CN104630342A

CN104630342A - 一种室温下检测abcb1 c3435t/a的试剂盒

Info

Publication number: CN104630342A
Application number: CN201410687522.3A
Authority: CN
Inventors: 魏敏杰; 吴慧哲; 张晶; 陈秋晨
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Medical University
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2015-05-20

Abstract

本发明提供了一种锁核酸修饰的寡核苷酸探针和一种室温杂交缓冲液，借助常规的磁珠分离技术，在室温条件下快速检测ABCB1的C3435T/A的多态性，所述的试剂盒包括3个单锁核酸修饰的寡核苷酸探针、室温用杂交缓冲液、5’端修饰生物素的引物一条、正常引物一条、表面修饰亲和素的磁珠，其特征在于：探针-C：5'-6FAM-CTCAC G^LATCTCT-3'，探针A：5'-ROX -CTCAC A^LATCTCT-3'，探针T：5'-ROX-CTCAC T^LATCTCT-3'，序列中的碱基右上标记有字母L的核苷酸其母核为锁核酸，其它核苷酸的母核均为脱氧核糖核酸；室温用杂交缓冲液成分为：磷酸盐浓度0.01mol/L，氯化钠浓度0.25mol/L，甲酰胺的浓度以体积比计算为5%，pH值为7.4。

Description

一种室温下检测ABCB1 C3435T/A的试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的涉及一种用探针法检测基因ABCB1 C3435T /A单核苷酸多态性的试剂盒。

背景技术

ATP结合盒亚家族B运载体1（ABCB1）基因，亦称多药耐药基因1（MDR1）。该基因定位于人类7号染色体 q21.1，其cDNA 的全长为4669 bp，包含28个外显子，转录可得到4.5kb的mRNA，编码一个长度为 170kDa 的跨膜糖蛋白（P-gp）。P-gp可将内源性或外源性细胞毒物质泵出细胞外，在介导细胞多药耐药性过程中起着重要作用。有研究显示ABCB1 C3435T /A多态与多种药物的在体内的血药浓度及细胞耐药性密切相关，其多态性包括6种亚型：CC型、TT型、AA型；CT型、CA型、TA型。药物基因组学研究表明，30%~85%的个体间药物代谢酶、药物转运体或药物靶点活性的差异由遗传因素决定。ABCB1基因遗传变异与肿瘤易感性及对化疗反应的个体差异密切相关，且其编码的有数据显示ABCB1C3435T/A位点遗传变异与白血病患者预后具有相关性，携带CC、CT或TT基因型患者的OS（总生存率）显著不同，不同亚型的复发率也存在差异；在乳腺癌化疗耐受性研究中发现，CT或TT基因型的患者在术后紫杉醇化疗的乳腺癌患者的PFS（无进展生存期）或者OS明显延长；该位点变异还与大肠癌的发病相关，发病人群中携带CC或CT亚型的人数明显高于普通人群；目前认为该位点SNPs虽然未改变氨基酸序列，但与ABCB1其它突变位点间有一定的连锁从而影响氨基酸残基位置或其他增强子促进子基因组序列，以及影响与 mRNA修饰有关的功能等，连锁程度在不同种族间差异很大，且均具有重要的功能意义。

目前公认的单碱基突变检测方法是以Sanger双脱氧链终止法为代表的DNA测序法，但该法操作复杂所需时间较长。常用方法还有Taqman探针法及高分辨率DNA溶解度曲线法，这两种方法必须依靠精准的温控设备才能实现，如高分辨率Realtime PCR仪等。

发明内容

发明目的：本发明提供了一种锁核酸修饰的寡核苷酸探针和一种室温杂交缓冲液，借助常规的磁珠分离技术，在室温条件下快速检测ABCB1的C3435T /A的多态性。

[0004]技术方案：一种室温下检测ABCB1 C3535T/A的试剂盒，包括单锁核酸修饰的寡核苷酸探针和室温用杂交缓冲液，其特征在于：所述的单锁核酸修饰的寡核苷酸探针包括探针C、探针T和探针A，探针的核苷酸序列及锁核酸的修饰位置，序列中的碱基右上标记有字母L的核苷酸其母核为锁核酸，其它核苷酸的母核均为脱氧核糖核酸，探针结构分别为：

