CN113049838A - 多囊卵巢形态阈值和其在诊断多囊卵巢综合征中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的方法。本发明还提供了诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的试剂盒或装置包括蛋白芯片或基因芯片。本发明发现多囊卵巢综合征(PCOS)患者中颗粒细胞中雄激素受体(AR)表达与内分泌因子的关联性，以及这些关联性与多囊卵巢形态(PCOM)表型中每个卵巢含有的卵泡的个数的关系，对多囊卵巢形态(PCOM)的诊断阈值提供了新的标准和分子学依据。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和疾病基因研究和诊断领域。具体的，本发明涉及多囊卵巢综合征(PCOS)的分子分型生物标记物，以及所述生物标记物在诊断多囊卵巢综合征的方法或制备用于诊断多囊卵巢综合征的试剂盒或装置中的应用。
背景技术
多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种在全世界范围都存在的女性内分泌疾病，育龄女性的患病率高达10-15％。由于无排卵，雄激素过多和代谢异常，多囊卵巢综合征可导致不育(1)；其临床表现高度异质，缺乏分子分型。多囊卵巢形态(Polycystic ovarian morphology，PCOM)是PCOS的主要特征之一，是窦前卵泡(pre-antral follicles)和窦卵泡(antral follicles)的募集增加，但无法排卵。由于观察者的不定性和成像技术的改进，现有的对PCOM的诊断阈值定义为平均每个卵巢≥12个窦卵泡(antral follicle)，可能会导致过度诊断。此外，一些研究表明，按照目前诊断阈值，PCOM在正常人群中普遍存在。这些情况导致对PCOM的最佳阈值的持续争论(2-4)。最近发布的国际PCOS指南基于现有形态学证据链，建议将定义改为平均每个卵巢≥20个卵泡 (5)。到目前为止，在对PCOM阈值的讨论中尚未包括分子诊断依据(4、 6)。
大多数患有PCOS的女性患有高雄激素血症。雄激素通过雄激素受体 (androgenreceptor，AR)在各种组织中发挥作用。在完全性雄激素不敏感综合征的患者中发现了AR突变(7)。AR信号通路已被认为是影响卵巢功能的潜在因素，导致在PCOS病人的无排卵。研究发现雄激素受体的 N末端结构域中的(CAG)n多态性三核苷酸重复序列(8)和rs6152基因多态性(9)与PCOS相关。AR在卵泡生长的不同阶段表现出不同的表达模式。AR表达在窦前卵泡和早期窦卵泡的颗粒细胞(GC)中较高，并随着卵泡成熟而降低。这表明AR介导的雄激素可能在卵泡形成过程中发挥作用(10，11)。
有证据表明，AR全敲(ARKO)小鼠表现出生育力低下(12，13)。GC 中缺乏雄激素活性会导致发情周期延长，窦前卵泡和闭锁卵泡(atretic follicles)数量增加、黄体减少和排卵率降低(14，15)。此外，卵泡膜细胞和卵母细胞特异性AR敲除小鼠生育力和卵泡数量均正常(15、16)。但是，总的来说AR在PCOS中的表达水平的研究极少，并且这些研究的结果不一致(17，18)。
因此，本领域需要对多囊卵巢综合征(PCOS)患者中雄激素受体(AR) 的表达及其与多囊卵巢形态(PCOM)表型的关系的更深入的研究，更需要对多囊卵巢综合征的快速诊断，包括以PCOM表型为判断依据的诊断来对PCOS进行更准确的诊断的方法、试剂盒或芯片。
发明内容
本发明首次和意外地发现多囊卵巢综合征(PCOS)患者中颗粒细胞中雄激素受体(AR)表达与内分泌因子的关联性，以及这些关联性与多囊卵巢形态(PCOM)表型中平均每个卵巢含有的卵泡数的关系，对多囊卵巢形态(PCOM)的诊断阈值提供了新的标准和分子学依据。本发明由此提供了通过在受试者样品，特别是具有特定多囊卵巢形态的样品中检测所述雄激素受体(AR)表达水平与内分泌因子水平变化来检测或诊断 PCOS的方法以及用于这些方法的试剂盒或装置(如蛋白芯片或基因芯片)。
具体的，在本发明的一个方面，提供了诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的方法，其中包括以下步骤：(a)检测受试者卵巢中卵泡的个数。如果卵巢中卵泡的个数≥24，则判断受试者具有多囊卵巢形态。
在本发明中，受试者可为灵长类哺乳动物，特别是指人类。卵巢中卵泡的个数是指双侧卵巢的平均卵泡个数。
