CN106939337A - 激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法 - Google Patents
激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法,其特征在于:覆盖人类基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1上的总共1357种体细胞突变。本发明的构建方法针对多个靶序列进行单管,快速完成文库的构建,整个文库构建过程仅需要2~3小时,手动时间仅仅需要45分钟即可,可以十分有效的解决目前对于临床上乳腺癌复发监测中在少量的外周血样本基础上需要对体细胞多基因、多靶点检测这一难点,且成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于高通量测序检测的激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法。
背景技术
乳腺癌未来将成为癌症幸存者最多的群体,其依据早期分子分型存在着两个复发高峰期,分别为术后1-3年和5-10年,期间需进行反复的影像学等检查,尤其是激素受体阳性患者,内分泌治疗已被建议延续至10年,但尚无疗效预测因子能精准鉴别获益人群,且具有诸多并发症,因此研发乳腺癌无创疗效预测与监测系统是十分必要的,将降低患者放射学受量和减少患者接受不必要的治疗副作用。CA15-3、CEA等传统肿瘤标志物在监测乳腺癌复发方面敏感性与特异性均较差,循环肿瘤细胞(CTC)检测新近也被认为价值有限。循环肿瘤DNA(ctDNA)则极具应用前景,有证据表明其在乳腺癌患者中的检测敏感性与准确评估肿瘤负荷变化等方面均显著强于前两者。肿瘤高通量测序等技术发展,在提高ctDNA检测灵敏度(5-10ng,约10ml血液/例)的同时,也在不断降低其检测成本。
另一方面,激素受体阳性乳腺癌约占总发病率的75%,内分泌治疗是该类型晚期乳腺癌优先推荐的治疗手段。然而,这种治疗决策仅根据初始治疗所确定的分子分型以及当前临床表现是否为“惰性”的主观判断,而乳腺癌原发病变与转移灶的分子生物学特征已被证实具有显著差异;同时,一旦应用内分泌治疗,其起效时间平均需2个月左右,期间又常受到“闪烁”现象干扰,导致常规检测手段失真;另外,该类型晚期乳腺癌常多发皮肤与骨转移,上述病灶很难应用现有影像学手段予以客观评价。这些因素常给该型患者的治疗决策造成巨大困扰,限制内分泌治疗的最大受益。临床前研究证实,血清ESR1等ct DNA突变定量检测能预测内分泌治疗疗效与准确评估肿瘤负荷的动态变化。
乳腺癌复发与转移后突出表现的瘤间与瘤内异质性,以及其随治疗进程呈现的时空异质性演变,是当前临床诊治面临的最大挑战。在晚期乳腺癌患者中应用肿瘤组织DNA与循环肿瘤DNA联合进行基因突变分析,经证实有较高的一致性(可达76%),表明ctDNA具有替代晚期乳腺癌患者组织活检的可行性,这也有助于破解晚期乳腺癌患者难以反复活检的临床难题。同时,乳腺癌基因组学研究的进展,初步确定了与内分泌治疗、化疗、靶向治疗敏感性或抗拒性有关的突变基因,因此可通过ctDNA检测解析其动态变化及其意义。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足,本发明提供了一种用于高通量测序检测的激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法。
为了解决上述技术问题,本发明采用了如下技术方案:
覆盖人类基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1上的总共1357种体细胞突变,具体包括如下步骤:
(1)针对目的基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1设计基本扩增引物组,该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2~5个T,且该2~5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰,同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃;
(2)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增,纯化后得扩增产物;将扩增产物、多对第一不对称连接探针、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR,纯化后获得文库产物;
(3)将文库产物组成所述用于高通量测序的肿瘤基因变异文库;
上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。
作为本发明的一种优选方案,所述第一扩增引物组包括ZQ-KRAS-1-F、ZQ-KRAS-1-R、ZQ-KRAS-2-F、ZQ-KRAS-2-R、ZQ-KRAS-3-F、ZQ-KRAS-3-R、ZQ-JAK3-1-F、ZQ-JAK3-1-R、ZQ-JAK3-2-F、ZQ-JAK3-2-R、ZQ-JAK3-3-F、ZQ-JAK3-3-R、ZQ-AKT1-1-F、ZQ-AKT1-1-R、ZQ-CREBBP-1-F、ZQ-CREBBP-1-R、ZQ-PTEN-1-F、ZQ-PTEN-1-R、ZQ-PTEN-2-F、ZQ-PTEN-2-R、ZQ-PTEN-3-F、ZQ-PTEN-3-R、ZQ-PTEN-4-F、ZQ-PTEN-4-R、ZQ-PTEN-5-F、ZQ-PTEN-5-R、ZQ-PTEN-6-F、ZQ-PTEN-6-R、ZQ-PTEN-7-F、ZQ-PTEN-7-R、ZQ-RB1-1-F、ZQ-RB1-1-R、ZQ-TP53-1-F、ZQ-TP53-1-R、ZQ-TP53-2-F、ZQ-TP53-2-R、ZQ-TP53-3-F、ZQ-TP53-3-R、ZQ-TP53-4-F、ZQ-TP53-4-R、ZQ-TP53-5-F、ZQ-TP53-5-R、ZQ-TP53-6-F、ZQ-TP53-6-R、ZQ-TP53-7-F、ZQ-TP53-7-R、ZQ-TP53-8-F、ZQ-TP53-8-R、ZQ-CTNNB1-1-F、ZQ-CTNNB1-1-R、ZQ-TSC2-1-F、ZQ-TSC2-1-R、ZQ-TSC1-1-F、ZQ-TSC1-1-R、ZQ-TSC1-2-F、ZQ-TSC1-2-R、ZQ-ERBB2-1-F、ZQ-ERBB2-1-