CN114085926B - Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法，属于生物医学临床分子检测技术领域，其中一种ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针；包括分子信标序列、野生型分子信标的ARMS引物序列、突变型分子信标的ARMS引物序列、通用下游引物；所述分子信标序列包括野生型分子信标和突变型分子信标本发明可以实现一管内进行快速实现SNP基因分型。

Description

ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针、试剂盒及 检测方法
技术领域
本发明涉及生物医学临床分子检测技术领域，尤其涉及一种ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
分子信标技术是1996年Tyagi和Kramer首先提出的一种基于核酸碱基配对原则和荧光共振能量原理设计的具有颈环构型的分子探针，在PCR扩增的退火阶段，分子信标与生成的靶序列结合发出荧光，在延伸阶段，脱离靶序列而不干扰扩增，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与扩增的模板量成正比。该技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测。由于生态环境的变化和抗生素的滥用，很多致病菌所引起的临床症状越来越不典型，常常需要同时检测多种细菌才能确定致病原。
人类多药耐药基因(MDR1，ABCB1)编码P-糖蛋白(P-gp)，这是一种重要的膜结合外排转运蛋白，已知可赋予抗癌药物抗性并影响许多药物和异生素的药代动力学。已经在整个ABCB1基因中鉴定了许多单核苷酸多态性(SNP)，它们可能对P-gp表达水平和功能有影响。SNP的单倍型和基因型分析在鉴定人类疾病易感性的遗传变异方面变得越来越重要。三个SNP位点，1236C>T、2677G>T和3435C>T已被反复证明可以预测P-gp功能的变化。这些多态性在人群中存在的频率也已被证明与种族有关(1236C>T代表的是某个基因的第1236碱基是SNP位点，也就是说，该碱基处可以是CC或者CT或者TT，不同的人基因型是有差异的，同理2677G>T和3435C>T)。
SNP是指在基因组水平上，特定核苷酸位置上存在两种或两种以上不同的碱基，其中任何一种等位基因在群体中的频率不小于1％。SNP已成为继限制性酶切片断长度多态，短串联重复序列多态标记后的第三代分子遗传标记。因此，SNP的检测正成为广泛关注的焦点。目前，用于SNP检测的方法大多以PCR技术为基础，并与荧光、质谱法、基因芯片或测序等方法结合。
目前用于ABCB1基因C3435T的方法主要有直接测序法、ARMSPCR法、基因芯片和液相芯片法。直接测序的法结果较为准确，但其操作流程较复杂，耗时较长，成本较高。基因芯片法及液相芯片法同样操作过程复杂，检测成本高，检测周期较长。ARMSPCR通过ARMS引物结合公用探针可以对SNP进行分型，采用了相对Ct差的方法进行判定基因型，无法通过一管进行基因型的区分。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法，以解决因采用了相对Ct差的方法进行判定基因型导致的检测速度慢、试剂盒检测准确度低及成本高的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明提供一种ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针，包括分子信标序列、野生型分子信标的ARMS引物序列、突变型分子信标的ARMS引物序列和通用下游引物；所述分子信标序列包括野生型分子信标和突变型分子信标；野生型分子信标的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；突变型分子信标的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
所述野生型分子信标的ARMS引物序列组包括w1、w2、w3、w4和w5中的至少一个；其中，w1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；w2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；w3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；w4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；w5的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；
所述突变型分子信标的ARMS引物序列中包括m1、m2、m3、m4和m5中的至少一个；其中，m1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示；m2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示；m3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示；m4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示；m5的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示；
所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示。
进一步的，所述包括上述的ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针、PCR检测反应液、酶混合液、阳性对照品及阴性对照品。
进一步的，所述PCR检测反应液包括pH值为8.5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为20mmol/L的硫酸镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的甘油溶液。
进一步的，所述酶混合液包括1U/μL～5U/μL的耐热DNA聚合酶。
进一步的，在qPCR反应体系中引物浓度为0.2～1.0uM。
进一步的，所述阳性对照品为质粒，野生基因型ABCB1-Wt及突变型ABCB1-Mut均为1000copys/ul；阴性对照品为灭菌水。
一种ABCB1基因C3435T基因分型的检测方法，包括如下步骤：
1)将待测样品和上述试剂盒内的SNP位点多态性的引物和探针、PCR检测反应液、酶混合液、阳性对照品及阴性对照品取出放置至室温，并摇匀后备用；