在本发明的又一个方面，前述诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的方法还包括以下步骤：(b)获得所述卵巢的颗粒细胞，测量颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平。在本发明的方法中，还包括将颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平与正常值(例如某指定人群，例如根据人种、年龄段或身体状态情况划分的人群，的正常状态下的统计值)比较的步骤。如果颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平与正常值比较出现降低，则进一步判断受试者具有多囊卵巢综合征。
雄激素受体(Androgen Receptor,AR)是类固醇激素受体家族的一个成员，分子量约为120000道尔顿(Uniprot:P10275)。雄激素通过与雄激素受体结合而发挥其功能。人的雄激素受体由位于X染色体上的AR基因(HGNC：644) 编码。
在本发明的又一个方面，前述诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的方法还包括以下步骤：(c)测量受试者血清中促黄体激素(LH)的水平；和 (d)测量受试者血清中促卵泡激素(FSH)的水平。比较促卵泡激素(FSH) 和颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平的相关性，以及比较促黄体激素(LH)和颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平的相关性。相关性可通过任何已知的统计学方法中判断两组变量的关联程度的方法进行判断。相关性可以例如pearson,spearman或kendall相关性系数的形式表示。在本发明的其中又一个方面，如果颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平与促卵泡激素(FSH)水平的变化无相关性，以及与促黄体激素(LH)水平的变化呈负相关性，则进一步判断受试者具有多囊卵巢形态。发明人出乎意料地发现在非PCOS患者中发现的AR的表达水平与FSH水平的相关性，以及与LH水平之间的相关性，在FNPO为24的PCOS患者中出现了逆转。
在本发明的另一个方面，提供了诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的试剂盒或装置，其中包括(1)测量颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平的试剂；(2)测量受试者血清中促黄体激素(LH)的水平的试剂；和(3)测量受试者血清中促卵泡激素(FSH)的水平的试剂。在本发明的其中另一个方面，提供了以下试剂在制备用于诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的试剂盒或装置中的用途：(1)测量颗粒细胞中雄激素受体 (AR)的表达水平的试剂；(2)测量受试者血清中促黄体激素(LH)的水平的试剂；和(3)测量受试者血清中促卵泡激素(FSH)的水平的试剂。在本发明的其中一个方面，上述诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的试剂盒或装置中只含有以下试剂：(1)测量颗粒细胞中雄激素受体(AR) 的表达水平的试剂；(2)测量受试者血清中促黄体激素(LH)的水平的试剂；和(3)测量受试者血清中促卵泡激素(FSH)的水平的试剂。发明人出乎意料地发现，在PCOS患者中，AR的表达水平与FSH水平的相关性，以及与LH水平之间的相关性，在特定FNPO阈值下出现了逆转，而其它内分泌因子均未发现显著变化的相关性。
在本发明中，可以使用适用于检测生物样品中的蛋白表达水平的任意技术来测量样品中雄激素受体(AR)的水平，以及可以使用适用于检测生物样品中的蛋白水平的任意技术来测量样品中雄激素受体(AR)/ 促黄体激素(LH)/促卵泡激素(FSH)的水平。用于测定生物样品(例如，细胞，组织)中蛋白的含量或其表达水平的合适技术(例如，印迹分析， RT-PCR，原位杂交等)是本领域技术人员已知的。
