CN110747269A - 用于pcos诊断的颗粒细胞生物标志物及其筛选方法和诊断试剂盒 - Google Patents

用于pcos诊断的颗粒细胞生物标志物及其筛选方法和诊断试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN110747269A
CN110747269A CN201911023570.1A CN201911023570A CN110747269A CN 110747269 A CN110747269 A CN 110747269A CN 201911023570 A CN201911023570 A CN 201911023570A CN 110747269 A CN110747269 A CN 110747269A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
gene
air
pcos
follows
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911023570.1A
Other languages
English (en)
Inventor
康亚妮
毛湛睿
赵晖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN201911023570.1A priority Critical patent/CN110747269A/zh
Publication of CN110747269A publication Critical patent/CN110747269A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于PCOS诊断的颗粒细胞生物标志物及其筛选方法和诊断试剂盒，采用RNA‑seq、miRNA‑seq与MBD‑seq技术联合分析的方法，在全基因组范围内筛选PCOS相关生物标志物，并发现了新的诊断标志物。标志物包括miR‑429，miR‑141‑3p，和miR‑126‑3p；和/或，XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因。与现有技术相比，本发明具有检测灵敏性和精确度高等优点。

Description

用于PCOS诊断的颗粒细胞生物标志物及其筛选方法和诊断试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种用于PCOS诊断的颗粒细胞生物标志物及其筛选方法和诊断试剂盒。
背景技术
多囊卵巢综合症(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种育龄妇女常见的内分泌、代谢紊乱疾病。该疾病最常见的临床表现是女性出现高雄激素血症，导致月经紊乱、稀少、闭经或不规则阴道出血、不孕、肥胖、多毛、子宫内膜过度增生及恶性变化、以及双侧或单侧卵巢呈多囊性改变并多伴有肥胖表型；在糖脂内分泌代谢方面出现胰岛素抵抗，继而引发糖尿病等并发症，远期并发症还包括心血管疾病和子宫内膜癌等。根据鹿特丹ESHRE/ASRM(2003)标准，我国PCOS患病率在5.6％左右。PCOS的临床表现存在异质性，在基础研究方面该病的相关机制研究一直是热点和难点。目前普遍认为PCOS是由环境因素及遗传因素等共同导致的一种涉及多的组织、器官、系统代谢综合征。
目前的研究表明，年龄、环境/生活方式、疾病状态等多种因素的影响可以通过表观遗传修饰改变多囊卵巢综合征的临床表现。DNA甲基化和microRNAs(miRNAs)是基因表达调控中两种主要的表观遗传修饰。miRNAs是一种转录后负调控基因表达的非编码小RNA，通过调控靶基因的转录表达广泛参与机体生长、发育和疾病发生等各种生命过程。同时，异常的DNA甲基化表现在全局基因组的稳定性保存和局部基因启动子的改变上，影响致病基因的转录水平。研究表明，与正常人相比，PCOS患者的卵泡、卵巢颗粒细胞及脂肪组织等中存在明显的全基因组DNA甲基化和miRNA表达的模式变化。
虽然在PCOS中miRNA和DNA甲基化的表观遗传调控作用都分别得到了广泛的研究，但miRNA与DNA甲基化的相互作用机制仍未被发现。DNA甲基化通过超/低甲基化miRNA启动子区域来调控miRNA的转录。同时，miRNA可以通过直接靶向DNA甲基转移酶和甲基化相关的关键蛋白来调控全基因组的DNA甲基化模式。
目前关于PCOS的分子诊断标志物有代谢产物、卵泡数目、SNP标记等。公告号为CN104411824B的已授权专利公开了一种由至少15个SNP标记组成的，用于预测PCOS风险的探针组。公告号为CN106442764A的已授权专利公开了一组由环磷酸鸟苷、硫酸脱氢表雄酮、棕榈鞘磷脂联合高密度脂蛋白胆固醇和左卵泡数目组成的联合标志物，作为PCOS的诊断、分型标志物的制备和应用。
但是上述两件专利公开的技术存在以下主要缺点：传统的多囊卵巢综合征诊断主要依靠临床表现、雄激素水平检测和卵巢B超检测。根据鹿特丹ESHRE/ASRM(2003)标准，须满足下述三项中的两项：月经稀发；临床或者生化雄激素过多症；双侧或单侧卵巢多囊样改变和/或体积增大。但上述技术不易检测到症状不明显的多囊卵巢综合征患者，灵敏度和精准性较低。随着生物技术的发展，生物标志物为PCOS的诊断提供了一种新的途径。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种灵敏度和精准性高的用于PCOS诊断的颗粒细胞生物标志物及其筛选方法和诊断试剂盒。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供了一种用于PCOS诊断的颗粒细胞生物标志物，其特征在于，包括miR-429，miR-141-3p，和miR-126-3p；和/或，XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因。
本发明还提供了一种miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p一起作为用于PCOS诊断的生物标志物的应用。
本发明还提供了一种XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因一起作为用于PCOS诊断的生物标志物的应用。
