CN109022565A - 多囊卵巢综合征的microRNA生物标记物和其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了多囊卵巢综合征的microRNA生物标记物和其应用。本发明提供了miRNA‑141在用于制备研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒或装置中的用途。本发明还提供了用于研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒或装置，其中包括测量miRNA‑141的表达水平的试剂，例如实时荧光定量PCR试剂盒或基因芯片。本发明还提供了miRNA‑141在用于制备预测多囊卵巢综合征患者在接受辅助生殖技术后的优质胚胎率的试剂盒或装置中的用途，以及所述试剂盒或装置。

Description

多囊卵巢综合征的microRNA生物标记物和其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和疾病基因研究和诊断领域。具体的，本发明涉及多囊卵巢综合征(PCOS)的microRNA生物标记物，以及所述microRNA在制备用于诊断或检测多囊卵巢综合征的试剂盒或基因芯片的应用。

背景技术

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)影响6-8％的生殖年龄妇女，是最常见的内分泌疾病之一(Shi等，2012)。PCOS目前被定义为高雄激素性疾病，具有一定的体征和症状，其中必然包括排卵功能障碍(ovulatory dysfunction)和/或多囊卵巢形态(polycystic ovarian morphology)(Azziz等，2006)。PCOS也与代谢紊乱，包括胰岛素耐受，肥胖和糖尿病有关(Sam，2015)。虽然肥胖不是PCOS表型的一部分，但它加剧了葡萄糖耐受不良，血脂异常和妊娠并发症(Legro，2012)。据估计，30％-75％的PCOS患者超重或肥胖(Diamanti-Kandarakis，2007)，但超重感染和PCOS的关联仍然未知。因此，进一步了解PCOS病理生理学的分子机制可能有助于鉴定新的诊断和治疗靶点。

基因表达取决于转录和翻译过程的调节(Sanchez等，2011)。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是调节转录后的基因表达并影响许多细胞功能(包括葡萄糖和脂质代谢)的短(20-24个核苷酸)非编码RNA(Chen等，2013，Deiuliis，2016，Zhu等，2011)。miRNAs是mRNA表达的重要调节因子，并且具有控制多个靶标的能力，因此miRNA在许多生物过程中起着重要的调节作用(Bartel，2009)。

miRNA的异常表达与一些代谢紊乱(包括肥胖，糖尿病和PCOS等)有关(Chen，Heneidi，Lee，Layman，Stepp，Gamboa，Chen，Chazenbalk和Azziz，2013，Fernandez-Valverde等，2011，Hulsmans等人，2011)，并且几项研究突出发现了miRNAs维持代谢体内平衡的功能(Redis和Calin，2017)。因此，miRNA是代谢过程的潜在调节因子，并且是调节PCOS和相关疾病相关复杂途径的有希望的靶标。除了miRNA在新陈代谢中的作用，最近的研究已经表明miRNA对于斑马鱼的胚胎发育是重要的(Wienholds等，2005)，以及在人类MII卵母细胞中存储的miRNA在卵母细胞成熟期间被表达(Battaglia等，2016)。miRNA-125家族也被证明在母性基因表达调控中发挥关键作用(Kim等，2016)。

本领域需要一种对多囊卵巢综合征(PCOS)的诊断，特别是通过特异性相关miRNA的表达水平来对PCOS进行准确和快速的检测或预测的方法、试剂盒或基因芯片。

发明内容

本发明提供了表明多囊卵巢综合征(PCOS)的miRNA生物标记物。本发明提供了通过在样品，特别是颗粒细胞样品中检测所述生物标记物的miRNA的表达水平变化来检测或诊断PCOS的方法以及用于这些方法的试剂盒或基因芯片。

在本发明的其中一个方面，本发明提供了miRNA-141在研究或检测多囊卵巢综合征中的用途。在本发明的其中又一个方面，提供了联合使用miRNA-141和与miRNA-200c在研究或检测多囊卵巢综合征中的用途。所述研究或检测通常是通过对细胞中的miRNA的表达分析来进行。优选的，所述研究或检测是在颗粒细胞样品中进行。