在本发明的其中又一个方面，在前述本发明的诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的方法、试剂盒或装置中，所述测量促黄体激素(LH)和/或促卵泡激素(FSH)水平的试剂是免疫测定的试剂，例如是通过特异性识别LH和/或FSH的抗体进行ELISA或蛋白质印迹的试剂。
在本发明的其中又一个方面，在前述本发明的诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的方法、试剂盒或装置中，所述测量雄激素受体(AR)的表达水平的试剂是免疫测定的试剂，例如通过特异性识别雄激素受体(AR) 的抗体进行ELISA或蛋白质印迹的试剂。
在本发明的其中又一个方面，在前述本发明的诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的方法、试剂盒或装置中，所述测量雄激素受体(AR)的表达水平的试剂是检测雄激素受体(AR)的mRNA的存在或其数量的试剂，例如是通过RT-PCR检测样品中编码雄激素受体(AR)的mRNA的量的试剂。
在本发明的其中又一个方面，前述本发明的诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的试剂盒或装置是用于诊断多囊卵巢综合征的基因芯片，其具有检测雄激素受体(AR)的mRNA的引物或探针。在本发明的其中又一个方面，以及其中基因芯片被设置为具有不同分区，分别用于检测具有不同多囊卵巢形态(PCOM)的样品和给出对应的分析结果。在本发明的其中又一个方面，所述不同分区用于检测卵巢中卵泡数目分别为小于24以及大于等于24的样品。在本发明的其中再一个方面，所述不同分区用于检测卵巢中卵泡数目分别为小于19，大于等于19和小于24以及大于等于24的样品。发明人发现在具有不同PCOM表型，特别是卵巢中卵泡数目不同(例如卵巢中卵泡数目分别为小于19，大于等于19 和小于24以及大于等于24)的患者中，雄激素受体(AR)的表达水平与 FSH水平的相关性，以及与LH水平之间的相关性发生变化，其检测和比较结果可以作为分析多囊卵巢综合征的不同参考因素。
在本发明的其中又一个方面，前述本发明的诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的试剂盒或装置是用于诊断多囊卵巢综合征的蛋白芯片，其具有检测雄激素受体(AR)/LH/FSH的特异性抗体(即具有分别用于检测雄激素受体(AR)或LH或FSH的特异性抗体)。在本发明的其中又一个方面，以及其中蛋白芯片被设置为具有不同分区，分别用于检测具有不同多囊卵巢形态(PCOM)的样品和给出对应的分析结果。在本发明的其中又一个方面，所述不同分区用于检测卵巢中卵泡数目分别为小于24 以及大于等于24的样品。在本发明的其中再一个方面，所述不同分区用于检测卵巢中卵泡数目分别为小于19，大于等于19和小于24以及大于等于24的样品。
在本发明的其中又一个方面，前述本发明的诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的试剂盒或装置是用于诊断多囊卵巢综合征的试剂盒。所述试剂盒可包含具有检测雄激素受体(AR)/LH/FSH的特异性抗体。在本发明的其中又一个方面，以及其中试剂盒被设置为具有不同分区，分别用于容纳检测具有不同多囊卵巢形态(PCOM)的样品的雄激素受体 (AR)/LH/FSH的试剂。在本发明的其中又一个方面，所述不同分区用于检测卵巢中卵泡数目分别为小于24以及大于等于24的样品。在本发明的其中再一个方面，所述不同分区用于容纳检测卵巢中卵泡数目分别为小于19，大于等于19和小于24以及大于等于24的样品的所述试剂。
附图说明
图1显示对照组和患有PCOS的女性的颗粒细胞中的雄激素受体(AR) 的表达。数据根据18sRNA的表达量进行归一化(normalization)。(A) PCOS病例(n＝106)和对照妇女(n＝63)中雄激素受体AR的mRNA 的相对表达。(B)在non-tPCOM和tPCOM亚组中AR的mRNA的标准化表达。数据的统计分析采用非参数检验(non-parametric)和two-way ANOVA分析，然后进行Bonferroni检验(**p＜0.01，***p＜0.001)。
图2显示雄激素受体(AR)表达与不同临床特征的相关性。
对照组，非tPCOM组和tPCOM组的AR表达水平与血清FSH和LH水平之间的关系。使用Spearman检验对数据进行统计分析。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例1