本发明还提供了一种检测miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p的产品在制备诊断PCOS的试剂盒或芯片上的应用。
进一步地，所述产品为能够检测miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p的引物，
miR-429的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACGGTT-3’，
miR-429的正向引物为：5’-GGGTAATACTGTCTGGTAA-3’，
miR-429的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，
miR-141-3p的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCCATCT-3’，
miR-141-3p的正向引物为：5’-GGGTAACACTGTCTGGTAA-3’，
miR-141-3p的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；
miR-126-3p的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCATT-3’
miR-126-3p的正向引物为：5’-GGGTCGTACCGTGAGTAAT-3’，
miR-126-3p的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。
本发明还提供了一种检测XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因的产品在制备诊断PCOS的试剂盒或芯片上的应用。
进一步地，所述产品为能够检测XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因的引物，
XIAP基因的正向引物为：5’-CAGAGCGGAGTTGGCATTTC-3’，
XIAP基因的反向引物为：5’-TTGTCCACCTTTTCGCGCC-3’，
BRD3基因的正向引物为：5’-ACCACTTCCCGAGCTTATGTG-3’，
BRD3基因的反向引物为：5’-TGCATCTCTGCGACTGTGTG-3’；
MAPK14基因的正向引物为：5’-TTATGCGTCTGACAGGAACACC-3’，
MAPK14基因的反向引物为：5’-TTATGCGTCTGACAGGAACACC-3’；
SLC7A5基因的正向引物为：5’-GCACACTGCTCGCTGGG-3’，
SLC7A5基因的反向引物为：5’-CGCCTCTTCCTTCTCCTCG-3’。
本发明还提供了一种用于PCOS诊断的试剂盒或生物芯片，包括能够检测miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p的引物，或，能够检测XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因的引物，
miR-429的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACGGTT-3’，
miR-429的正向引物为：5’-GGGTAATACTGTCTGGTAA-3’，
miR-429的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，
miR-141-3p的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCCATCT-3’，
miR-141-3p的正向引物为：5’-GGGTAACACTGTCTGGTAA-3’，
miR-141-3p的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；
miR-126-3p的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCATT-3’
miR-126-3p的正向引物为：5’-GGGTCGTACCGTGAGTAAT-3’，
miR-126-3p的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；
XIAP基因的正向引物为：5’-CAGAGCGGAGTTGGCATTTC-3’，
XIAP基因的反向引物为：5’-TTGTCCACCTTTTCGCGCC-3’，
BRD3基因的正向引物为：5’-ACCACTTCCCGAGCTTATGTG-3’，
BRD3基因的反向引物为：5’-TGCATCTCTGCGACTGTGTG-3’；
MAPK14基因的正向引物为：5’-TTATGCGTCTGACAGGAACACC-3’，
MAPK14基因的反向引物为：5’-TTATGCGTCTGACAGGAACACC-3’；
SLC7A5基因的正向引物为：5’-GCACACTGCTCGCTGGG-3’，
SLC7A5基因的反向引物为：5’-CGCCTCTTCCTTCTCCTCG-3’。
本发明还提供了一种全基因组范围筛选上述用于PCOS诊断的颗粒细胞生物标志物的方法，包括以下步骤：
(1)通过基于高通量测序的RNA-seq技术、miRNA-seq技术和MBD-seq技术，联合检测PCOS患者与正常育龄女性卵巢颗粒细胞中全基因组水平的转录组、miRNA组和甲基化组模式；所述MBD-seq技术为蛋白质富集全基因组甲基化测序技术。
(2)对三种高通量测序数据分别进行分析，得到卵巢颗粒细胞中与多囊卵巢综合征发病相关的差异表达基因、差异表达miRNA和差异甲基化的miRNA启动子区；
(3)对RNA-seq和miRNA-seq测序数据进行联合分析，得到表达水平呈负相关的miRNA及其靶基因；
(4)对miRNA-seq和MBD-seq测序数据进行联合分析，得到表达水平受启动子区甲基化水平调控的miRNA；