R、ZQ-ERBB2-2-F、ZQ-ERBB2-2-R、ZQ-ERBB2-3-F、ZQ-ERBB2-3-R、ZQ-ERBB2-4-F、ZQ-ERBB2-4-R、ZQ-ERBB2-5-F、ZQ-ERBB2-5-R、ZQ-ERBB2-6-F、ZQ-ERBB2-6-R、ZQ-ERBB2-7-F、ZQ-ERBB2-7-R、ZQ-PIK3CA-1-F、ZQ-PIK3CA-1-R、ZQ-PIK3CA-2-F、ZQ-PIK3CA-2-R、ZQ-PIK3CA-3-F、ZQ-PIK3CA-3-R、ZQ-SF3B1-1-F、ZQ-SF3B1-1-R、ZQ-SF3B1-2-F、ZQ-SF3B1-2-R、ZQ-JAK2-1-F、ZQ-JAK2-1-R、ZQ-CDH1-1-F、ZQ-CDH1-1-R、ZQ-CDH1-2-F、ZQ-CDH1-2-R、ZQ-CDH1-3-F、ZQ-CDH1-3-R、ZQ-CDH1-4-F、ZQ-SMAD4-1-F、ZQ-SMAD4-1-R、ZQ-GATA3-1-F、ZQ-GATA3-1-R、ZQ-MAP2K4-1-F、ZQ-MAP2K4-1-R、ZQ-MAP2K4-2-F、ZQ-MAP2K4-2-R、ZQ-MAP3K1-1-F、ZQ-MAP3K1-1-R、ZQ-MAP3K1-2-F、ZQ-MAP3K1-2-R、ZQ-MAP3K1-3-F、ZQ-MAP3K1-3-R、ZQ-MAP3K1-4-F、ZQ-MAP3K1-4-R、ZQ-ESR1-1-F、ZQ-ESR1-1-R、ZQ-ESR1-2-F和ZQ-ESR1-2-R。
作为本发明的另一种优选方案:KRAS基因引物名称:ZQ-KRAS-1-F,序列信息
TTTTCATGTACTGGTCCCTCATTG;ZQ-KRAS-1-R,序列信息
TTTTGTAATAATCCAGACTGTGTTTCTCC;ZQ-KRAS-2-F,序列信息
TTTTGTTATGATTTTGCAGAAAACAGAT;ZQ-KRAS-2-R,序列信息
TTTTGCCTTCTAGAACAGTAGACACAAAA;ZQ-KRAS-3-F,序列信息
TTTTTACCTCTATTGTTGGATCATATTCGT;ZQ-KRAS-3-R,序列信息
TTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG;
JAK3基因引物名称:ZQ-JAK3-1-F,序列信息TTTTCCCAGACTGGATGTCAGTCT;ZQ-JAK3-1-R,序列信息TTTTCCACGGTCTGGGAAGTGTT;ZQ-JAK3-2-F,序列信息
TTTTGAGATGCCGGTACGACACTT;ZQ-JAK3-2-R,序列信息
TTTTGCAGGTCTGTGAGCACAAAATTT;ZQ-JAK3-3-F,序列信息
TTTTCAAAGAGGTGCTCCAGGACTG;ZQ-JAK3-3-R,序列信息
TTTTCTTTCATCCCAGGGTTCTCTCC;
AKT1基因引物名称:ZQ-AKT1-1-F,序列信息TTTTCCGCTCCTTGTAGCCAATGA;ZQ-AKT1-1-R,序列信息TTTTGGGTCTGACGGGTAGAGTGT;
CREBBP基因引物名称:ZQ-CREBBP-1-F,序列信息
TTTTAATGTGCAGTCCAGGAAACAGAA;ZQ-CREBBP-1-R,序列信息
TTTTACAGTCTCATCATACCACTATTATTT;
PTEN基因引物名称:ZQ-PTEN-1-F,序列信息
TTTTGTTTTTGACAGTTTGACAGTTAAAG;ZQ-PTEN-1-R,序列信息
TTTTTTCCCGTCGTGTGGGTCCT;ZQ-PTEN-2-F,序列信息
TTTTTCAAATGTTAGCTCATTTTTGTTAATGG;ZQ-PTEN-2-R,序列信息
TTTTTGCAAGCATACAAATAAGAAAACATACTT;ZQ-PTEN-3-F,序列信息
TTTTACAGCTAGAACTTATCAAACCCTTTTGT;ZQ-PTEN-3-R,序列信息
TTTTCCCGATGTAATAAATATGCACATATCATT;ZQ-PTEN-4-F,序列信息
TTTTTAGAGCGTGCAGATAATGACAAGG;ZQ-PTEN-4-R,序列信息
TTTTCCCACAAAATGTTTAATTTAACTGACC;ZQ-PTEN-5-F,序列信息
TTTTTCTGTCCACCAGGGAGTA;ZQ-PTEN-5-R,序列信息
TTTTACATTGGAATAGTTTCAAACATCATCTT;ZQ-PTEN-6-F,序列信息
TTTTGACGGGAAGACAAGTTCATGTACT;ZQ-PTEN-6-R,序列信息
TTTTTTCTCCCAATGAAAGTAAAGTACAAACCTT;ZQ-PTEN-7-F,序列信息
TTTTTTAGGACAAAATGTTTCACTTTTGGG;ZQ-PTEN-7-R,序列信息
TTTTACGCTCTATACTGCAAATGCTATCG;
RB1基因引物名称:ZQ-RB1-1-F,序列信息
TTTTTCTGTGTGCTGAGAGATGTAATGAC;ZQ-RB1-1-R,序列信息
TTTTTGATCCAAAAATAATCTTGCATCTAGATC;
TP53基因引物名称:ZQ-TP53-1-F,序列信息TTTTTCATAGGGCACCACCACACTAT;ZQ-TP53-1-R,序列信息TTTTGGCCTCTGATTCCTCACTGATTG;ZQ-TP53-2-F,序列信息
TTTTCCATAGGTCTGAAAATGTTTCCTGACT;ZQ-TP53-2-R,序列信息
TTTTGTTGGAAGTGTCTCATGCTGGAT;ZQ-TP53-3-F,序列信息
TTTTGTAGCTGCCCTGGTAGGTTT;ZQ-TP53-3-R,序列信息
TTTTGAAGCTCCCAGAATGCCAGA;ZQ-TP53-4-F,序列信息
TTTTTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTG;ZQ-TP53-4-R,序列信息
TTTTTACTGGGACGGAACAGCTTTG;ZQ-TP53-5-F,序列信息
TTTTCAGCTGCTCACCATCGCTAT;ZQ-TP53-5-R,序列信息
TTTTAGCTGTGGGTTGATTCCACA;ZQ-TP53-6-F,序列信息
TTTTCTGCCATCTCTCTCCTCCTTTTTC;ZQ-TP53-6-R,序列信息
TTTTCCGCAGAAATGGATACAGGTCAA;ZQ-TP53-7-F,序列信息