患者征集
2015年10月至2016年6月，山东大学生殖医学研究中心共招募了 173名中国妇女。参与者包括106例PCOS病例和67例对照。PCOS的诊断根据鹿特丹标准定义(19)。符合以下两个及以上条件时，诊断为PCOS：少排卵或无排卵，临床和/或生化体征表现为雄激素过多症，多囊卵巢，并排除其他病因(例如先天性肾上腺皮质增生，分泌雄激素的肿瘤， Cushing’s综合征)。对照组女性有规律的月经周期(26-35天)，类固醇激素水平在正常范围内。对照组女性人群的卵巢形态正常，由于输卵管和/或男性不育问题赴IVF中心就诊。
每位患者都签署了书面知情同意书。本研究得到山东大学伦理委员会的批准。
实施例2实验方法
记录所有参与者的人体测量学参数，包括年龄，身高，体重和月经周期。在山东大学生殖医学研究中心的临床实验室采用电化学发光免疫分析法(CLIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量参与者的第3天的血清激素水平，包括促卵泡激素(FSH)，促黄体激素(LH)，雌二醇(E2)，孕激素(P)，睾酮总量(TT)，抗苗勒氏管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)。通过阴道超声评估窦卵泡计数(antral follicle count，AFC)。
卵巢刺激和颗粒细胞的采集
使用了长促性腺激素释放激素激动剂方案(long gonadotropin-releasinghormone agonist protocol)进行卵巢刺激。在黄体中期开始时，向所有参与者注射促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂，并且每1-3天进行一次超声扫描，以检查卵泡发育和血清雌二醇含量。当三个以上的卵泡直径≥18mm时，给予中度绒毛膜促性腺激素(hCG)。 hCG注射后36小时进行超声引导的卵母细胞取出。根据报道的方法(20) 从卵泡液中收集颗粒细胞到无菌试管中，并用Ficoll-Percoll (Solarbio-Life-Sciences，Beijing，China)进行分离。
RNA提取和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Takara Bio Inc.，中国大连)从 GC中提取总RNA，并使用带有gDNA Eraser的Prime Script RT试剂盒 (Takara Bio，Inc.，中国大连)逆转录为cDNA。根据制造商的说明，使用SYBR Premix Ex Taq(Takara Bio，Inc.，中国大连)在LightCycler 480系统上进行qRT-PCR。引物如补充表1所示。管家基因18sRNA用于归一化，雄激素受体的mRNA的相对表达根据2-ΔCt方法计算(21)。
用于扩增雄激素受体(AR)和管家基因18sRNA的引物序列如下：
统计分析
使用SPSS 20.0分析数据。使用Kolmogorov-Smirnov检验评估数据分布，以确定连续变量是否呈正态分布。异常分布数据被转换为正态分布。学生t检验用于确定PCOS病例与对照组之间的基线特征的统计学显著性。根据Dewailly(4)提出的PCOM阈值标准，将PCOS病例分为非真PCOM(non-tPCOM，平均每个卵巢<19个卵泡)和真PCOM(tPCOM，平均每个卵巢≥19个卵泡)。进行了two-way ANOVA分析，然后进行 Bonferroni和Dunnett-T3检测，以比较对照组，non-tPCOM和tPCOM组。使用Spearman检验进行AR表达与内分泌参数的关联分析。在AR表达与不同卵泡数目的关联分析中，PCOS病例分为非PCOM和PCOM亚组。p <0.05被认为具有统计学意义。
实施例3受试者基线表征
从67个对照和106个PCOS病例中收集颗粒细胞(GC)。参与者的年龄在20至35岁。结果如下表1所示。
表1测试者(对照组、PCOS和亚群)的人体表征参数、生化和激素水平
数值为平均值±标准偏差
non-tPCOM:平均每个卵巢卵泡数<19
tPCOM:平均每个卵巢卵泡数≧19
*与对照组比较，p＜0.05
经过对PCOS患者与对照组之间的人体参数，生化和内分泌参数的比较，结果显示，与对照组相比，PCOS患者的BMI，血清LH，孕激素，睾酮总量(TT)和AMH以及AFC较高；血清FSH明显降低(p<0.05)；年龄和血清雌二醇水平无明显差异(p>0.05)。