(5)对PCOS相关的miRNA/mRNA对及启动子区甲基化miRNA进行联合分析，最终得到4对miRNA-mRNA作为最终的诊断标记物，分别为miR-429，miR-141-3p，和miR-126-3p；和/或，XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因，可以记为miR-429/XIAP，miR-141-3p/BRD3，miR-141-3p/MAPK14和miR-126-3p/SLC7A5。
在本发明中，首次采用RNA-seq、miRNA-seq与MBD-seq技术联合分析的方法，在全基因组范围内筛选PCOS相关生物标志物，并发现了新的诊断标志物。通过转录组和小RNA测序鉴定了PCOS患者卵巢颗粒细胞中差异表达的基因和miRNA。构建miRNA-mRNA网络，阐明其在生物过程和通路中的调控功能。此外，通过MBD-seq测定miRNA启动子区域的DNA甲基化水平。此外，还分析了差异miRNA表达与启动子甲基化之间的相关性。最后通过qRT-PCR鉴定并验证了miRNA对PCOS相关基因表达的调控作用。结果揭示了miRNA与PCOS中DNA甲基化对mRNA转录调控的复杂相互作用，对在表观遗传调控尺度上研究PCOS的发生具有重要意义。也可作为PCOS的生物标志物，有助于对PCOS实施更精确的靶向诊断和个性化治疗。
目前关于miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p的表达水平及其启动子区DNA甲基化，以及其对应靶基因XIAP(miR-429)，BRD3(miR-141-3p)，MAPK14(miR-141-3p)和SLC7A5(miR-126-3p)的差异表达与PCOS相关，以及miRNA与对应靶基因的表达水平并可作为PCOS诊断的联合生物标志物尚未见报道。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)首次采用RNA-seq、miRNA-seq与MBD-seq技术联合分析的方法，在全基因组范围内筛选PCOS相关生物标志物，并发现了新的诊断标志物。而且，该方法具有很好的技术通用性和广泛的应用前景。
(2)首次发现miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p表达水平和启动子区DNA甲基化，以及其对应靶基因XIAP(miR-429)，BRD3(miR-141-3p)，MAPK14(miR-141-3p)和SLC7A5(miR-126-3p)的差异表达可作为PCOS相关的生物标志物，相对于正常组织，其在PCOS患者卵巢颗粒细胞中呈现显著性差异表达；
(3)通过检测卵巢颗粒细胞样品中的miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p以及其对应靶基因XIAP(miR-429)，BRD3(miR-141-3p)，MAPK14(miR-141-3p)和SLC7A5(miR-126-3p)的表达，可以快速、准确及清楚的确定PCOS的发生。
(4)首次公开了用于PCOS诊断的颗粒细胞miRNA生物标志物及其作用靶点，包括miR-429/XIAP，miR-141-3p/BRD3，miR-141-3p/MAPK14和miR-126-3p/SLC7A5的组合、引物序列及其在PCOS诊断中的应用，可开发为PCOS疾病检测、诊断试剂盒，具有很强的临床应用价值。
附图说明
图1为PCOS患者和对照组颗粒细胞品总RNA琼脂糖凝胶电泳图；
图2a为PCOS患者和对照组颗粒细胞品基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图2b超声片段化后的PCOS患者和对照组颗粒细胞品基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图3a为RNA-seq 2100结果图；
图3b为miRNA-seq 2100结果图；
图3c为MBD-seq 2100结果图；
图4为MBD-seq文库甲基化富集效率验证图；
图5a为PCOS组与对照组颗粒细胞基因表达热图(左)及火山图(右)；
图5b为PCOS组与对照组颗粒细胞miRNA表达热图(左)及火山图(右)；
图6为PCOS相关基因/miRNA调控的蛋白质相互作用网络图；
图7为miRNA启动子区甲基化分布图；
图8为PCOS相关基因、miRNA差异表达与miRNA启动子区差异甲基化联合分析；
图9诊断标记物用于区分PCOS样本和正常对照的ROC曲线图；
图10为全基因组范围筛选用于PCOS诊断的颗粒细胞生物标志物的方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
首次采用RNA-seq、miRNA-seq与MBD-seq技术联合分析的方法，在全基因组范围内筛选PCOS相关生物标志物，并发现了新的诊断标志物，具体筛选方法，如图10所示：
①利用高通量测序的方法诊断筛选标志物：
1、通过基于高通量测序的RNA-seq技术、miRNA-seq技术和MBD-seq(蛋白质富集全基因组甲基化测序)技术，联合检测PCOS患者与正常育龄女性卵巢颗粒细胞中全基因组水平的转录组、miRNA组和甲基化组模式；
2、对三种高通量测序数据分别进行分析，得到卵巢颗粒细胞中与多囊卵巢综合征发病相关的差异表达基因、差异表达miRNA和差异甲基化的miRNA启动子区。
3、对RNA-seq和miRNA-seq测序数据进行联合分析，得到表达水平呈负相关的miRNA及其靶基因。
4、对miRNA-seq和MBD-seq测序数据进行联合分析，得到表达水平受启动子区甲基化水平调控的miRNA。
5、对PCOS相关的miRNA/mRNA对及启动子区甲基化miRNA进行联合分析，最终得到4对miRNA-mRNA作为最终的诊断标记物，分别为miR-429/XIAP，miR-141-3p/BRD3，miR-141-3p/MAPK14和miR-126-3p/SLC7A5。
②利用qPCR法对收集的PCOS患者和正常女性颗粒细胞样品进行检测：
1、设计并合成miR-429/XIAP，miR-141-3p/BRD3，miR-141-3p/MAPK14和miR-126-3p/SLC7A5的qPCR引物；
2、分别提取PCOS患者和正常女性颗粒细胞样品RNA；反转录后利用合成的引物进行qPCR，采用相对定量法检测PCOS患者和正常女性颗粒细胞样品中4对miRNA/mRNA的表达水平变化。
实施例