探针-C：5'-6FAM-CTCAC G^LATCTCT-3'；

探针A：5'- ROX -CTCAC A^LATCTCT-3'；

探针T：5'- ROX -CTCAC T^LATCTCT-3'；

所述的室温用杂交缓冲液由磷酸盐浓度为0.01 mol/L，氯化钠的浓度为0.25 mol/L，溶剂是电阻率为18 mΩ*cm上的超纯水，甲酰胺的浓度以体积比计算为5 %组成，且其pH值为7.4。

所述的室温下对ABCB1C3535T/A的检测方法，其特征在于：本检测方法是通过如下步骤来实现的：

步骤一：将目的DNA单链偶联到磁珠表面作为待测样本；

步骤二：探针在室温下对样本进行快速识别：取样本2份，各5 μL，通过磁分离器，将样本吸附与容器壁，弃掉上清液，容器中保留单链DNA；立即向1号容器中加入室温用杂交缓冲液20 μL，探针C与探针T各0.5 μL；平行操作向2号容器中加入杂交缓冲液20 μL，探针A 0.5 μL，探针浓度均为100 μmol/Lol / L；混匀后置摇床上进行杂交，杂交时间5 分钟，转速120 转/分钟，室温为25 ℃到40 ℃；

步骤三：利用磁分离器获得待检溶液：杂交结束后利用磁分离器，弃上清液，容器中保留单链DNA；各管中再分别加入PBST 100 μL，再利用磁分离器，将样本吸附与容器壁，洗涤2次，加10 μL PBS磷酸盐缓冲液，获得待检溶液；

步骤四：利用荧光显微镜或荧光微阵列扫描仪进行结果检测：取1号容器中待测液体1 μL点样在载玻片上，再取2号容器中待测液体1 μL点样在载玻片上，分别在激发波长为494 nm的FAM-绿色荧光基团和584 nm的ROX-红色荧光基团处观察2个液滴所发出的荧光；

步骤五：结果分析：1号容器中待检液体如果发出绿色荧光，即可认为样本DNA中存在C亚型即突变位点碱基为C，如果无荧光发出，可判定该突变位点碱基不是C；1号容器中待测液体如果发出红色荧光，即可认为样本DNA中存在T亚型即突变位点碱基为T，如果无荧光发出，判定该突变位点碱基不是T；2号容器中待检液体如果发出红色荧光，即可认为样本DNA中存在A亚型即突变位点碱基为A，如果无荧光发出，判定该突变位点碱基不是T。

所述的室温下对ABCB1C3535T/A的检测方法，其特征在于：在步骤五中，采用下表进行结果分析：

ABCB1基因（C3435T /A）6种突变亚型检测结果分析表

优点及效果：本发明的有益效果是，探针在室温下中具有极高的特异性，对于一个碱基差异的模板，其TM值相差35 ℃以上，对单碱基错配的识别能力明显高于普通寡核苷酸探针。无需温控装置，室温在25 -40 ℃范围内波动，不影响检测结果准确性。

附图说明:

图1：利用高分辨率Realtime PCR仪绘制的探针g在杂交缓冲液中分别与完全匹配模板（曲线A）及单碱基错配模板（曲线B）的DNA熔解曲线图。

图2：为从NCBI Gene数据库中获取的基因ABCB1的部分序列图。

图3：在室温25 ℃条件下，按照技术方案使用探针分别对6种人工合成的目的基因模板进行检测，各样本在荧光显微镜下得到的图像。

图4：用金属浴恒温在40 ℃条件下，按照技术方案使用探针分别对6种人工合成的目的基因模板进行检测，各样本在荧光显微镜下得到的图像。

图5：应用荧光微阵列扫描仪检测6例人血液基因组DNA中基因ABCB1的C3435T /A得到的图片。

图6~图11：为含突变位点的部分序列的6例志愿者血液样本提取的DNA组进行基因测序结果片段图。

图12：荧光强度与DNA模板线性关系图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例，对本发明进一步进行阐述：