TTTTGCCTGGGCATCCTTGAGTTC;ZQ-TP53-7-R,序列信息
TTTTCTTGAACCATCTTTTAACTCAGGTAC;ZQ-TP53-8-F,序列信息
TTTTCCTGACCTGGAGTCTTCCAGT;ZQ-TP53-8-R,序列信息
TTTTTCTTGGGCCTGTGTTATCTCCTA;
CTNNB1基因引物名称:ZQ-CTNNB1-1-F,序列信息
TTTTATGGCCATGGAACCAGACAGAA;ZQ-CTNNB1-1-R,序列信息
TTTTTCCACATCCTCTTCCTCAGGATT;
TSC2基因引物名称:ZQ-TSC2-1-F,序列信息
TTTTGGTGGTTTGTGACTTGCAGTTAAG;ZQ-TSC2-1-R,序列信息
TTTTGCGACTTCACAAATCTGCCCTAT;
TSC1基因引物名称:ZQ-TSC1-1-F,序列信息TTTTACCACCTCTGCTTCCACTACT;ZQ-TSC1-1-R,序列信息TTTCTTACAGGCTTGACTGTTGTAATG;ZQ-TSC1-2-F,序列信息TTTTTGGCATAATTAGGCTTCTCAAAGTG;ZQ-TSC1-2-R,序列信息TTTTCGGATGACTACGTGCACATTTC;
ERBB2基因引物名称:ZQ-ERBB2-1-F,序列信息TTTTCTCCCATACCCTCTCAGCGTA;ZQ-ERBB2-1-R,序列信息TTTTAGCCATAGGGCATAAGCTGTG;ZQ-ERBB2-2-F,序列信息TTTTCAGAAGGTCTACATGGGTGCTT;ZQ-ERBB2-2-R,序列信息
TTTTGCCAGCCCGAAGTCTGTAATTTT;ZQ-ERBB2-3-F,序列信息
TTTTGGGCATCTGGATCCCTGATG;ZQ-ERBB2-3-R,序列信息
TTTTTTCCTGTCCTCCTAGCAGGAG;ZQ-ERBB2-4-F,序列信息
TTTTACGGTAATGCTGCTCATGGT;ZQ-ERBB2-4-R,序列信息
TTTTTGCTGTCACCTCTTGGTTGTG;ZQ-ERBB2-5-F,序列信息
TTTTCCCATCATGACTTTCTTTCTTGTCC;ZQ-ERBB2-5-R,序列信息
TTTTCAGGTCACCATCAAATACATCGGA;ZQ-ERBB2-6-F,序列信息
TTTTACAACACACAGTTGGAGGACTT;ZQ-ERBB2-6-R,序列信息
TTTTCCCATCACACACCATAACTCCA;ZQ-ERBB2-7-F,序列信息
TTTTGGGCATCTGGATCCCTGATG;ZQ-ERBB2-7-R,序列信息
TTTTTTCCTGTCCTCCTAGCAGGAG;
PIK3CA基因引物名称:ZQ-PIK3CA-1-F,序列信息
TTTTTACAGAGTAACAGACTAGCTAGAGACA;ZQ-PIK3CA-1-R,序列信息
TTTTTAGCACTTACCTGTGACTCCATAGA;ZQ-PIK3CA-2-F,序列信息
TTTTCAATCTTTTGATGACATTGCATACATTC;ZQ-PIK3CA-2-R,序列信息
TTTTGGAAGATCCAATCCATTTTTGTTGTC;ZQ-PIK3CA-3-F,序列信息
TTTTGATGCACAATAAAACAGTTAGCCAGA;ZQ-PIK3CA-3-R,序列信息
TTTTGTTTGAGAATGTCAGTTAAGTTAATGAGC;
SF3B1基因引物名称:ZQ-SF3B1-1-F,序列信息
TTTTTTCAACTAAACTTCTAAGATGTGGCAAG;ZQ-SF3B1-1-R,序列信息
TTTTCTTCTTTATTGCCCTTCTTAAAAGCTGT;ZQ-SF3B1-2-F,序列信息
TTTTACCCTTCCATAAAGGCTTTAACACA;ZQ-SF3B1-2-R,序列信息
TTTTTGTTTGGTTTTGTAGGTCTTGTGGA;
JAK2基因引物名称:ZQ-JAK2-1-F,序列信息
TTTTTTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGCAGCA;ZQ-JAK2-1-R,序列信息
TTTTAGATGCTCTGAGAAAGGCATTAGAAA;
CDH1基因引物名称:ZQ-CDH1-1-F,序列信息
TTTTATTTCTGCCCTGCAGTGAATTTTG;ZQ-CDH1-1-R,序列信息
TTTTGATCTGTGGGTTATGAAACCGTAGA;ZQ-CDH1-2-F,序列信息
TTTTCTAGTGTTCCTGGTCCTGACTTG;ZQ-CDH1-2-R,序列信息
TTTTGTGATCACAGCTGTTGCTGTTG;ZQ-CDH1-3-F,序列信息
TTTTGTGATCACAGTCACTGACACCAA;ZQ-CDH1-3-R,序列信息
TTTTCCATGAGCAGTGGTGACACTTAG;ZQ-CDH1-4-F,序列信息
TTTTAGAACGAGGCTAACGTCGTAATC;ZQ-CDH1-4-R,序列信息
TTTTGTTGTTCACTGGATTTGTGGTGA;
SMAD4基因引物名称:ZQ-SMAD4-1-F,序列信息
TTTTATGGATGTTCAGGTAGGAGAGACA;ZQ-SMAD4-1-R,序列信息
TTTTCTTCTGTCCTGTGGACATTGGA;
GATA3基因引物名称:ZQ-GATA3-1-F,序列信息
TTTTCCCAAGAACAGCTCGTTTAACC;ZQ-GATA3-1-R,序列信息
TTTTGTCCAAAGGACAGGCTGGAT;
MAP2K4基因引物名称:ZQ-MAP2K4-1-F,序列信息
TTTTTCTTCTGGACAGAAGTGGAAATATT;ZQ-MAP2K4-1-R,序列信息
TTTTCAAGCAAGAAGGCCTGGACTTA;ZQ-MAP2K4-2-F,序列信息
TTTTGTCTTTATGTTCCAGCCTGAAAGAATA;ZQ-MAP2K4-2-R,序列信息
TTTTTCTTATTGTTACGCTACTGTGGCAA;
MAP3K1基因引物名称:ZQ-MAP3K1-1-F,序列信息
TTTTCATTGGTATTGGTGGTGTTGATTATGT;ZQ-MAP3K1-1-R,序列信息
TTTTGAGGATAAAATTCAGCAGGAAATTCCAAC;ZQ-MAP3K1-2-F,序列信息TTTTGTTTTAGCCAAGATCCAGGATTGATG;ZQ-MAP3K1-2-R,序列信息