在本发明的其中一个方面，本发明提供了miRNA-141单独或与miRNA-200c联合在用于制备研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒或装置中的用途。所述研究或检测通常是通过对细胞中的miRNA的表达分析来进行。优选的，所述研究或检测是在颗粒细胞样品中进行。

对多囊卵巢综合征的检测也包括对多囊卵巢综合征的诊断。在本发明的其中一个方面，所述试剂盒为用于通过实时荧光定量PCR方法研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒。在本发明的其中又一个方面，所述装置为用于研究或检测多囊卵巢综合征的基因芯片。

本发明还提供了用于研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒或装置，其中包括测量miRNA-141的表达水平的试剂。在本发明的另一个方面，所述试剂盒或装置还包括测量miRNA-200c的表达水平的试剂。优选的，所述试剂盒或装置用于在颗粒细胞样品中研究或检测多囊卵巢综合征。在本发明的其中一个方面，所述试剂盒为用于通过实时荧光定量PCR方法研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒。在本发明的其中又一个方面，所述有时装置为用于研究或检测多囊卵巢综合征的基因芯片。

在本发明的其中一个方面，提供了miRNA-141在用于预测多囊卵巢综合征患者在接受辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology，ART)后的优质胚胎率的方法。在本发明的其中一个方面，提供了miRNA-141在用于制备预测多囊卵巢综合征患者在接受辅助生殖技术后的优质胚胎率的试剂盒或装置中的用途。本发明还提供了用于制备预测多囊卵巢综合征患者在接受辅助生殖技术后的优质胚胎率的试剂盒或装置中的用途。本发明还提供了预测多囊卵巢综合征患者的优质胚胎率的试剂盒或装置，其中包括测量miRNA-141的表达水平的试剂。

在本发明中，可以使用适用于检测生物样品中的RNA表达水平的任意技术，可以测量样品中miR基因产物的水平。用于测定生物样品(例如，细胞，组织)中RNA表达水平的合适技术(例如，RNA印迹分析，RT-PCR，原位杂交)是本领域技术人员已知的。

在本发明中，对miRNA的表达水平的测量通过检测转录的多核苷酸或其部分的存在来进行，其中转录的多核苷酸包含miRNA的编码区。

在本文中，术语“微小RNA”、“microRNA”、“miR基因产物”、“miR”和“miRNA”互换使用，是指来自miR基因的未加工的或加工过的RNA转录物。由于miR基因产物不翻译成蛋白，术语“miR基因产物”不包括蛋白。未加工的miR基因转录物也称作“miR前体”，通常包含长度为约70-100个核苷酸的RNA转录物。miR前体可以消化加工成有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。该有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称作“加工过的miR基因转录物”或“成熟的miRNA”。本发明的miRNA主要是指哺乳动物的miRNA，特别是指人的miRNA。

本发明的miRNA主要是指人的miRNA。例如，在本文中，“miR-141”也代表“hsa-miR-141”。在本发明中涉及的miRNA包括其miRNA家族，其家族成员和序列在例如http:// www.mirbase.org/等网站公开。

在本文中，蛋白符号不用斜体，并全部大写；基因符号使用斜体。但有时在本文中基因符号也不使用斜体。例如有时本文中的miRNA“miR-141”也写为“miR-141”。

本发明中有关miRNA的序列如下：

附图说明

图1为来自对照(n＝57)，正常BMI的PCOS患者(n＝62)和超重PCOS患者(n＝54)的颗粒细胞中miRNA-200c和miRNA-141的表达。数据是平均值±SEM，并且各组与对照进行比较，one-way ANOVA with Dunnett’s post-test。*p<0.05，**p<0.01。

图2为采用ROC曲线对A：miRNA-200c、B:miRNA-141和C：miRNA-200c和miRNA-141的结合用于预测PCOS的效果进行评估。

图3为对照组与正常BMI PCOS患者中miRNA-141表达与优质胚胎率之间的关系的散点图。左图为使用非参数Spearman检验(nonparametric Spearman test)进行统计学分析。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例1

