CN106497916A - 一种用于高通量测序检测的nk细胞多基因变异文库的构建方法及其应用 - Google Patents

一种用于高通量测序检测的nk细胞多基因变异文库的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于高通量测序检测NK细胞多基因变异文库的构建方法，其特征在于：覆盖人类基因PDGFRA、c‑KIT、STAT3、STAT5B、JAK‑3、PI3K、TP53和K‑ras上的基因突变位点。本发明的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要15～30分钟即可，结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上淋巴瘤中临床样本基础上需要对多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉。

Description

一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方 法及其应用
技术领域
本发明具体涉及一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法及其应用。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。
结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(extranodal NK/T cell lymphoma，nasal type；N-NK/T-L)是高发于亚洲，尤其是中国的一组与EB病毒感染密切相关的淋巴瘤，现认为活化的NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞可能为其正常对应细胞。目前对该病在临床和组织病理学上已有一些认识，确切诊断需要依据临床、病理、免疫表型特征和分子基础进行综合分析。研究表明NK/T细胞淋巴瘤与PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras基因突变相关，这些基因突变可以作为NK细胞淋巴瘤辅助诊断和用药参考。因此临床上迫切需要一种快速、高通量的检测多基因多位点的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法。
本发明的另一目的在于提供基于上述构建方法的试剂盒。
本发明的具体技术方案如下：
一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法，覆盖人类基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras上的基因突变位点，具体包括如下步骤：
(1)针对目的基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras设计一基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该第一基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃，具体的，该基本扩增引物组包括KIT-1-F、KIT-1-R、KIT-2-F、KIT-2-R、KIT-3-F、KIT-3-R、KIT-4-F、KIT-4-R、KIT-5-F、KIT-5-R、PDG-1-F、PDG-1-R、PDG-2-F、PDG-2-R、PDG-3-F、PDG-3-R、KRAS-1-F、KRAS-1-R、KRAS-2-F、KRAS-2-R、KRAS-3-F、KRAS-3-R、P53-1-F、P53-1-R、P53-2-F、P53-2-R、P53-3-F、P53-3-R、P53-4-F、P53-4-R、P53-5-F、P53-5-R、P53-6-F、P53-6-R、P53-7-F、P53-7-R、P53-8-F、P53-8-R、JAK3-1-F、JAK3-1-R、STAT3-1-F、STAT3-1-R、STAT3-2-F、STAT3-2-R、STAT5B-1-F、STAT5B-1-R、PI-1-F、PI-1-R、PI-2-F和PI-2-R，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 50所示；
(2)设计一不对称连接探针组与一不与人类基因组形成互补的通用引物，不对称连接探针组含有多对不同的不对称连接探针，每对不对称连接探针均包括可自身形成环状的一正向探针和一反向探针，该正向探针和反向探针从3’端至5’端均依次包括一能够与不对称连接探针的5’端若干连续碱基配对的互补序列、一与所述通用引物互补配对的扩增序列和一与上述2～5个T相对应的粘性末端识别序列，同时各正向探针和反向探针均具有相应的标签序列，上述每对不对称连接探针的正向探针和反向探针的Tm值相差不超过1℃，具体的，所述不对称连接探针组包括Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR，其序列依次如SEQ ID 51～SEQ ID 82所示，上述BC1～8分别表示八种不同的标签序列；
(3)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将上述扩增产物、不对称连接探针组、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR，纯化后获得所述用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库；