TTTTCCAGCTTTTAGTATTTCTCTGCCAACT;ZQ-MAP3K1-3-F,序列信息
TTTTATGAGGTCTATGCACATGTGTTTCT;ZQ-MAP3K1-3-R,序列信息
TTTTCACATCTCGTAAACCAGGAGACA;ZQ-MAP3K1-4-F,序列信息
TTTTATTAGTATTGTACTGGGCTTTTATCTGT;ZQ-MAP3K1-4-R,序列信息
TTTTTGCAGCTCCAAAATCTGCAATTC;
ESR1基因引物名称:ZQ-ESR1-1-F,序列信息
TTTTGCTATGTTTTCATAGGAACCAGGGAAA;ZQ-ESR1-1-R,序列信息
TTTTGCAAAATAATAGATTTGAGGCACACAAA;ZQ-ESR1-2-F,序列信息
TTTTAAAGGCATGGAGCATCTGTACA;ZQ-ESR1-2-R,序列信息
TTTTTTGGTCCGTCTCCTCCACGG。
作为本发明的又一种优选方案,在步骤(2)中,多重富集PCR的反应体系为:
1×PCR缓冲液
作为本发明的进一步改进方案,该构建方法的试剂盒,包括
一DNA富集反应组件,由第一扩增引物组组成;
一RingCap-Taq酶,由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成;
一管阳性质控品;
和一管阴性质控品。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
1、本发明的构建方法针对多个靶序列进行单管,快速完成文库的构建,整个文库构建过程仅需要2~3小时,手动时间仅仅需要45分钟即可,结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上乳腺癌中在少量的外周血样本基础上需要对体细胞多基因、多靶点检测这一难点,且成本低廉。
2、本发明的构建方法所制备的文库序列可被目前高通量测序系统识别并进行检测,从而实现文库构建进行核酸序列的检测的应用,该核酸检测可应用于目前多种高通量测序平台、基因芯片平台、杂交检测平台,见图1。
3、本发明的构建方法对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的短片段DNA依然适用,基于其的检测方法依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力,见图2、图3。
附图说明
图1为本发明的实施例构建的核酸文库进行高通量测序总数据图;
图2为本发明的实施例检测激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变的检测均一性结果图;
图3为本发明的实施例检测激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变的检测突变结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。
激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法,覆盖人类基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1上的总共1357种体细胞突变。
具体包括如下步骤:
(1)针对目的基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1设计基本扩增引物组,该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2~5个T,且该2~5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰,同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃;所述扩增引物组包括ZQ-KRAS-1-F、ZQ-KRAS-1-R、ZQ-KRAS-2-F、ZQ-KRAS-2-R、ZQ-KRAS-3-F、ZQ-KRAS-3-R、ZQ-JAK3-1-F、ZQ-JAK3-1-R、ZQ-JAK3-2-F、ZQ-JAK3-2-R、ZQ-JAK3-3-F、ZQ-JAK3-3-R、ZQ-AKT1-1-F、ZQ-AKT1-1-R、ZQ-CREBBP-1-F、ZQ-CREBBP-1-R、ZQ-PTEN-1-F、ZQ-PTEN-1-R、ZQ-PTEN-2-F、ZQ-PTEN-2-R、ZQ-PTEN-3-F、ZQ-PTEN-3-R、ZQ-PTEN-4-F、ZQ-PTEN-4-R、ZQ-PTEN-5-F、ZQ-PTEN-5-R、ZQ-PTEN-6-F、ZQ-PTEN-6-R、ZQ-PTEN-7-F、ZQ-PTEN-7-R、ZQ-RB1-1-F、ZQ-RB1-1-R、ZQ-TP53-1-F、ZQ-TP53-1-R、ZQ-TP53-2-F、ZQ-TP53-2-R、ZQ-TP53-3-F、ZQ-TP53-3-R、ZQ-TP53-4-F、ZQ-TP53-4-R、ZQ-TP53-5-F、ZQ-TP53-5-R、ZQ-TP53-6-F、ZQ-TP53-6-R、ZQ-TP53-7-F、ZQ-TP53-7-R、ZQ-TP53-8-F、ZQ-TP53-8-R、ZQ-CTNNB1-1-F、ZQ-CTNNB1-1-R、ZQ-TSC2-1-F、ZQ-TSC2-1-R、ZQ-TSC1-1-F、ZQ-TSC1-1-R、ZQ-TSC1-2-F、ZQ-TSC1-2-R、ZQ-ERBB2-1-F、ZQ-ERBB2-1-R、ZQ-ERBB2-2-F、ZQ-ERBB2-2-R、ZQ-ERBB2-3-F、ZQ-ERBB2-3-R、ZQ-ERBB2-4-F、ZQ-ERBB2-4-R、ZQ-ERBB2-5-F、ZQ-ERBB2-5-R、ZQ-ERBB2-6-F、ZQ-ERBB2-6-R、ZQ-ERBB2-7-F、ZQ-ERBB2-7-R、ZQ-PIK3CA-1-F、ZQ-PIK3CA-1-R、ZQ-PIK3CA-2-F、ZQ-PIK3CA-2-R、ZQ-PIK3CA-3-F、ZQ-PIK3CA-3-R、ZQ-SF3B1-1-F、ZQ-SF3B1-1-R、ZQ-SF3B1-2-F、ZQ-SF3B1-2-R、ZQ-JAK2-1-F、ZQ-JAK2-1-R、ZQ-CDH1-1-F、ZQ-CDH1-1-R、ZQ-CDH1-2-F、ZQ-CDH1-2-R、ZQ-CDH1-3-F、ZQ-CDH1-3-R、ZQ-CDH1-4-F、ZQ-SMAD4-1-F、ZQ-SMAD4-1-R、ZQ-GATA3-1-F、ZQ-GATA3-1-R、ZQ-MAP2K4-1-F、ZQ-MAP2K4-1-R、ZQ-MAP2K4-2-F、ZQ-MAP2K4-2-R、ZQ-MAP3K1-1-F、ZQ-MAP3K1-1-R、ZQ-MAP3K1-2-F、ZQ-MAP3K1-2-R、ZQ-MAP3K1-3-F、ZQ-MAP3K1-3-R、ZQ-MAP3K1-4-F、ZQ-MAP3K1-4-R、ZQ-ESR1-1-F、ZQ-ESR1-1-R、ZQ-ESR1-2-F和ZQ-ESR1-2-R,其序列依次如SEQ ID 01~SEQ ID 110所示;