一、通过RNA-seq、miRNA-seq和MBD-seq联合分析的高通量测序法筛选诊断标志物：
1、总RNA的抽提与质检
1)采用TRIzol说明书中分离RNA的方法进行总RNA的提取，之后若不立即使用就保存于-80℃。此步也可以换用市场上可以购买到的其他同类试剂及试剂盒。
2)使用Nanodrop 2000对总RNA进行定量，质量较好的总RNA A260/280的比值应该在2.0-2.2之间。
3)使用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。电泳缓冲液为0.5×TBE，120V恒压电泳15min，之后在凝胶成像仪上观察。完整的RNA样品在电泳图中应该呈现出3条清晰的条带，由上至下分别代表了28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA(如图1)。
颗粒细胞样品总RNA质检结果(以其中两位PCOS患者和两位对照正常女性的颗粒细胞样品RNA为例，其中P代表PCOS患者，N代表对照组)。结果表明样品中的28S、18S、5S三条带均清晰可见，且亮度28S＞18S，满足后续RNA-seq技术和miRNA-seq技术建库要求。
2、总DNA的抽提和质检
1)采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒，按照说明书进行颗粒细胞DNA提取。此步也可以换用市场上可以购买到的其他同类试剂盒。
2)使用Nanodrop 2000对总DNA进行定量，质量较好的基因组DNA A260/280的比值应该在1.8-2.0之间。
3)1％使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。电泳缓冲液为0.5×TBE，120V恒压电泳30min，之后在凝胶成像仪上观察。完整的DNA样品在电泳图中应该呈现出1条清晰的条带(如图2a)。
4)DNA片段化：使用Covaris超声破碎仪对基因组DNA进行片段化，打断为200bp-500bp，然后进行醇沉，20uL无菌水重悬，取2uL稀释至10uL进行Nanodrop定量和凝胶检验(胶图如2b)
颗粒细胞样品基因组DNA质检结果(以其中两位PCOS患者和两位对照组正常女性的颗粒细胞样品基因组DNA为例，其中P代表PCOS患者，N代表对照组)。图2a结果表明样品基因组DNA完整无降解。图2b表明片段化后的DNA片段分布在200bp-500bp之间满足后续RNA-seq技术和miRNA-seq技术建库要求。
3、构建RNA-seq文库
1)RNA-seq文库用KAPA公司的KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation试剂盒，参照其说明书进行构建。此步也可以换用市场上可以购买到的其他同类建库试剂盒。
2)Qubit定量
采用Invitrogen Qubit 3型荧光定量仪及配套试剂，按照其说明书进行操作。此步也可以换用市场上可以购买到的其他同类核算定量仪器进行。
3)文库2100质检
使用Agilent的2100生物芯片分析系统及配套试剂耗材进行2100质检，其具体流程参照说明书进行操作(结果见图3a)。
4、构建miRNA-seq文库
1)miRNA-seq文库用Illumina公司的TruSeq Small RNA Library Prep试剂盒，参照其说明书进行构建。此步也可以换用市场上可以购买到的其他同类建库试剂盒进行。
2)Qubit定量
具体的操作方法与RNA-seq文库构建中的Qubit定量步骤相同。
3)2100质检
具体的操作方法与miRNA-seq文库构建中的2100质检步骤相同(结果见图3b)。
5、MBD-seq文库构建
1)MBD-seq文库用Invitrogen公司的MethylMinerTMMethylated DNA Enrichment试剂盒进行甲基化片段富集，用NEB公司的
Figure BDA0002247980870000092
Ultra I DNA Library Prep Kitfor
Figure BDA0002247980870000093
试剂盒进行文库构建，具体操作步骤参照其说明书进行。此步也可以换用市场上可以购买到的其他同类甲基化片段富集和建库试剂盒进行。
2)Qubit定量
具体的操作方法与RNA-seq文库构建中的Qubit定量步骤相同。
3)甲基化富集效率质控
按下表配置反应体系：
Figure BDA0002247980870000091
PCR反应程序为：
Figure BDA0002247980870000101
跑2.5％琼脂糖凝胶进行验证(结果见图4)
MBD-seq文库甲基化富集效率验证，如图4所示为质控组甲基化富集片段PCR结果，Non-methylated与Methylated分别为非甲基化和甲基化引物(试剂盒中提供)扩增出的片段，其中甲基化片段为69bp，均富集于Elution组中，非甲基化片段65bp长短，只存在于Input与Unbond组中，因此判断甲基化富集成功。
4)2100质检
具体的操作方法与RNA-seq文库构建中的2100质检步骤相同(结果见图3c)。
如图3a-3c所述，RNA-seq、miRNA-seq文库及MBD-seq文库的Agilent2100Bioanalyzer检测结果及下机数据质检结果(以其中三位PCOS患者和三位对照组正常女性的颗粒细胞样品文库为例，其中P代表PCOS患者，N代表对照组)。结果均表明文库质量良好，可用于进行下一步数据分析。
6、上机测序及数据分析
RNA-seq、miRNA-seq和MBD-seq文库均经Illumina Hiseq X Ten平台进行双端测序后得到原始数据，首先经过FastQC进行初步的质量检测，经过评估整体满足质量标准后进行后续数据分析。
RNA-seq测序数据在预处理后，使用HISAT2(v 2.0.5)比对到UCSC人的参考基因组hg38上。然后使用Stringtie(v 1.3.3)程序根据来自Gencode release 31(GRCh38.p12)的Ensembl进行基因注释。最后的未标准化计数通过R软件(v 3.6.0)组装成一个计数矩阵，利用R包DESeq2(v 1.24.0)和edgeR(v 3.26.5)分别进行差异表达分析。DESeq2和edgeR得出差异表达基因(Differential expressed genes，DEGs)的交集被用作进行下一步分析，筛选所用的阈值为|log2差异倍数|≥1、p值<0.05。