实施例1：

步骤一：取表面修饰链酶亲和素的磁珠10 μL，加入结合/清洗缓冲液20 μL，磁分离弃上清。重复该操作1次。加入结合/清洗缓冲液40 μL和5’端修饰了生物素的CC型模板0.5 μL，模板序列为5’biotin-ACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATCGTGAGGGCAGCAAAGG AGGCCAACATA-3’，标记下划线的碱基为突变位点。混匀后置摇床上进行磁珠与PCR产物的偶联，时间为20分钟，转速120 转/分钟。磁分离弃上清。ABCB1基因（C3435T/A）DNA的核苷酸序列由NCBI Gene数据库获得，详见图2，图中下划线部分为实线的序列为PCR反应体系中正向引物的序列，下划线部分为双划线的序列为反向引物对应的序列，二者之间的序列为特异性PCR产物序列，方框中的碱基即为突变位点。全部DNA模板均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，100 μmol/L；表面修饰亲和素的磁珠购自西安金磁纳米技术生物股份有限公司，平均直径3 μm。

步骤二：加入杂交缓冲液 40 μL，平均分成2管，每管20 μL。向1号管中加入混合探针（浓度100 μmol/L的探针C和探针T各0.5 μL的混合液），向2号管中加入探针A 0.5 μL（探针浓度均为100 μmol/L），混匀后置摇床上进行杂交，杂交时间5 分钟，转速120 转/分钟，室温在25 ℃。

步骤三：杂交结束后磁分离弃上清液。每管加PBST 100 μL洗涤2次，加10 μL PBS磷酸盐缓冲液送检。

步骤四：取1号管和2号管各取待检液1 μL点样在载玻片上，置于荧光显微镜4×物镜下，分别在激发波长为494 nm和584 nm处观察荧光。1号管终产物在镜下可见绿色荧光， 2号管反应终产物未见荧光，如图3中 A1-A3所示。

步骤五：结果分析，依据表1该样本中所示ABCB1基因（C3435T /A）的亚型为CC型，与已知模板一级结构一致。

实施例2：

步骤一到步骤三操作同实例1；（所用模板序列为5’biotin-ACAGCCGGGTGGTGTCACA GGAAGAGATTGTGAGGGCAGCAAAGGAGGCCAACATA-3’）

步骤四：取1号管和2号管各取1 μL反应终产物滴与载玻片上，置于荧光显微镜4*物镜下，分别在激发波长为494 nm和584 nm处观察荧光。1号管终产物在镜下可见红色荧光；2号管反应终产物未见荧光，如图3中 B1-B3所示。

步骤五：结果分析，依据表1，该样本中基因ABCB1（C3435T /A）的亚型为TT型。与已知模板一级结构一致。

实施例3：

步骤一到步骤三操作同实例1；（所用模板序列为5’biotin-ACAGCCGGGTGGTGTCACA GGAAGAGATAGTGAGGGCAGCAAAGGAGGCCAACATA-3’）

步骤四：取1号管和2号管各1 μL反应终产物滴与载玻片上，置于荧光显微镜4*物镜下，分别在激发波长为494 nm和584 nm处观察荧光。1号管终产物在镜下未见荧光，2号管反应终产物可见红色荧光，如图3中C1-C3所示。