(2)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增,纯化后得扩增产物;将扩增产物、多对第一不对称连接探针、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR,纯化后获得文库产物;
(3)将文库产物组成所述用于高通量测序的乳腺癌复发监测基因突变文库;
(4)通过Ion torrent PGM高通量测序仪进行文库上机检测,获得目标序列信息,通过VC软件进行数据信息比对分析,得到样本突变状态。
上述模板所来自的样品适用范围包括血浆标本。
血浆样品,使用Qiagen公司血浆DNA提取试剂盒提取基因组DNA,具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取血浆不少于1000μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L,pH 8.0),经紫外分光光度计检测提取质量,并确定浓度,用Tris-HCl溶液(10mmol/L,pH 8.0)调整DNA浓度到2ng/μl作为PCR扩增的模板。
基于上述构建方法的试剂盒包括:
一DNA富集反应组件,由扩增引物组组成,每人份的DNA富集反应组件的配方如下表所示:
一RingCap-Taq酶,由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成,比例为0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2,优选比例1:1:1;
一阴性质控品,具体为无核酸水;
和一阳性质控品,具体由20个阳性突变质粒序列野生型基因组DNA混合而成,浓度为2ng/μL。
将上述试剂盒用前述的构建方法进行实验,以Kras基因热点突变外显子2上的G12D突变为例来分析本发明的检测激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变的方法。实验用细胞系4株,分别为KRAS基因G12D突变质粒;50份健康的全血样品、50份临床乳腺癌样品(全血):
所述PCR反应体系的模板量(待测样品、阳性质控品和阴性质控品)为5uL,其余组分如下表所示:
PCR扩增程序设置如下表:
上述PCR反应体系所得的扩增产物的纯化具体如下:
取出Agencourt AMPure XP试剂置于室温,同时要打散磁珠,同时配制新鲜的70%的乙醇(230μL无水乙醇+100μL无核酸酶水),必须是新鲜配制的。
第一轮纯化步骤
(1)向每个样品反应管25μL产物中分别加入12.5μL(0.5x样本体积)的AgencourtAMPure XP试剂,上下吸取吹打5次,完全混匀重悬DNA;
(2)室温孵育5分钟;
(3)放置在磁力架上面,孵育5分钟,一直到溶液澄清;
(4)小心地吸取上清液置于新的离心管,不要扰动磁珠;注意:上清液中含有扩增产物不要丢弃。
第二轮纯化步骤
(1)向上述吸取的上清液25μL中加入30μL(1.2x样本体积)的Agencourt AMPureXP试剂,上下吸取吹打5次,完全混匀重悬DNA;
(2)室温孵育5分钟;
(3)放置在磁力架上面,孵育3分钟,一直到溶液澄清,小心地吸走并弃掉上清,不要扰动磁珠;注意:磁珠上含有扩增文库不要丢弃。
(4)加入150μl新鲜配制的70%乙醇,没过磁珠样品即可,离心管正反方向移动5次,然后磁力架上孵育2分钟,去除上清液;
(5)重复上述步骤4,进行第二次洗涤;
(6)确保乙醇液滴已全部从孔中吸走,将板放置于磁力架上,室温空气干燥5分钟,注意不要过度干燥。
(7)将样品管从磁力架上拿开,在每孔中加入25μL TE(PH8.0)缓冲液充分浸润磁珠。充分振荡混匀,快速离心将液体收集到管底。(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀);注意:上清液含有扩增文库不要丢弃。
将样品管置于磁力架上2分钟。上清液中含有扩增产物。取出20μL上清。
上述纯化所得的扩增产物制备文库产物的PCR反应的模板量为5uL,其余组分如下表所示:
PCR扩增程序设置如下表:
PCR产物分别按纯化扩增产物方法进行纯化,制得文库产物。
上述文库产物的检测具体如下:
采用Ion torrent PGM半导体测序仪(Thermofisher公司)一次可以检测16份样品(包括阴阳性对照)。
前述50份全血样品以及阳性质粒经本发明的体系检测,只有阳性质粒有检测到突变序列,其他样品无突变序列,进一步证明了该方法的特异性,具体结果如图1至图3所示。
灵敏度分析:将突变型质粒从100ng/μL连续10倍梯度稀释,分别为100ng/μL,10ng/μL,1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL。每次反应加入5μL DNA。结果表明本发明的文库构建方法的灵敏度高,50拷贝DNA基因组即可检出。
选择性能力分析:固定每次PCR反应总DNA用量,100ng/反应和10ng/反应。先将突变质粒的DNA和野生型细胞系DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。按下述方法配置模拟DNA模板。
A:50%即为100ng/μL突变细胞DNA。
B:30%取A液60μL后混入40μL 100ng/μL细胞DNA,震荡混均。
C:20%取A液40μL后混入60μL 100ng/μL细胞DNA,震荡混均。
D:15%取B液50μL后混入50μL 100ng/μL细胞DNA,震荡混均。
E:10%取C液50μL后混入50μL 100ng/μL细胞DNA,震荡混均。
F:5%取E液50μL后混入50μL 100ng/μL细胞DNA,震荡混均。
G:1%取F液20μL后混入80μL 100ng/μL细胞DNA,震荡混均。