2)根据步骤1)待测样本、阴性对照品、阳性对照品的数量，向每检测孔内加入PCR预混液18μL，再将待测样本、阴性对照品、阳性对照品分别加入至不同的检测孔内，充分混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备用；
3)根据步骤2)中待测样本的性质，使用相应的DNA提取试剂盒进行样本DNA提取，进行DNA浓度测定并稀释至10ng/μL，备用；
4)根据待测样本、阴性对照品、阳性对照品的数量向相应数量的反应管中加入18μL的PCR-mix，并取步骤3)制备的样本DNA、阴性对照品、阳性对照品各取2μL加入到对应的PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
5)将步骤4)得到的待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试，荧光定量PCR反应条件：
6)得到Ct值，并根据相应的检测孔中FAM及VIC的Ct值，其中FAM代表突变信号，VIC代表野生信号，若FAM有信号VIC无信号则为纯合突变；VIC有信号FAM无信号则为纯合野生；FAM及VIC都有信号则为杂合突变。
进一步的，所述PCR反应条件是指依次预变性、变性、退火、延伸；所述预变性的条件是在95℃、5min，变性95℃、20s，退火60℃、35s，延伸是在72℃、20s。
本发明还公开了：上述引物和探针、上述的试剂盒或上述的检测方法在药耐药基因筛选或评估中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
(1)本发明采用ARSM引物结合分子信标的方法实现一管内进行SNP分型，本发明采用的ARMS引物分为2部分，标签尾巴序列及ARMS引物，当分子信标不能与标签序列杂交时保持完整结构，无荧光信号，只有当分子信标则与标签序列进行杂交后才能显示对应的标签信号。同时标签序列及分子信标具体通用性，只需结合不同的ARMS引物实现SNP分型，大大降低了引物探针的设计难度。而ARMS区分的原理是主要靠引物区分，而信号的产生是有探针决定，其探针是没有选择性的，所以一管里面不能区分；对于基因型的区分则需要2管的Ct差来判断；本专利的分子信标探针是与SNP位点匹配以后的扩增产物进行杂交，从而获得对应的基因型，可以在一管内准确，快速实现基因分型。
(2)本发明所提供检测试剂盒的检测结果与测序法的吻合率高达100％。本发明设计的特异引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型号的基因型，本发明结合ARMS引物和分子信标探针技术对人ABCB1基因C3435T进行SNP分型鉴定。同时可以将该技术应用其他领域，例如病毒鉴定或者肿瘤突变检测。
(3)本发明不仅克服了传统试剂盒敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷，同时对现有的检测试剂盒技术进行改进，使得所制备的试剂盒能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，检测结果更加准确可靠。
附图说明
图1为本发明的实施例4中1号管的荧光信号检测结果图；
图2为本发明的实施例4中2号管的荧光信号检测结果图；
图3为本发明的实施例4中3号管的荧光信号检测结果图；
图4为本发明的引物和探针检测原理图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的工业原料(试剂、原料视情况选择)如无特别说明，均为市售常规工业原料；所涉及的加工制作方法(检测、测试、制备方法等视情况而选择)，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：一种ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针，包括分子信标序列、野生型分子信标的ARMS引物序列、突变型分子信标的ARMS引物序列、通用下游引物；所述分子信标序列包括野生型分子信标和突变型分子信标；野生型分子信标的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；突变型分子信标的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
所述野生型分子信标的ARMS引物序列包括w1、w2、w3、w4和w5中；w1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；w2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；w3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；w4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；w5的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；
所述突变型分子信标的ARMS引物序列中包括m1、m2、m3、m4和m5；m1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示；m2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示；m3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示；m4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示；m5的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示；
所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示。
表1为ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针核苷酸序列表
实施例2：与实施例1的不同点在于：
所述野生型分子信标的ARMS引物序列包括w1、w2、w3、w4和w5中的一个；所述突变型分子信标的ARMS引物序列中包括m1、m2、m3、m4和m5中的一个；所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示。
实施例3：与实施例1的不同点在于：
所述野生型分子信标的ARMS引物序列包括w1、w2、w3、w4和w5中的任两个；所述突变型分子信标的ARMS引物序列中包括m1、m2、m3、m4和m5中的一个；所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示。