miRNA-seq测序的原始数据经过去接头程序去掉原始下机数据中的接头序列，使用Trimmomatic程序除去低质量的序列得到干净序列，保留15-35nt的片段进行后续分析。接着使用bowti2程序将clean data比对到mirBase中的known miRNA数据库上，进行miRNA表达水平分析，并利用R包DESeq2(v 1.24.0)和edgeR(v3.26.5)分别进行差异表达分析。DESeq2和edgeR得出差异表达miRNA(Differential expressed miRNAs，DEmiRs)的交集被用作进行下一步分析，筛选所用的阈值为|log2差异倍数|≥1、p值<0.05。
MBD-seq测序的原始数据经过读取和过滤低质量序列后利用bowtie2比对到参考基因组上(Human hg38)。使用R软件包MEDIPS(v 1.24.0)对PCOS和对照组的DNA甲基化数据集进行分析比较。满足|log2差异倍数|≥1和p值<0.05的被认为是差异甲基化区域。
7、生物信息学分析
将PCOS组与对照组中的基因与miRNA表达情况做成热图以及火山图(图5a和5b)，找出差异表达的830个基因与30个miRNA，利用miRBase预测miRNA靶向调控的基因，结果与表达呈负相关的靶基因与miRNA取交集得出与PCOS相关的10对靶基因和miRNA，利用STRING数据库(v 11.0)预测蛋白质相互作用，利用Cytoscape(v 3.6.0)软件绘制蛋白质网络图，如图6所示，PCOS相关基因/miRNA调控的蛋白质相互作用网络图(深灰色方形代表上调的基因；浅灰色方形代表下调基因；深灰色菱形代表上调的miRNA；浅灰色菱形代表下调的miRNA；六边形代表相关的KEGG通路。
将PCOS组与对照组中的miRNA启动子区甲基化分布情况做成柱状图(图7，深灰色表示PCOS组相对于对照组高甲基化；浅灰色表示PCOS组相对于对照组低甲基化)。由结果可知，miRNA启动子区在PCOS组和对照组中表现出明显的甲基化差异，整体呈现高甲基化，启动子区高甲基化的miRNA被筛选出，与PCOS相关的10对基因/miRNA取交集，得出miR-429/XIAP，miR-141-3p/BRD3，miR-141-3p/MAPK14和miR-126-3p/SLC7A5共4对标志物。
二、利用qPCR法对收集的共30位PCOS患者及对照组颗粒细胞中miR-429/XIAP，miR-141-3p/BRD3，miR-141-3p/MAPK14和miR-126-3p/SLC7A5的表达水平进行检测：
1、总RNA的抽提与质检
具体的操作方法与诊断标志物筛选中的总RNA抽提与质检步骤相同。
2、总RNA的反转录
使用PrimeScriptTMRT reagent试剂盒进行反转录，包括去除基因组DNA和反转录两个过程，具体步骤如下所示：
1)去除总RNA样品中的基因组DNA，体系配方如下所示：
5×gDNA Eraser Buffer 2μL
gDNA Eraser 1μL
Total RNA 1μg
无RNA酶超纯水 up to 10μL
总体积 10μL
置于PCR仪中进行反应，42℃反应2min。
2)反转录反应
将总RNA样品均分至两个pcr管中，在冰上分别配置miRNA和mRNA反转录体系(管1-miRNA反转录体系；管2-mRNA反转录体系)，体系配方如下所示：
管1：
去除gDNA后的总RNA样品 5μL
PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μL
5×PrimerScript Buffer 2μg
茎环引物母液(每个miRNA的RT引物均为0.5uM) 1μL
无RNA酶超纯水 1.5μL
总体积 10μL
管2：
去除gDNA后的总RNA样品 5μL
PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μL
5×PrimeScript Buffer 2μL
Oligo dT Primer(50μM) 0.5μL
Random 6mers(100μM) 0.5μL
无RNA酶超纯水 1.5μL
总体积 10μL
轻柔混匀后立即置于PCR仪中进行反转录反应，反应条件为:
45℃ 15min
85℃ 5sec
4℃ 5min
3)qPCR反应体系配置
分别取4uL RNA-qPCR cDNA和miRNA-qPCR cDNA稀释20倍，配成模板母液，每个样品的待测基因和miRNA准备一个PCR管，向其中分别加入对应的9.6uL模板液、6.4uL(F+R)引物(10uM)、16uL qPCR Mix(Thermo Fisher PowerUp SYBR qPCR Master Mix)。其中RNA-qPCR以ACTB作为内参基因，miRNA-qPCR以U6作为内参基因。混匀后，分别加入8连管上的3个平行孔中，每孔10uL。压紧盖板，瞬离，放入qPCR仪中，过程中避光。
充分混匀后瞬离，轻轻弹击管壁以除去气泡，再次离心。之后置于StepOne PlusReal-Time PCR System中，设定程序并进行qPCR反应，反应程序如下：
Figure BDA0002247980870000131
4)qPCR数据分析
qPCR反应完成之后对获得的数据进行相对表达量分析，具体计算过程如下，计算结果见表1：
ΔCt(PCOS)＝Ct(PCOS)-Ct(PCOS ACTB/U6)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组)-Ct(对照组ACTB/U6)
ΔΔCt＝ΔCt(PCOS)-ΔCt(对照组)
目的基因/miRNA的表达量的倍数变化的相对表达量＝2(-ΔΔCt)