步骤五：结果分析，依据表1，该样本中ABCB1基因（C3435T /A）的亚型为AA型。与已知模板一级结构一致。

实施例4：

步骤一到步骤三操作同实例1；（所用模板为实例1与实例2模板按1:1比例混合的模板）

步骤四：取1号管和2号管各1 μL反应终产物滴与载玻片上，置于荧光显微镜4*物镜下，分别在激发波长为494 nm和584 nm处观察荧光。1号管终产物在镜下可见红绿2种荧光，如图5A、图5B所示；2号管反应终产物未见荧光，如图3 D1-D3所示。

步骤五：结果分析，依据表1，该样本中ABCB1基因（C3435T /A）的亚型为CT型，与已知模板一级结构一致。

实施例5：

步骤一到步骤三操作同实例1；（所用模板为实例1与实例3模板按1:1比例混合的模板）

步骤四：取1号管和2号管各1 μL反应终产物滴与载玻片上，置于荧光显微镜4*物镜下，分别在激发波长为494 nm和584 nm处观察荧光。1号管终产物在镜下可见绿色荧光，2号管反应终产物可见红色荧光，如图所示。

步骤五：结果分析，依据表1，该样本中ABCB1基因（C3435T /A）的亚型为CA型，与已知模板一级结构一致。

实施例6：

步骤一到步骤三操作同实例1；（所用模板为实例2与实例3模板按1:1比例混合的模板）

步骤四：取1号管和2号管各1 μL反应终产物滴与载玻片上，置于荧光显微镜4*物镜下，分别在激发波长为494 nm和584 nm处观察荧光。1号管终产物在镜下可见红色荧光，2号管反应终产物可见红色荧光，如图3 中F1-F3所示。

步骤五：结果分析，依据表1，该样本中基因ABCB1（C3435T /A）的亚型为TA型，与已知模板一级结构一致。

实施例7~实施例12：

仅更改实施例1~6中步骤二的杂交温度为40 ℃，其它操作不变，结果见图4 ，结果分析依据表1。与实施例1- 实施例6比较，所用模板相同的实例，检测结果无改变。

实施例13：

步骤一：

（1）提取6例志愿者血液DNA样本，进行特异性PCR扩增，反应体系50 μL构成如下：2×PCR 缓冲液 25 μL（含 MgCl₂3 mmol/L、dNTP 0.22 mmol/L、Taq DNA polymerase 5 U/μL）、ddH₂O 20 μL、DNA样本1 μL、特异性扩增引物primer 1和primer 2各2 μL（其序列分别为：5'-biotin-GATCTGTGAACTCTTGTTTTCA-3'和5'-ACAACAGCCGGGTGGTGTCA-3'浓度为100 nmol/L）。

（2）PCR反应条件如下：第一步，94 ℃ 5 分钟；第二步，94 ℃ 30秒→59 ℃ 30秒→72 ℃ 30秒，循环35次；第三步，72 ℃ 2分钟。PCR产物为244 bp，核苷酸序列见图2，方框内碱基为突变位点。

步骤二：取表面修饰链酶亲和素的磁珠10 μL，加入结合/清洗缓冲液20 μL，磁分离弃上清。重复该操作1次。加入结合/清洗缓冲液和PCR产物各40 μL，混匀后置摇床上进行磁珠与PCR产物的偶联，时间为20分钟，转速120 转/分钟。

步骤三：偶联完成后，磁分离弃上清。加入DNA变性液200 μL，室温下静止1 分钟，再磁分离弃上清，重复变性操作1次。加入PBST 200 μL冲洗1次，杂交缓冲液 20 μL冲洗1次。

步骤四：加入杂交缓冲液 40 μL，平均分成2管，每管20 μL。向1号管中加入混合探针1.0 μL，（探针C与探针T各0.5 μL），向2号管中加入探针A 0.5 μL（探针浓度均为100 μmol/L），混匀后置摇床上进行杂交，杂交时间5 分钟，转速120 转/分钟。杂交结束后磁分离弃上清液。每管加PBST 100 μL洗涤2次，加10 μL PBS磷酸盐缓冲液待检。