患者征集

根据山东大学伦理委员会批准的规定，从山东大学生殖医学中心接受体外受精(IVF)或胞质内精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的患者中收集卵巢颗粒细胞。每名病人都签署了正式书面同意。根据经过修订的鹿特丹诊断标准((RotterdamESHRE/ASRM-Sponsored PCOS consensus workshop group,2004)对患者进行PCOS诊断。共有62例PCOS具有正常BMI(18.5-24.9kg/m²)的PCOS患者和54例超重(BMI>24.9kg/m²)的PCOS患者，分别设为正常BMI PCOS组和超重PCOS组。另外将57例BMI(18.5-24.9kg/m²)正常，月经正常，卵巢功能正常(FSH<10IU/l，抗Mullerian激素(AMH)>1.0ng/ml)，并且没有雄激素过多症的临床或生化特征的女性作为对照组。所有参加者年龄小于35岁。这些女性接受IVF或ICSI治疗和/或输卵管因子不育症(tubal factor infertility)。本研究中排除具有全身疾病，子宫内膜异位或异常催乳素水平或甲状腺功能的女性。

实施例2卵泡液收集和卵泡颗粒细胞的采集

使用已公开的方法(Kaur等人，2012)对卵巢进行刺激和收集卵母细胞。在卵泡充分发育后，施用人绒毛膜促性腺激素(hCG)以触发排卵。在注射hCG之前，收集静脉血用于测量雌二醇(E2)和孕酮(P4)水平。根据已公开的方法(Matsubara等，2000)，在hCG处理后36小时收集卵母细胞，并从无血液污染的卵泡液中采集卵巢颗粒细胞。颗粒细胞用Ficoll-Paque(Solarbio，北京，中国)纯化。颗粒细胞和滤泡液样品都储存在-80℃。

实施例3人类颗粒细胞中miRNA-200c和miRNA-141表达的定量分析

通过RNA提取、逆转录和实时(RT)-PCR，对miRNA-200c和miRNA-141在人类颗粒细胞中的表达进行定量分析。

RNA提取。根据制造商的说明，使用TRIZOL Reagent(Life Technologies,上海,中国)从颗粒细胞提取全RNA。RNA储存在-80℃。

RT-PCR。根据制造商的说明，使用MiRNA-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Takara-Clontech，中国)将总RNA逆转录成cDNA。用于RT-PCR的引物列于表1中。根据制造商的说明书，使用Quanti Nova SYBR Green PCR Kit(QIAGEN，德国)，在Light Cycler 480系统上进行RT-PCR。通过熔解曲线分析评估扩增特异性，并使用miRNA-16作为内部对照。使用2^-△△CT方法计算每个样品中的相对mRNA水平。

表1RT-PCR的引物

实施例4统计分析

数据以平均值±标准偏差(SD)或平均值±标准误差(SEM)形式给出。使用Kolmogorov-Smirnov检验评估数据分布，以确定连续变量是否正态分布。运用单因素方差分析然后Student-Newman-Keuls检验对正态分布变量进行评估。通过Spearman测试评估miRNA-200c和miRNA-141与临床特征的关联。p值<0.05被认为具有统计学意义。

实施例5受试者生理生化指标和IVF结果

数据和结果如表2所示。通过比较患者与对照组的统计资料和IVF结果，发现在正常BMI的PCOS患者中，空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著高于对照的数值。PCOS患者具有显著升高的基础黄体激素(LH)，LH/FSH，基础睾酮，AMH，空腹胰岛素，HOMA-IR和甘油三酯(TG)，以及显著降低的基础FSH和总促性腺激素(Gn)含量。超重PCOS患者比正常BMI的PCOS患者具有明显升高的BMI，收缩压和舒张压，基础睾酮水平，空腹血糖，空腹胰岛素，HOMA-IR，低密度脂蛋白(LDL)水平，TG，总Gn含量和Gn日均含量，但低密度脂蛋白(HDL)水平低于正常BMI PCOS患者。这些发现表明，与正常BMI的PCOS患者相比，超重PCOS患者倾向于具有更严重的胰岛素耐受性和高胰岛素血症。