H:0.5%取G液50μL后混入50μL 100ng/μL细胞DNA,震荡混均。
I:0.1%取H液20μL后混入80μL 100ng/μL细胞DNA,震荡混均。
J:0.01%取H液2μL后混入80μL 100ng/μL细胞DNA,震荡混均。
结果表明本发明的乳腺癌复发监测基因突变方法的在平均测序深度达到20000层时选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA,检测能力为0.1%。
重复性试验:每个反应分别加入突变细胞系DNA10ng、1ng和100pg,重复10次进行高通量测序检测,10次结果一致,符合率100%。
收集激素受体阳性乳腺癌血浆标本共50例。其中男性28例,女性22例。年龄为36-71岁,平均年龄为55岁。对于乳腺癌基因,本发明检测结果与DNA测序结果相对照,DNA测序结果阳性的,本发明均能检出,另有3例本发明检测结果阳性的,并且突变率为1~5%的,DNA测序未能检出,因此本发明检测方法与DNA测序法比较具有更高的灵敏度。
以上可知本发明肿瘤多基因文库构建反应就可以同时检测乳腺癌复发监测基因1357个突变位点,文库构建时间仅需3小时,因此本发明省时省力,准确性高,可满足突变的快速诊断。而且,高通量测序法灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法,10ng样品DNA中含0.1%的突变DNA即可检出。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法,其特征在于,覆盖人类基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1上的总共1357种体细胞突变,具体包括如下步骤:
(1)针对目的基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1设计基本扩增引物组,该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2~5个T,且该2~5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰,同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃;
(2)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增,纯化后得扩增产物;将扩增产物、多对第一不对称连接探针、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR,纯化后获得文库产物;
(3)将文库产物组成所述用于高通量测序的肿瘤基因变异文库;
上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。
2.根据权利要求1所述的激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法,其特征在于:所述第一扩增引物组包括ZQ-KRAS-1-F、ZQ-KRAS-1-R、ZQ-KRAS-2-F、ZQ-KRAS-2-R、ZQ-KRAS-3-F、ZQ-KRAS-3-R、ZQ-JAK3-1-F、ZQ-JAK3-1-R、ZQ-JAK3-2-F、ZQ-JAK3-2-R、ZQ-JAK3-3-F、ZQ-JAK3-3-R、ZQ-AKT1-1-F、ZQ-AKT1-1-R、ZQ-CREBBP-1-F、ZQ-CREBBP-1-R、ZQ-PTEN-1-F、ZQ-PTEN-1-R、ZQ-PTEN-2-F、ZQ-PTEN-2-R、ZQ-PTEN-3-F、ZQ-PTEN-3-R、ZQ-PTEN-4-F、ZQ-PTEN-4-R、ZQ-PTEN-5-F、ZQ-PTEN-5-R、ZQ-PTEN-6-F、ZQ-PTEN-6-R、ZQ-PTEN-7-F、ZQ-PTEN-7-R、ZQ-RB1-1-F、ZQ-RB1-1-R、ZQ-TP53-1-F、ZQ-TP53-1-R、ZQ-TP53-2-F、ZQ-TP53-2-R、ZQ-TP53-3-F、ZQ-TP53-3-R、ZQ-TP53-4-F、ZQ-TP53-4-R、ZQ-TP53-5-F、ZQ-TP53-5-R、ZQ-TP53-6-F、ZQ-TP53-6-R、ZQ-TP53-7-F、ZQ-TP53-7-R、ZQ-TP53-8-F、ZQ-TP53-8-R、ZQ-CTNNB1-1-F、ZQ-CTNNB1-1-R、ZQ-TSC2-1-F、ZQ-TSC2-1-R、ZQ-TSC1-1-F、ZQ-TSC1-1-R、ZQ-TSC1-2-F、ZQ-TSC1-2-R、ZQ-ERBB2-1-F、ZQ-ERBB2-1-R、ZQ-ERBB2-2-F、ZQ-ERBB2-2-R、ZQ-ERBB2-3-F、ZQ-ERBB2-3-R、ZQ-ERBB2-4-F、ZQ-ERBB2-4-R、ZQ-ERBB2-5-F、ZQ-ERBB2-5-R、ZQ-ERBB2-6-F、ZQ-ERBB2-6-R、ZQ-ERBB2-7-F、ZQ-ERBB2-7-R、ZQ-PIK3CA-1-F、ZQ-PIK3CA-1-R、ZQ-PIK3CA-2-F、ZQ-PIK3CA-2-R、ZQ-PIK3CA-3-F、ZQ-PIK3CA-3-R、ZQ-SF3B1-1-F、ZQ-SF3B1-1-R、ZQ-SF3B1-2-F、ZQ-SF3B1-2-R、ZQ-JAK2-1-F、ZQ-JAK2-1-R、ZQ-CDH1-1-F、ZQ-CDH1-1-R、ZQ-CDH1-2-F、ZQ-CDH1-2-R、ZQ-CDH1-3-F、ZQ-CDH1-3-R、ZQ-CDH1-4-F、ZQ-SMAD4-1-F、ZQ-SMAD4-1-R、ZQ-GATA3-1-F、ZQ-GATA3-1-R、ZQ-MAP2K4-1-F、ZQ-MAP2K4-1-R、ZQ-MAP2K4-2-F、ZQ-MAP2K4-2-R、ZQ-MAP3K1-1-F、ZQ-MAP3K1-1-R、ZQ-MAP3K1-2-F、ZQ-MAP3K1-2-R、ZQ-MAP3K1-3-F、ZQ-MAP3K1-3-R、ZQ-MAP3K1-4-F、ZQ-MAP3K1-4-R、ZQ-ESR1-1-F、ZQ-ESR1-1-R、ZQ-ESR1-2-F和ZQ-ESR1-2-R。
