异序列标签为LC1和/或LC2，所述LC1是核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA，所述LC2是核苷酸序列为SEQ IDNo.2的DNA。
2.用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒含有由引物LC1-F2和引物LC1-R3组成的引物对、LC1-crRNA-1和ssDNA reporter，或含有由引物LC2-F4和引物LC2-R4组成的引物对、LC2-crRNA-2和ssDNA reporter，或含有由引物LC1-F2、引物LC1-R3、引物LC2-F4和引物LC2-R4组成的引物组合物、LC1-crRNA-1、LC2-crRNA-2和ssDNA reporter；所述引物LC1-F2为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子；所述引物LC1-R3为SEQ ID No.9所示的单链DNA分子；所述引物LC2-F4为SEQ ID No.14所示的单链DNA分子；所述引物LC2-R4为SEQ ID No.18所示的单链DNA分子；所述LC1-crRNA-1为SEQ ID No.19所示的RNA分子，所述LC2-crRNA-2为SEQ ID No.22所示的RNA分子。
3.根据权利要求2所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述ssDNA reporter的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。
4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包括Cas12a蛋白。
5.权利要求2中所述的任一引物对和/或任一crRNA的下述任一种应用：
D1)在检测类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；
D2)在检测特异序列标签LC1和/或LC2或制备用于检测特异序列标签LC1和/或LC2的产品中的应用；
D3)在鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；
D4)在制备用于诊断或辅助诊断类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；
D5)在筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病或制备筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；
D6)在鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌或制备用于鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌的产品中的应用；
D7)在类鼻疽防控中的应用。
6.权利要求1所述的特异序列标签的下述任一种应用：
E1)在检测类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；
E2)在鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；
E3)在制备用于诊断或辅助诊断类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；
E4)在筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病或制备筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；
E5)在鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌或制备用于鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌的产品中的应用；
E6)在类鼻疽防控中的应用。
7.检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求2-4中任一所述的试剂或试剂盒对待测样品进行RPA扩增反应和CRISPR/Cas12a检测，根据检测结果确定待测样品中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌或待测样品是否为类鼻疽伯克霍尔德菌，所述方法的目的为非疾病诊断目的。
8.权利要求2中所述的任一引物对或引物组合物。
9.权利要求2中所述的LC1-crRNA-1和/或LC2-crRNA-2。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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