表2受试者统计信息、生理生化指标和IVF结果

BMI:身体质量指数(body mass index)；FSH:促卵泡激素(follicle-stimulatinghormone)；LH:促黄体激素(luteinizing hormone)；E2:雌激素(estrogen)；PRL:泌乳素(prolactin)；AMH:抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone)；DHE-S:硫酸脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate)；HOMA-IR:胰岛素抵抗指数(homeostatic modelassessment-insulin resistance)；TC:总胆固醇；HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇；TG:甘油三酯；Gn：促性腺激素(gonadotropin)。*p<0.05,正常-BMIPCOS vs.对照。**p<0.01,正常BMI PCOS vs.对照。#p<0.05,超重PCOS vs.正常BMIPCOS。##p<0.01,超重PCOS vs.正常BMI PCOS。

优质胚胎率＝(优质胚胎数/正常受精卵裂胚胎数)*100％

优质胚胎是指：由正常受精卵发育而来且符合以下条件：D3天7～10个卵裂球，卵裂球没有多核，评分3分～4分的胚胎；评分根据Puissant(Puissant F,RysselbergeM.Embryo scoring as a prognostic tool in IVF treatment[J].Hum Reprod,1987,2:705-708)的早期胚胎评分标准，即4分：卵裂球形态大小正常均一，没有无核碎片；3分：轻微的形态大小不均的卵裂球，无核碎片小于细胞团块1/3；2分：卵裂球不均，碎片介于细胞团块1/3-1/2；1分：只有1或2个卵裂球，大量无核碎片；0分：退化，完全是碎片。

实施例6miRNA-141和miRNA-200c的表达与PCOS

如图1所示，与对照组比较，正常BMI的PCOS患者的miRNA-141和miRNA-200c的表达都显著升高(分别为p＝0.007和p<0.001)。在正常BMI的PCOS患者和超重PCOS患者中，miRNA-141和miRNA-200c的表达没有显著区别(分别为p＝0.665和p＝0.978)。

采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)对miRNA-200c and miRNA-141用于预测PCOS的敏感性(sensitivity)、特异性(specificity)和阳性界值(cut-off value)进行评估。结果见表3和图2所示。

表3颗粒细胞中miRNA预测PCOS的分辨值

AUC：ROC曲线下面积；95％CI：95％置信区间。采用Spss.23计算敏感性和特异性。根据敏感性和特异性计算约登指数(Youden index)，以约登指数最大的点为阳性界值(cut-off value)。

miRNA-200c和miRNA-141的敏感性、特异性和最佳筛查阳性界值分别为39.0％,94.6％,和0.736(95％CI:0.643–0.828)以及28.0％,94.1％,和0.632(95％CI:0.521–0.743)。联合采用miRNA-200c和miRNA-141时，敏感性、特异性和最佳筛查阳性界值为55.8％,88.7％,和0.717(95％CI:0.614–0.819)。