上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述基本扩增引物组由KIT-1-F、KIT-1-R、KIT-2-F、KIT-2-R、KIT-3-F、KIT-3-R、KIT-4-F、KIT-4-R、KIT-5-F、KIT-5-R、PDG-1-F、PDG-1-R、PDG-2-F、PDG-2-R、PDG-3-F、PDG-3-R、KRAS-1-F、KRAS-1-R、KRAS-2-F、KRAS-2-R、KRAS-3-F、KRAS-3-R、P53-1-F、P53-1-R、P53-2-F、P53-2-R、P53-3-F、P53-3-R、P53-4-F、P53-4-R、P53-5-F、P53-5-R、P53-6-F、P53-6-R、P53-7-F、P53-7-R、P53-8-F、P53-8-R、JAK3-1-F、JAK3-1-R、STAT3-1-F、STAT3-1-R、STAT3-2-F、STAT3-2-R、STAT5B-1-F、STAT5B-1-R、PI-1-F、PI-1-R、PI-2-F和PI-2-R组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述不对称连接探针组由Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述通用引物为C-primer，其序列如SEQ ID 83所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成，比例0.8～1.2∶0.8～1.2∶0.8～1.2。
进一步优选的，所述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成，比例1∶1∶1。
一种基于上述构建方法的试剂盒，其特征在于：包括：
一DNA富集反应组件，由所述基本扩增引物组组成；
一RingCap-Taq酶，由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成；
一Barcode1～8反应组件，由所述不对称连接探针组和通用引物组成，具体包括连在一起的八个反应孔，每个反应孔分别装有对应的标签序列的不对称连接探针和通用引物；
一阳性质控品；
和一阴性质控品。
本发明的有益效果是：
1、本发明的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要15～30分钟即可，结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上NK细胞淋巴瘤疾病中在少量的临床样本基础上需要对多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉。
2、本发明的构建方法所制备的文库序列可被目前高通量测序系统识别并进行检测，从而实现文库构建进行核酸序列的检测的应用，该核酸检测可应用于目前多种高通量测序平台、基因芯片平台、杂交检测平台。
附图说明
图1为本发明的实施例构建的核酸文库进行高通量测序总数据图。
图2为本发明的实施例检测NK细胞多基因的检测均一性结果图。
图3为本发明的实施例检测NK细胞多基因的检测突变结果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
下述实施例中的HotStar-Taq酶、T4 DNA连接酶、DNA末端修饰酶、RingCapbuffer、MgCl2和dNTPs均购自中国大连宝生物公司。
实施例1
一种用于高通量测序检测的NK细胞基因变异文库的构建方法，覆盖人类基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras上的基因突变位点。
具体包括如下步骤：
(1)针对目的基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras设计基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该第一基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；所述扩增引物组由KIT-1-F、KIT-1-R、KIT-2-F、KIT-2-R、KIT-3-F、KIT-3-R、KIT-4-F、KIT-4-R、KIT-5-F、KIT-5-R、PDG-1-F、PDG-1-R、PDG-2-F、PDG-2-R、PDG-3-F、PDG-3-R、KRAS-1-F、KRAS-1-R、KRAS-2-F、KRAS-2-R、KRAS-3-F、KRAS-3-R、P53-1-F、P53-1-R、P53-2-F、P53-2-R、P53-3-F、P53-3-R、P53-4-F、P53-4-R、P53-5-F、P53-5-R、P53-6-F、P53-6-R、P53-7-F、P53-7-R、P53-8-F、P53-8-R、JAK3-1-F、JAK3-1-R、STAT3-1-F、STAT3-1-R、STAT3-2-F、STAT3-2-R、STAT5B-1-F、STAT5B-1-R、PI-1-F、PI-1-R、PI-2-F和PI-2-R组成，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 50所示；