做图展示miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p启动子区DNA甲基化变化与miR-429/XIAP，miR-141-3p/BRD3，miR-141-3p/MAPK14和miR-126-3p/SLC7A5表达水平，如图8所示，PCOS相关基因、miRNA差异表达与miRNA启动子区差异甲基化联合分析(图8A由上到下依次表示miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p启动子区DNA甲基化变化；图8B由上到下分别代表miR-429/XIAP，miR-141-3p/BRD3，miR-141-3p/MAPK14和miR-126-3p/SLC7A5的表达水平相对变化；图8C为PCOS相关相关基因、miRNA差异表达与miRNA启动子区差异甲基化间相互调控示意图；其中深灰色代表PCOS组，浅灰色代表对照组)。
5)受试者工作特征曲线(ROC曲线)绘制及分析
利用GraphPad Prism 7对ROC曲线进行绘制，曲线图见图9，诊断标记物用于区分结PCOS组和对照组的ROC曲线图。结果表明：miR-429/XIAP，miR-141-3p/BRD3，miR-141-3p/MAPK14和miR-126-3p/SLC7A5的联合诊断标记物AUC值＝0.9235，p值＜0.01，对PCOS检测具有非常高的特异性和灵敏度。
6)下表为实验中用到的qPCR引物序列：
1、miRNA qPCR引物
Figure BDA0002247980870000132
Figure BDA0002247980870000141
2、mRNAqPCR引物
Figure BDA0002247980870000142

Claims (10)

1.用于PCOS诊断的颗粒细胞生物标志物，其特征在于，包括miR-429，miR-141-3p，和miR-126-3p；和/或，XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因。
2.miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p一起作为用于PCOS诊断的生物标志物的应用。
3.XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因一起作为用于PCOS诊断的生物标志物的应用。
4.检测miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p的产品在制备诊断PCOS的试剂盒或芯片上的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述产品为能够检测miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p的引物，
miR-429的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACGGTT-3’，
miR-429的正向引物为：5’-GGGTAATACTGTCTGGTAA-3’，
miR-429的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，
miR-141-3p的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCCATCT-3’，
miR-141-3p的正向引物为：5’-GGGTAACACTGTCTGGTAA-3’，
miR-141-3p的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；
miR-126-3p的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCATT-3’
miR-126-3p的正向引物为：5’-GGGTCGTACCGTGAGTAAT-3’，
miR-126-3p的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。
6.检测XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因的产品在制备诊断PCOS的试剂盒或芯片上的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述产品为能够检测XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因的引物，
XIAP基因的正向引物为：5’-CAGAGCGGAGTTGGCATTTC-3’，
XIAP基因的反向引物为：5’-TTGTCCACCTTTTCGCGCC-3’，
BRD3基因的正向引物为：5’-ACCACTTCCCGAGCTTATGTG-3’，
BRD3基因的反向引物为：5’-TGCATCTCTGCGACTGTGTG-3’；
MAPK14基因的正向引物为：5’-TTATGCGTCTGACAGGAACACC-3’，
MAPK14基因的反向引物为：5’-TTATGCGTCTGACAGGAACACC-3’；
SLC7A5基因的正向引物为：5’-GCACACTGCTCGCTGGG-3’，
SLC7A5基因的反向引物为：5’-CGCCTCTTCCTTCTCCTCG-3’。
8.用于PCOS诊断的试剂盒或生物芯片，包括能够检测miR-429，miR-141-3p和miR-126-3p的引物，或，能够检测XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因的引物，
miR-429的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACGGTT-3’，
miR-429的正向引物为：5’-GGGTAATACTGTCTGGTAA-3’，
miR-429的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，
miR-141-3p的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCCATCT-3’，
miR-141-3p的正向引物为：5’-GGGTAACACTGTCTGGTAA-3’，
miR-141-3p的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；
miR-126-3p的RT引物为：
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCATT-3’