3.根据权利要求2所述激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法,其特征在于:KRAS基因引物名称:ZQ-KRAS-1-F,序列信息TTTTCATGTACTGGTCCCTCATTG;ZQ-KRAS-1-R,序列信息TTTTGTAATAATCCAGACTGTGTTTCTCC;ZQ-KRAS-2-F,序列信息TTTTGTTATGATTTTGCAGAAAACAGAT;ZQ-KRAS-2-R,序列信息TTTTGCCTTCTAGAACAGTAGACACAAAA;ZQ-KRAS-3-F,序列信息TTTTTACCTCTATTGTTGGATCATATTCGT;ZQ-KRAS-3-R,序列信息TTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG;
JAK3基因引物名称:ZQ-JAK3-1-F,序列信息TTTTCCCAGACTGGATGTCAGTCT;ZQ-JAK3-1-R,序列信息TTTTCCACGGTCTGGGAAGTGTT;ZQ-JAK3-2-F,序列信息TTTTGAGATGCCGGTACGACACTT;ZQ-JAK3-2-R,序列信息TTTTGCAGGTCTGTGAGCACAAAATTT;ZQ-JAK3-3-F,序列信息TTTTCAAAGAGGTGCTCCAGGACTG;ZQ-JAK3-3-R,序列信息TTTTCTTTCATCCCAGGGTTCTCTCC;
AKT1基因引物名称:ZQ-AKT1-1-F,序列信息TTTTCCGCTCCTTGTAGCCAATGA;ZQ-AKT1-1-R,序列信息TTTTGGGTCTGACGGGTAGAGTGT;
CREBBP基因引物名称:ZQ-CREBBP-1-F,序列信息TTTTAATGTGCAGTCCAGGAAACAGAA;ZQ-CREBBP-1-R,序列信息TTTTACAGTCTCATCATACCACTATTATTT;
PTEN基因引物名称:ZQ-PTEN-1-F,序列信息TTTTGTTTTTGACAGTTTGACAGTTAAAG;ZQ-PTEN-1-R,序列信息TTTTTTCCCGTCGTGTGGGTCCT;ZQ-PTEN-2-F,序列信息TTTTTCAAATGTTAGCTCATTTTTGTTAATGG;ZQ-PTEN-2-R,序列信息TTTTTGCAAGCATACAAATAAGAAAACATACTT;ZQ-PTEN-3-F,序列信息TTTTACAGCTAGAACTTATCAAACCCTTTTGT;ZQ-PTEN-3-R,序列信息TTTTCCCGATGTAATAAATATGCACATATCATT;ZQ-PTEN-4-F,序列信息TTTTTAGAGCGTGCAGATAATGACAAGG;ZQ-PTEN-4-R,序列信息TTTTCCCACAAAATGTTTAATTTAACTGACC;ZQ-PTEN-5-F,序列信息TTTTTCTGTCCACCAGGGAGTA;ZQ-PTEN-5-R,序列信息TTTTACATTGGAATAGTTTCAAACATCATCTT;ZQ-PTEN-6-F,序列信息TTTTGACGGGAAGACAAGTTCATGTACT;ZQ-PTEN-6-R,序列信息TTTTTTCTCCCAATGAAAGTAAAGTACAAACCTT;ZQ-PTEN-7-F,序列信息TTTTTTAGGACAAAATGTTTCACTTTTGGG;ZQ-PTEN-7-R,序列信息TTTTACGCTCTATACTGCAAATGCTATCG;
RB1基因引物名称:ZQ-RB1-1-F,序列信息TTTTTCTGTGTGCTGAGAGATGTAATGAC;ZQ-RB1-1-R,序列信息TTTTTGATCCAAAAATAATCTTGCATCTAGATC;
TP53基因引物名称:ZQ-TP53-1-F,序列信息TTTTTCATAGGGCACCACCACACTAT;ZQ-TP53-1-R,序列信息TTTTGGCCTCTGATTCCTCACTGATTG;ZQ-TP53-2-F,序列信息TTTTCCATAGGTCTGAAAATGTTTCCTGACT;ZQ-TP53-2-R,序列信息TTTTGTTGGAAGTGTCTCATGCTGGAT;ZQ-TP53-3-F,序列信息TTTTGTAGCTGCCCTGGTAGGTTT;ZQ-TP53-3-R,序列信息TTTTGAAGCTCCCAGAATGCCAGA;ZQ-TP53-4-F,序列信息TTTTTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTG;ZQ-TP53-4-R,序列信息TTTTTACTGGGACGGAACAGCTTTG;ZQ-TP53-5-F,序列信息TTTTCAGCTGCTCACCATCGCTAT;ZQ-TP53-5-R,序列信息TTTTAGCTGTGGGTTGATTCCACA;ZQ-TP53-6-F,序列信息TTTTCTGCCATCTCTCTCCTCCTTTTTC;ZQ-TP53-6-R,序列信息TTTTCCGCAGAAATGGATACAGGTCAA;ZQ-TP53-7-F,序列信息TTTTGCCTGGGCATCCTTGAGTTC;ZQ-TP53-7-R,序列信息TTTTCTTGAACCATCTTTTAACTCAGGTAC;ZQ-TP53-8-F,序列信息TTTTCCTGACCTGGAGTCTTCCAGT;ZQ-TP53-8-R,序列信息TTTTTCTTGGGCCTGTGTTATCTCCTA;
CTNNB1基因引物名称:ZQ-CTNNB1-1-F,序列信息TTTTATGGCCATGGAACCAGACAGAA;ZQ-CTNNB1-1-R,序列信息TTTTTCCACATCCTCTTCCTCAGGATT;
TSC2基因引物名称:ZQ-TSC2-1-F,序列信息TTTTGGTGGTTTGTGACTTGCAGTTAAG;ZQ-TSC2-1-R,序列信息TTTTGCGACTTCACAAATCTGCCCTAT;
TSC1基因引物名称:ZQ-TSC1-1-F,序列信息TTTTACCACCTCTGCTTCCACTACT;ZQ-TSC1-1-R,序列信息TTTCTTACAGGCTTGACTGTTGTAATG;ZQ-TSC1-2-F,序列信息TTTTTGGCATAATTAGGCTTCTCAAAGTG;ZQ-TSC1-2-R,序列信息TTTTCGGATGACTACGTGCACATTTC;