实施例4：与实施例1的不同点在于：
所述野生型分子信标的ARMS引物序列包括w1、w2、w3、w4和w5中的任三个；所述突变型分子信标的ARMS引物序列中包括m1、m2、m3、m4和m5中的一个；所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示。
实施例5：与实施例1的不同点在于：
一种用于检测人ABCB1基因的SNP位点C3435T多态性的试剂盒，包括上述的ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针、PCR检测反应液、酶混合液、阳性对照品及阴性对照品。
本实施例中，所述PCR检测反应液包括pH值为8.5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为20mmol/L的硫酸镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的甘油溶液。
本实施例中，所述酶混合液包括3U/μL的耐热DNA聚合酶。
本实施例中，在qPCR反应体系中引物浓度为10uM。
本实施例中，所述阳性对照品为质粒，野生基因型ABCB1-Wt及突变型ABCB1-Mut均为1000copys/ul；阴性对照品为灭菌水。
实施例6：一种ABCB1基因C3435T基因分型的检测方法，包括如下步骤：
1)将待测样品和实施例2试剂盒内的SNP位点多态性的引物和探针、PCR检测反应液、酶混合液、阳性对照品及阴性对照品取出放置至室温，并摇匀后备用；
2)根据步骤1)待测样本、阴性对照品、阳性对照品的数量，向每检测孔内加入PCR预混液18μL，再将待测样本、阴性对照品、阳性对照品分别加入至不同的检测孔内，充分混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备用；
3)根据步骤2)中待测样本的性质，使用相应的DNA提取试剂盒进行样本DNA提取，进行DNA浓度测定并稀释至10ng/μL，备用；
4)根据待测样本、阴性对照品、阳性对照品的数量向相应数量的反应管中加入18μL的PCR-mix，并取步骤3)制备的样本DNA、阴性对照品、阳性对照品各取2μL加入到PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
5)将步骤4)得到的待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试，荧光定量PCR反应条件，具体条件如表2所示：
6)得到Ct值，并根据相应的检测孔中FAM及VIC的Ct值，其中FAM代表突变信号，VIC代表野生信号，若FAM有信号VIC无信号则为纯合突变；VIC有信号FAM无信号则为纯合野生；FAM及VIC都有信号则为杂合突变。
实施例7
(1)人ABCB1基因引物探针准确度验证试验，根据人ABCB1G1165C(rs1801253)序列信息，分别合成野生型ABCB1-Wt质粒及突变型ABCB1-Mut质粒，将其稀释至1000copys/ul，备用；
具体实施如下：
用于ABCB1位点的野生型探针引物(Wt)，突变型探针引物(Mut)及通用引物：
ABCB1-Wt：w3
VIC-AGACTCCCAATCAGAATACGTGGTGTCACAGGAAGAGtTC-Bhq1
ABCB1-Mut：m2
FAM-ATGTATAGTGATTGGGAGGTGGTGTCACAGGAAGAGcTT-Bhq1
ABCB1通用引物：AGAGACTTACATTAGGCAGTG
表3：PCR反应体系
根据表3配制qPCR反应液，每孔18ul，分装至8联排管1号，2号及3号管中，其中1号管加入野生型ABCB1-Wt质粒2ul；2号管加入突变型ABCB1-Mut质粒2ul；3号管加入野生型ABCB1-Wt质粒及突变型ABCB1-Mut质粒各1ul；反应程序参考表3，实验结果显示：1号管中ABCB1-Wt引物引物高效扩增ABCB1-Wt质粒，而对ABCB1-Mut质粒几乎不扩增；2号管中ABCB1-Mut引物高效扩增ABCB1-Mut质粒，而对ABCB1-Wt质粒几乎不扩增，3号管中加入ABCB1-Wt及ABCB1-Mut质粒，其对应的VIC和FAM均产生相当的荧光信号。相应的检测结果如图1、图2及图3所示。
效果例
采用人ABCB1G1165C(rs1801253)位点基因的野生及突变型探针引物对22个样本进行检测，其中包含3种类型临床样本，口腔脱落细胞、唾液及血液样本。口腔样本和唾液样本采用郑州华沃生物科技有限公司的快速免提核酸释放剂进行处理样本，而血液样本采用市面上的血液基因组提取试剂盒。反应体系配制参考表2，同时加入内控检测样本提取质量，反应程序参考表2。结果如下：1-21号样本根据上述判断标准进行基因分型，其中22号样本采用3种类型样本进行对比验证，结果显示3种样本检测结果一致，因此采用快速免提核酸释放剂不仅可以无创采样，同时还不需要提取DNA(只需浸泡10-20min即可)，而且缩短了这个实验流程，大大降低了检测机构的工作量。
其中，采用的突变模板序列为SEQ.ID.NO.14；采用的野生模板序列为SEQ.ID.NO.15。
SEQ.ID.NO.14
ACCTGGGCATCGTGTCCCAGGAGCCCATCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGAGAACATTGCCTATGGAGACAACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATtGTGAGGGCAGCAAAGGAGGCCAACATACATGCCTTCATCGAGTCACTGCCTAATGTAAGTCTCTCTTCAAATAAACAGCCTGGGAGCATGTGGCAGCCT
SEQ.ID.NO.15：
ACCTGGGCATCGTGTCCCAGGAGCCCATCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGAGAACATTGCCTATGGAGACAACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATcGTGAGGGCAGCAAAGGAGGCCAACATACATGCCTTCATCGAGTCACTGCCTAATGTAAGTCTCTCTTCAAATAAACAGCCTGGGAGCATGTGGCAGCCT
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
序列表
<110> 郑州华沃生物科技有限公司
<120> ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法
<140> 2021113247619
<141> 2021-11-10