miR-126-3p的正向引物为：5’-GGGTCGTACCGTGAGTAAT-3’，
miR-126-3p的反向引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；
XIAP基因的正向引物为：5’-CAGAGCGGAGTTGGCATTTC-3’，
XIAP基因的反向引物为：5’-TTGTCCACCTTTTCGCGCC-3’，
BRD3基因的正向引物为：5’-ACCACTTCCCGAGCTTATGTG-3’，
BRD3基因的反向引物为：5’-TGCATCTCTGCGACTGTGTG-3’；
MAPK14基因的正向引物为：5’-TTATGCGTCTGACAGGAACACC-3’，
MAPK14基因的反向引物为：5’-TTATGCGTCTGACAGGAACACC-3’；
SLC7A5基因的正向引物为：5’-GCACACTGCTCGCTGGG-3’，
SLC7A5基因的反向引物为：5’-CGCCTCTTCCTTCTCCTCG-3’。
9.一种全基因组范围筛选权利要求1所述的用于PCOS诊断的颗粒细胞生物标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过基于高通量测序的RNA-seq技术、miRNA-seq技术和MBD-seq技术，联合检测PCOS患者与正常育龄女性卵巢颗粒细胞中全基因组水平的转录组、miRNA组和甲基化组模式；
(2)对三种高通量测序数据分别进行分析，得到卵巢颗粒细胞中与多囊卵巢综合征发病相关的差异表达基因、差异表达miRNA和差异甲基化的miRNA启动子区；
(3)对RNA-seq和miRNA-seq测序数据进行联合分析，得到表达水平呈负相关的miRNA及其靶基因；
(4)对miRNA-seq和MBD-seq测序数据进行联合分析，得到表达水平受启动子区甲基化水平调控的miRNA；
(5)对PCOS相关的miRNA/mRNA对及启动子区甲基化miRNA进行联合分析，最终得到诊断标记物，分别为miR-429，miR-141-3p，和miR-126-3p；和/或，XIAP基因，BRD3基因，MAPK14基因和SLC7A5基因。
10.根据权利要求9所述全基因组范围筛选用于PCOS诊断的颗粒细胞生物标志物的方法，其特征在于，步骤(1)所述MBD-seq技术为蛋白质富集全基因组甲基化测序技术。
CN201911023570.1A 2019-10-25 2019-10-25 用于pcos诊断的颗粒细胞生物标志物及其筛选方法和诊断试剂盒 Pending CN110747269A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911023570.1A CN110747269A (zh) 2019-10-25 2019-10-25 用于pcos诊断的颗粒细胞生物标志物及其筛选方法和诊断试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911023570.1A CN110747269A (zh) 2019-10-25 2019-10-25 用于pcos诊断的颗粒细胞生物标志物及其筛选方法和诊断试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110747269A true CN110747269A (zh) 2020-02-04

Family

ID=69280014

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911023570.1A Pending CN110747269A (zh) 2019-10-25 2019-10-25 用于pcos诊断的颗粒细胞生物标志物及其筛选方法和诊断试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110747269A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111254193A (zh) * 2020-02-27 2020-06-09 上海交通大学 Dna甲基化标志物pcyt1a在制备诊断pcos试剂盒中的应用
CN112458161A (zh) * 2020-11-12 2021-03-09 深圳市锦欣医疗科技创新中心有限公司 一组子宫内膜容受性生物标志物、试剂盒及判断子宫内膜容受性的方法
CN112852946A (zh) * 2021-01-15 2021-05-28 中国农业大学 一种诊断生物标志物及其应用
CN113106153A (zh) * 2021-04-14 2021-07-13 许丽群 一种多囊卵巢综合征基因检测试剂盒及其制备方法和应用
CN114550821A (zh) * 2022-03-16 2022-05-27 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 快速筛选小鼠mmu-miR-25-3p与启动子结合靶点的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170152561A1 (en) * 2014-06-27 2017-06-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods employing circulating dna and mirna as biomarkers for female infertility
CN109022565A (zh) * 2017-06-12 2018-12-18 山大生殖研发中心有限公司 多囊卵巢综合征的microRNA生物标记物和其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170152561A1 (en) * 2014-06-27 2017-06-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods employing circulating dna and mirna as biomarkers for female infertility