步骤五：利用荧光微阵列扫描仪同时检测6例样本，每例待检样本点样3次排成一列，1号管中的待检液点在一张载玻片上；2号管中的待检液点在另一张载玻片上，红绿荧光的激发波长分别是494 nm和584 nm。

步骤六：结果分析，依据表1，1号管待检液发出绿色荧光为C亚型阳性，发出红色荧光为T亚型阳性，发出黄色荧光为C、T亚型双阳性（黄色荧光为红绿两种荧光的混合色），如图5A所示；2号管待检液发出红色荧光为A亚型阳性，无荧光为A亚型阴性，如图5B所示。因此6例DNA样本检测结果从左至右依次为：CC型、CC型、TT型、TT型、CT型和CT型，与基因测序结果比较结论一致，测序结果见图6-图11。A亚型为近年新发现突变，人群中极罕见，本发明所涉及样本中均未检出。

图2为从NCBI Gene数据库中获取的ABCB1基因的部分序列图，该序列图还包含了C3435T /A突变位点。

图5：为按照步骤一至步骤五所述操作，应用荧光微阵列扫描仪检测6例基因组DNA中基因ABCB1（C3435T /A）SNP的图片。

图6：黑色框内的碱基即为ABCB1（C3435T /A）的突变位点，本图结果显示被测样本目的基因型为CC型。

图7：黑色框内的碱基即为ABCB1（C3435T /A）的突变位点，本图结果显示被测样本目的基因型为CC型。

图8：黑色框内的碱基即为ABCB1（C3435T /A）的突变位点，本图结果显示被测样本目的基因型为TT型。

图9：黑色框内的碱基即为ABCB1（C3435T /A）的突变位点，本图结果显示被测样本目的基因型为TT型。

图10：黑色框内的碱基即为ABCB1（C3435T /A）的突变位点，本图结果显示被测样本目的基因型为CT型。

图11：黑色框内的碱基即为ABCB1（C3435T /A）的突变位点，本图结果显示被测样本目的基因型为CT型。

线性范围：

利用高分辨率Realtime PCR仪绘制的探针g在杂交缓冲液中分别与完全匹配模板（曲线A）及单碱基错配模板（曲线B）的DNA熔解曲线见图1。

相同反应条件下肉眼及仪器对绿色荧光的识别能力低于红色荧光，故以检出绿色荧光阳性为标准来确定线性范围。以探针C检测CC型模板作为阳性样本，以探针C检测TT型模板作为阴性对照，平行进行实例1操作的步骤一至步骤三，应用Real-time PCR仪在激发波长为494 nm处读取荧光强度值，高于阴性对照标准差2倍的荧光强度值视为检测结果阳性，具体结果见图12。线性范围为10 nmol/L~1000 nmol/L，定量下限为5 nmol/L。

荧光强度与DNA模板线性关系详见图12。

Claims

1.一种室温下检测ABCB1 C3535T/A的试剂盒，包括单锁核酸修饰的寡核苷酸探针和室温用杂交缓冲液，其特征在于：所述的单锁核酸修饰的寡核苷酸探针包括探针C、探针T和探针A，探针的核苷酸序列及锁核酸的修饰位置，序列中的碱基右上标记有字母L的核苷酸其母核为锁核酸，其它核苷酸的母核均为脱氧核糖核酸，探针结构分别为：

探针-C：5'-6FAM-CTCAC G^LATCTCT-3'；

探针A：5'- ROX -CTCAC A^LATCTCT-3'；

探针T：5'- ROX -CTCAC T^LATCTCT-3'；

2.一种如权利要求1所述的室温下对ABCB1 C3535T/A的检测方法，其特征在于：本检测方法是通过如下步骤来实现的：

步骤一：将目的DNA单链偶联到磁珠表面作为待测样本；

3.根据权利要求2所述的室温下对ABCB1 C3535T/A的检测方法，其特征在于：在步骤五中，采用下表进行结果分析：

ABCB1基因（C3435T /A）6种突变亚型检测结果分析表

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