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcgatcaga ctcccaatca gaatacgatc gcg 33
<210> 2
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcgatcatg tatagtgatt gggaggatcg cg 32
<210> 3
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agactcccaa tcagaatacg tggtgtcaca ggaagagagc 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agactcccaa tcagaatacg tggtgtcaca ggaagagttc 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agactcccaa tcagaatacg tggtgtcaca ggaagagctc 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agactcccaa tcagaatacg tggtgtcaca ggaagatatc 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agactcccaa tcagaatacg tggtgtcaca ggaagacatc 40
<210> 8
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtatagtg attgggaggt ggtgtcacag gaagagagt 39
<210> 9
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgtatagtg attgggaggt ggtgtcacag gaagagttt 39
<210> 10
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgtatagtg attgggaggt ggtgtcacag gaagagctt 39
<210> 11
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgtatagtg attgggaggt ggtgtcacag gaagatatt 39
<210> 12
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgtatagtg attgggaggt ggtgtcacag gaagacatt 39
<210> 13
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agagacttac attaggcagt g 21

Claims (6)

1.一种ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针，其特征在于，包括分子信标序列、野生型分子信标的ARMS引物序列、突变型分子信标的ARMS引物序列和通用下游引物；所述分子信标序列包括野生型分子信标和突变型分子信标；野生型分子信标的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
突变型分子信标的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
所述野生型分子信标的ARMS引物序列组包括w1、w2、w3、w4和w5中的至少一个；其中，w1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；w2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；w3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；w4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；w5的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；
所述突变型分子信标的ARMS引物序列中包括m1、m2、m3、m4和m5中的至少一个；其中，m1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示；m2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示；m3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示；m4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示；m5的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示；
所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示。
2.一种用于检测人ABCB1基因的SNP位点C3435T多态性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的ABCB1基因C3435T的SNP位点多态性的引物和探针、PCR检测反应液、酶混合液、阳性对照品及阴性对照品。
3.根据权利要求2所述的用于检测人ABCB1基因的SNP位点C3435T多态性的试剂盒，其特征在于，所述PCR检测反应液包括pH值为8.5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为20mmol/L的硫酸镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的甘油溶液。
4.根据权利要求2所述的用于检测人ABCB1基因的SNP位点C3435T多态性的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括1U/μL～5U/μL的耐热DNA聚合酶。
5.根据权利要求2所述的用于检测人ABCB1基因的SNP位点C3435T多态性的试剂盒，其特征在于，在qPCR反应体系中引物浓度为0.2～1.0uM。
6.根据权利要求2所述的用于检测人ABCB1基因的SNP位点C3435T多态性的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为质粒，野生基因型ABCB1-Wt及突变型ABCB1-Mut均为1000copys/ul；阴性对照品为灭菌水。
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