实施例7miRNA-141表达与优质胚胎率

如图3所示，与对照组比较，正常BMI的PCOS患者的miRNA-141表达与优质胚胎率有显著的正相关性(r＝0.649,p<0.001)。

已经发现在PCOS患者中，从受激卵泡中获得的颗粒细胞中的一些激素基因过表达，并且这些基因的表达在未成熟卵泡中的表达比在成熟卵泡中更高。这种变化可能是卵泡成熟缺陷的迹象，或可能反映雄激素过多症的存在(Catteau-Jonard等，2008)。另外有报道在寡/无卵性PCOS(oligo/anovulatory PCOS)患者的颗粒细胞中，AMH和AMH II型受体的过表达可能是由于LH水平升高和/或对其抑制作用的抑制，并强调LH在PCOS患者的滤泡停止发育(follicular arrest)中的作用，表明AMH/AMHR-II系统也可能涉及(Pierre等，2013)。PCOS患者的颗粒细胞对FSH有异常反应，尽管在控制性超促排卵下卵泡发育正常(Coffler等，2003)。在PCOS患者中，颗粒细胞的颗粒细胞-卵母细胞内分泌和旁分泌机制失调(Xiao等，2014)。虽然PCOS患者可以通过控制性超促排卵来产生可怀孕的相似卵母细胞(comparable oocytes)，但优势卵泡仍保留了一些基础的异常，从而影响卵母细胞质量和胚胎发育，并且PCOS患者颗粒细胞中存在许多异常表达的miRNA(Sorensen等，2016；Sorensen，Wissing，Salo，Englund和Dalgaard，2014)。

MicroRNA在广泛的生物学过程如细胞增殖，分化，存活和细胞凋亡以及应激反应中都发挥关键的调节功能(Flynt和Lai，2008)。Ruizhi等(Feng等，2015)表明，人卵泡液中的miRNA-320可影响胚胎质量。本发明发现正常BMI的PCOS患者的颗粒细胞中的miRNA-141过表达，并且与优质胚胎率有显著的正相关性。这进一步证明了miRNA-141在胚胎发育潜能中的重要角色。

本发明首次发现了miRNA-141和miRNA-200c的表达水平与多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)密切相关，也是在本领域第一次把多囊卵巢综合征患者的体重因素也考虑在内。本发明还意外地发现了正常BMI的PCOS患者的颗粒细胞中的miRNA-141过表达，并且与优质胚胎率有显著的正相关性。本发明由此发现了多囊卵巢综合征的microRNA生物标记物，即miRNA-141或miRNA-200c，并提供了miRNA-141或miRNA-141和miRNA-200c联合使用，用于研究或检测多囊卵巢综合征的方法和相关试剂盒或装置。本发明还由此提供了所述microRNA生物标记物用于预测多囊卵巢综合征患者在接受辅助生殖技术后的优质胚胎率的方法和相关试剂盒或装置。

上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。

如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。

本专利说明书中提到的参考文献包括在以下参考文献中，并通过全文引用在本申请中进行公开。

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序列表

<110> 山大生殖研发中心有限公司

<120> 多囊卵巢综合征的microRNA生物标记物和其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 95

<212> RNA

<213> 人

<400> 1

cggccggccc uggguccauc uuccaguaca guguuggaug gucuaauugu gaagcuccua 60

acacugucug guaaagaugg cucccgggug gguuc 95

<210> 2

<211> 68

<212> RNA

<213> 人

<400> 2

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Claims (10)

1.miRNA-141在用于制备研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒或装置中的用途。

2.权利要求1的用途，其中将miRNA-141与miRNA-200c联合使用于制备研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒或装置。

3.权利要求1或2的用途，其中所述试剂盒或装置用于在颗粒细胞样品中研究或检测多囊卵巢综合征。

4.权利要求1或2的用途，其中所述试剂盒为用于通过实时荧光定量PCR方法研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒，或者所述装置为用于研究或检测多囊卵巢综合征的基因芯片。

5.用于研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒或装置，其中包括测量miRNA-141的表达水平的试剂。

6.权利要求5的试剂盒或装置，其中还包括测量miRNA-200c的表达水平的试剂。

7.权利要求5或6的试剂盒或装置，其用于在颗粒细胞样品中研究或检测多囊卵巢综合征。

8.权利要求7或8的试剂盒或装置，其中所述试剂盒为用于通过实时荧光定量PCR方法研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒，或者其中所述装置为用于研究或检测多囊卵巢综合征的基因芯片。

9.miRNA-141在用于制备预测多囊卵巢综合征患者在接受辅助生殖技术后的优质胚胎率的试剂盒或装置中的用途。

10.预测多囊卵巢综合征患者在接受辅助生殖技术后的优质胚胎率的试剂盒或装置，其中包括测量miRNA-141的表达水平的试剂。