(2)设计一不对称连接探针组与一不与人类基因组形成互补的通用引物，该不对称连接探针组含有多对不同的不对称连接探针，每对不对称连接探针均包括可自身形成环状的一正向探针和一反向探针，该正向探针和反向探针从3’端至5’端均依次包括一能够与不对称连接探针的5’端若干连续碱基配对的互补序列、一与所述通用引物互补配对的扩增序列和一与上述2～5个T相对应的粘性末端识别序列，同时各正向探针和反向探针均具有相应的标签序列，上述每对不对称连接探针的正向探针和反向探针的Tm值相差不超过1℃；具体的，所述不对称连接探针组由Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR组成，其序列依次如SEQ ID 51～SEQ ID82所示；
(3)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将上述扩增产物、不对称连接探针组、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR，纯化后获得所述用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库；
(4)通过Ion torrent PGM高通量测序仪进行文库上机检测，获得目标序列信息，通过VC软件进行数据信息比对分析，得到样本突变状态。
上述模板所来自的样品适用范围包括非肝素抗凝外周血标本。
使用Qiagen公司石蜡组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取石蜡切片5片。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到2ng/μl作为PCR扩增的模板。
基于上述构建方法的试剂盒包括：
一富集反应组件，由基本扩增引物组组成，每人份的DNA富集反应组件的配方如下表所示：
一RingCap-Taq酶，由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成，比例0.8～1.2∶0.8～1.2∶0.8～1.2，优选比例1∶1∶1；
一Barcode1～8反应组件，由不对称连接探针组和通用引物组成，具体包括连在一起的八个反应孔，每个反应孔分别装有对应的标签序列的不对称连接探针和通用引物，每人份的Barcode1～8反应组件的配方如下表所示：
一阴性质控品，无核酸水；
和一阳性质控品，由20个阳性突变质粒序列野生型基因组DNA混合而成，浓度为2ng/μL。
将上述试剂盒用前述的构建方法进行实验，实验样本为100份健康的全血样品。
所述PCR反应体系的模板量(待测样品、阳性质控品和阴性质控品)为5uL，其余组分如下表所示：
PCR扩增程序设置如下表：
上述PCR反应体系所得的扩增产物的纯化具体如下：
取出Agencourt AMPure XP试剂置于室温，同时要打散磁珠，同时配制新鲜的70％的乙醇(230μL无水乙醇+100μL无核酸酶水)，必须是新鲜配制的。
纯化步骤
(1)向上述吸取的上清液25μL中加入30μL(1.2x样本体积)的Agencourt AMPureXP试剂，上下吸取吹打5次，完全混匀重悬DNA；
(2)室温孵育5分钟；
(3)放置在磁力架上面，孵育3分钟，一直到溶液澄清，小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠；注意：磁珠上含有扩增文库不要丢弃。
(4)加入150μl新鲜配制的70％乙醇，没过磁珠样品即可，离心管正反方向移动5次，然后磁力架上孵育2分钟，去除上清液；
(5)重复上述步骤4，进行第二次洗涤；
(6)确保乙醇液滴已全部从孔中吸走，将板放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥。
(7)将样品管从磁力架上拿开，在每孔中加入25μL TE(PH8.0)缓冲液充分浸润磁珠。充分振荡混匀，快速离心将液体收集到管底。(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)；注意：上清液含有扩增文库不要丢弃。
将样品管置于磁力架上2分钟。上清液中含有扩增产物。取出20μL上清。
上述纯化所得的扩增产物制备文库产物的PCR反应的模板量为5uL，RingCap-Taq酶(具体由HotStar-Taq酶、T4 DNA连接酶和DNA末端修饰酶1∶1∶1的比例组成，物料浓度：5U/μL/每种)的加入量为0.25μL，其余组分如下表所示：
PCR扩增程序设置如下表：
分别按纯化扩增产物方法进行纯化，制得所述用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库。
上述文库产物的检测具体如下：
如图1所示，采用Ion torrent PGM半导体测序仪(Thermofisher公司)一次可以检测16份样品(包括阴阳性对照)。
前述100份石蜡组织样品经本发明的体系检测，有检测到多种基因突变类型，进一步证明了该方法的特异性。
如图2和图3所示，重复性试验：每个反应分别加入突变细胞系DNA10ng、1ng和100pg，重复10次进行高通量测序检测，10次结果一致，符合率100％。
以上可知本发明NK细胞多基因文库构建反应就可以同时检测8个基因突变位点，文库构建时间仅需3小时，因此本发明省时省力，准确性高，可满足突变的快速诊断。而且，高通量测序法和传统测序方法结果的符合率为100％。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (7)