CN109022565A (zh) * 2017-06-12 2018-12-18 山大生殖研发中心有限公司 多囊卵巢综合征的microRNA生物标记物和其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANRUI MAO 等: "Identification of epigenetic interactions between microRNA and DNA methylation associated with polycystic ovarian syndrome", 《PREPRINTS》 *
贺婷婷 等: "多囊卵巢综合征患者颗粒细胞中microRNA-141 的表达与意义", 《山东大学学报(医学版)》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111254193A (zh) * 2020-02-27 2020-06-09 上海交通大学 Dna甲基化标志物pcyt1a在制备诊断pcos试剂盒中的应用
CN112458161A (zh) * 2020-11-12 2021-03-09 深圳市锦欣医疗科技创新中心有限公司 一组子宫内膜容受性生物标志物、试剂盒及判断子宫内膜容受性的方法
CN112852946A (zh) * 2021-01-15 2021-05-28 中国农业大学 一种诊断生物标志物及其应用
CN113106153A (zh) * 2021-04-14 2021-07-13 许丽群 一种多囊卵巢综合征基因检测试剂盒及其制备方法和应用
CN114550821A (zh) * 2022-03-16 2022-05-27 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 快速筛选小鼠mmu-miR-25-3p与启动子结合靶点的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200385810A1 (en) Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples
JP6513622B2 (ja) 非侵襲的出生前診断に有用な母体試料由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物
CN110747269A (zh) 用于pcos诊断的颗粒细胞生物标志物及其筛选方法和诊断试剂盒
Lee et al. Genome-wide methylation profiling and a multiplex construction for the identification of body fluids using epigenetic markers
EP2513339B1 (en) Methods for determining fraction of fetal nucleic acid in maternal samples
Courts et al. Specific micro‐RNA signatures for the detection of saliva and blood in forensic body‐fluid identification
US11396678B2 (en) Breast and ovarian cancer methylation markers and uses thereof
US20190300964A1 (en) Colon cancer methylation markers and uses thereof
EP2885427B1 (en) Colorectal cancer methylation marker
US20190300965A1 (en) Liver cancer methylation markers and uses thereof
US20140051082A1 (en) Prostate cancer markers
Salzmann et al. Transcription and microbial profiling of body fluids using a massively parallel sequencing approach
EP3481952A1 (en) Leukemia methylation markers and uses thereof
CN107299129B (zh) 循环核酸作为乳腺癌生物标志物的应用
CN111304305A (zh) 一种用于检测egfr基因甲基化的试剂盒及方法
CN112662748B (zh) 用于单细胞dna测序文库质量鉴定的引物对组合、方法和试剂盒
KR102096499B1 (ko) 대장암 진단 또는 재발 예측을 위한 마이크로rna-3960 및 이의 용도
Shin et al. Novel discovery of LINE-1 in a Korean individual by a target enrichment method
CN114787385A (zh) 用于检测核酸修饰的方法和系统
Al-Turkmani et al. Molecular assessment of human diseases in the clinical laboratory
WO2022126938A1 (zh) 一种检测多核苷酸变异的方法
US20100120049A1 (en) Biomarkers for serious skin rash
김용강 Hierarchical Structural Component Models for Integrative Analysis of miRNA and mRNA expression data
EP3878973B1 (en) Methods for determining fraction of fetal nucleic in maternal samples
CN116287227A (zh) 用于诊断前列腺癌的试剂和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200204

RJ01 Rejection of invention patent application after publication