ERBB2基因引物名称:ZQ-ERBB2-1-F,序列信息TTTTCTCCCATACCCTCTCAGCGTA;ZQ-ERBB2-1-R,序列信息TTTTAGCCATAGGGCATAAGCTGTG;ZQ-ERBB2-2-F,序列信息TTTTCAGAAGGTCTACATGGGTGCTT;ZQ-ERBB2-2-R,序列信息TTTTGCCAGCCCGAAGTCTGTAATTTT;ZQ-ERBB2-3-F,序列信息TTTTGGGCATCTGGATCCCTGATG;ZQ-ERBB2-3-R,序列信息TTTTTTCCTGTCCTCCTAGCAGGAG;ZQ-ERBB2-4-F,序列信息TTTTACGGTAATGCTGCTCATGGT;ZQ-ERBB2-4-R,序列信息TTTTTGCTGTCACCTCTTGGTTGTG;ZQ-ERBB2-5-F,序列信息TTTTCCCATCATGACTTTCTTTCTTGTCC;ZQ-ERBB2-5-R,序列信息TTTTCAGGTCACCATCAAATACATCGGA;ZQ-ERBB2-6-F,序列信息TTTTACAACACACAGTTGGAGGACTT;ZQ-ERBB2-6-R,序列信息TTTTCCCATCACACACCATAACTCCA;ZQ-ERBB2-7-F,序列信息TTTTGGGCATCTGGATCCCTGATG;ZQ-ERBB2-7-R,序列信息TTTTTTCCTGTCCTCCTAGCAGGAG;
PIK3CA基因引物名称:ZQ-PIK3CA-1-F,序列信息TTTTTACAGAGTAACAGACTAGCTAGAGACA;ZQ-PIK3CA-1-R,序列信息TTTTTAGCACTTACCTGTGACTCCATAGA;ZQ-PIK3CA-2-F,序列信息TTTTCAATCTTTTGATGACATTGCATACATTC;ZQ-PIK3CA-2-R,序列信息TTTTGGAAGATCCAATCCATTTTTGTTGTC;ZQ-PIK3CA-3-F,序列信息TTTTGATGCACAATAAAACAGTTAGCCAGA;ZQ-PIK3CA-3-R,序列信息TTTTGTTTGAGAATGTCAGTTAAGTTAATGAGC;
SF3B1基因引物名称:ZQ-SF3B1-1-F,序列信息TTTTTTCAACTAAACTTCTAAGATGTGGCAAG;ZQ-SF3B1-1-R,序列信息TTTTCTTCTTTATTGCCCTTCTTAAAAGCTGT;ZQ-SF3B1-2-F,序列信息TTTTACCCTTCCATAAAGGCTTTAACACA;ZQ-SF3B1-2-R,序列信息TTTTTGTTTGGTTTTGTAGGTCTTGTGGA;
JAK2基因引物名称:ZQ-JAK2-1-F,序列信息TTTTTTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGCAGCA;ZQ-JAK2-1-R,序列信息TTTTAGATGCTCTGAGAAAGGCATTAGAAA;
CDH1基因引物名称:ZQ-CDH1-1-F,序列信息TTTTATTTCTGCCCTGCAGTGAATTTTG;ZQ-CDH1-1-R,序列信息TTTTGATCTGTGGGTTATGAAACCGTAGA;ZQ-CDH1-2-F,序列信息TTTTCTAGTGTTCCTGGTCCTGACTTG;ZQ-CDH1-2-R,序列信息TTTTGTGATCACAGCTGTTGCTGTTG;ZQ-CDH1-3-F,序列信息TTTTGTGATCACAGTCACTGACACCAA;ZQ-CDH1-3-R,序列信息TTTTCCATGAGCAGTGGTGACACTTAG;ZQ-CDH1-4-F,序列信息TTTTAGAACGAGGCTAACGTCGTAATC;ZQ-CDH1-4-R,序列信息TTTTGTTGTTCACTGGATTTGTGGTGA;
SMAD4基因引物名称:ZQ-SMAD4-1-F,序列信息TTTTATGGATGTTCAGGTAGGAGAGACA;ZQ-SMAD4-1-R,序列信息TTTTCTTCTGTCCTGTGGACATTGGA;
GATA3基因引物名称:ZQ-GATA3-1-F,序列信息TTTTCCCAAGAACAGCTCGTTTAACC;ZQ-GATA3-1-R,序列信息TTTTGTCCAAAGGACAGGCTGGAT;
MAP2K4基因引物名称:ZQ-MAP2K4-1-F,序列信息TTTTTCTTCTGGACAGAAGTGGAAATATT;ZQ-MAP2K4-1-R,序列信息TTTTCAAGCAAGAAGGCCTGGACTTA;ZQ-MAP2K4-2-F,序列信息TTTTGTCTTTATGTTCCAGCCTGAAAGAATA;ZQ-MAP2K4-2-R,序列信息TTTTTCTTATTGTTACGCTACTGTGGCAA;
MAP3K1基因引物名称:ZQ-MAP3K1-1-F,序列信息TTTTCATTGGTATTGGTGGTGTTGATTATGT;ZQ-MAP3K1-1-R,序列信息TTTTGAGGATAAAATTCAGCAGGAAATTCCAAC;ZQ-MAP3K1-2-F,序列信息TTTTGTTTTAGCCAAGATCCAGGATTGATG;ZQ-MAP3K1-2-R,序列信息TTTTCCAGCTTTTAGTATTTCTCTGCCAACT;ZQ-MAP3K1-3-F,序列信息TTTTATGAGGTCTATGCACATGTGTTTCT;ZQ-MAP3K1-3-R,序列信息TTTTCACATCTCGTAAACCAGGAGACA;ZQ-MAP3K1-4-F,序列信息TTTTATTAGTATTGTACTGGGCTTTTATCTGT;ZQ-MAP3K1-4-R,序列信息TTTTTGCAGCTCCAAAATCTGCAATTC;
ESR1基因引物名称:ZQ-ESR1-1-F,序列信息TTTTGCTATGTTTTCATAGGAACCAGGGAAA;ZQ-ESR1-1-R,序列信息TTTTGCAAAATAATAGATTTGAGGCACACAAA;ZQ-ESR1-2-F,序列信息TTTTAAAGGCATGGAGCATCTGTACA;ZQ-ESR1-2-R,序列信息TTTTTTGGTCCGTCTCCTCCACGG。
4.根据权利要求1所述激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法,其特征在于:在步骤(2)中,多重富集PCR的反应体系为:
1×PCR缓冲液
5.根据权利要求1至4中任一项权利要求所述激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法,其特征在于:该构建方法的试剂盒,包括
一DNA富集反应组件,由基本扩增引物组组成;
一RingCap-Taq酶,由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成;
一管阳性质控品;
和一管阴性质控品。
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