1.一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法，其特征在于：覆盖人类基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras上的基因突变位点，具体包括如下步骤：
(1)针对目的基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras设计一基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该第一基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃，具体的，该基本扩增引物组包括KIT-1-F、KIT-1-R、KIT-2-F、KIT-2-R、KIT-3-F、KIT-3-R、KIT-4-F、KIT-4-R、KIT-5-F、KIT-5-R、PDG-1-F、PDG-1-R、PDG-2-F、PDG-2-R、PDG-3-F、PDG-3-R、KRAS-1-F、KRAS-1-R、KRAS-2-F、KRAS-2-R、KRAS-3-F、KRAS-3-R、P53-1-F、P53-1-R、P53-2-F、P53-2-R、P53-3-F、P53-3-R、P53-4-F、P53-4-R、P53-5-F、P53-5-R、P53-6-F、P53-6-R、P53-7-F、P53-7-R、P53-8-F、P53-8-R、JAK3-1-F、JAK3-1-R、STAT3-1-F、STAT3-1-R、STAT3-2-F、STAT3-2-R、STAT5B-1-F、STAT5B-1-R、PI-1-F、PI-1-R、PI-2-F和PI-2-R，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 50所示；
(2)设计一不对称连接探针组与一不与人类基因组形成互补的通用引物，不对称连接探针组含有多对不同的不对称连接探针，每对不对称连接探针均包括可自身形成环状的一正向探针和一反向探针，该正向探针和反向探针从3’端至5’端均依次包括一能够与不对称连接探针的5’端若干连续碱基配对的互补序列、一与所述通用引物互补配对的扩增序列和一与上述2～5个T相对应的粘性末端识别序列，同时各正向探针和反向探针均具有相应的标签序列，上述每对不对称连接探针的正向探针和反向探针的Tm值相差不超过1℃，具体的，所述不对称连接探针组包括Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR，其序列依次如SEQ ID 51～SEQ ID 82所示，上述BC1～8分别表示八种不同的标签序列；
(3)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将上述扩增产物、不对称连接探针组、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR，纯化后获得所述用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库；
上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述基本扩增引物组由KIT-1-F、KIT-1-R、KIT-2-F、KIT-2-R、KIT-3-F、kiT-3-R、KIT-4-F、KIT-4-R、kIT-5-F、kIT-5-R、PDG-1-F、PDG-1-R、PDG-2-F、PDG-2-R、PDG-3-F、PDG-3-R、KRAS-1-F、KRAS-1-R、KRAS-2-F、KRAS-2-R、KRAS-3-F、KRAS-3-R、P53-1-F、P53-1-R、P53-2-F、P53-2-R、P53-3-F、P53-3-R、P53-4-F、P53-4-R、P53-5-F、P53-5-R、P53-6-F、P53-6-R、P53-7-F、P53-7-R、P53-8-F、P53-8-R、JAK3-1-F、JAK3-1-R、STAT3-1-F、STAT3-1-R、STAT3-2-F、STAT3-2-R、STAT5B-1-F、STAT5B-1-R、PI-1-F、PI-1-R、PI-2-F和PI-2-R组成。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述不对称连接探针组由Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR组成。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述通用引物为C-primer，其序列如SEQID 83所示。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成，比例0.8～1.2∶0.8～1.2∶0.8～1.2。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成，比例1∶1∶1。
7.一种基于权利要求1至6中任一权利要求所述的构建方法的试剂盒，其特征在于：包括：
一DNA富集反应组件，由所述基本扩增引物组组成；
一RingCap-Taq酶，由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成；
一Barcode1～8反应组件，由所述不对称连接探针组和通用引物组成，具体包括连在一起的八个反应孔，每个反应孔分别装有对应的标签序列的不对称连接探针和通用引物；
一阳性质控品；
和一阴性质控品。
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