实施例4对照组和PCOS病例的颗粒细胞中的雄激素受体(AR)的表达
qRT-PCR分析显示，与对照组相比，PCOS患者的AR的mRNA表达明显降低(p<0.0001；图1A)。为了研究AR与PCOM表型的关系，根据Dewailly(4)提出的PCOM阈值标准，即平均每个卵巢19个卵泡的阈值，将PCOS病例分为两个亚组：非真PCOM(non-tPCOM，每个卵巢 <19个卵泡)和真PCOM(tPCOM，每个卵巢≥19个卵泡)。
结果显示，tPCOM组PCOS中AR的表达低于对照组(p<0.001)和 non-tPCOM组(p<0.05；图1B)。
研究了AR表达与亚组临床特征的关系。相关分析表明，对照组和 non-tPCOM组(r＝0.238；p＝0.025；图2)中AR的表达与血清FSH水平呈正相关(r＝0.303；p＝0.016；图2)，但在tPCOM组中无显着相关性 (r＝-0.273；p＝0.228；图2)。同时，仅在tPCOM组中，AR表达与血清LH 水平呈负相关(r＝-0.515；p＝0.034；图2)。AR表达与其他内分泌因素之间未发现相关性(表2)。
表2非PCOM和PCOM亚群中AR表达和患者年龄、血清E2,P,TT和AMH水平直接的Spearman相关系数
*根据Spearman相关方法分析的显著相关性
FNPO:平均每个卵巢中卵泡个数
发明人还研究了PCOS中AR表达与不同数量卵泡的相关性。在non-tPCOM亚组中，在阈值为平均每个卵巢24个卵泡时，AR表达与血清FSH水平之间的显著相关性消失，并且随着阈值的增加，相关系数逐渐降低。而在PCOM组中，AR表达与血清FSH水平之间无显着相关性。同时，在平均每个卵巢24个卵泡的阈值，PCOM组中AR表达与血清LH水平之间的关系不显著(表2)。在所有组别中均未发现其它显著变化的相关性(表3)。
表3非PCOM和PCOM亚群中AR表达和血清FSH和LH水平的Spearman相关系数
*根据Spearman相关方法分析的显著相关性
FNPO:平均每个卵巢中卵泡个数
发明人发现PCOS患者颗粒细胞(GC)中雄激素受体(AR)的表达显著降低，尤其是在平均每个卵巢具有大于19个卵泡的真PCOM(tPCOPM) 亚组中。在平均每个卵巢具有小于19个卵泡的PCOS-非真PCOM病例和对照组中，AR表达与血清FSH水平的相关性相似。相反，AR表达与血清 FSH水平的相关性在真PCOM组表现出与非真PCOM病例和对照组完全不同的模式。
类似的，AR表达与血清LH水平的相关性在真PCOM组表现出与非真 PCOM病例和对照组完全不同的模式。仅在tPCOM组中，AR表达与血清LH水平呈负相关。
同时，发明人还首次和意外地发现，在平均每个卵巢24个以上卵泡的亚组中，AR的表达水平与FSH水平以及与LH水平之间的相关性消失了。在前面的实验中，基于现有的判断标准(Dewailly(4))，以平均每个卵巢19个以上卵泡为阈值将PCOS患者样品分为tPCOM组和non-tPCOM组，在这个分组下发现AR表达降低与内分泌因子存在相关性；而发明人出乎意料地发现这些AR的表达水平与FSH水平以及与LH水平之间的相关性在FNPO为24的时候消失。这证明了平均每个卵巢24个以上卵泡是比平均每个卵巢19个以上卵泡更合适用于界定PCOM的阈值。
以上对颗粒细胞中AR表达与内分泌因子的关系的重要发现，对用于多囊卵巢综合征(PCOS)的诊断，特别是PCOM的诊断阈值提供了新的标准和分子学依据。本发明由此提供了用于诊断多囊卵巢综合征的方法和相关试剂盒或装置。
上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。
如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。
本专利说明书中提到的参考文献包括在以下参考文献中，并通过全文引用在本申请中进行公开。
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Claims (10)
1.诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征的方法，其中包括以下步骤：(a)检测受试者卵巢中卵泡的个数，
如果卵巢中卵泡的个数≥24，则判断受试者具有多囊卵巢形态。
2.权利要求1的方法，其中还包括以下步骤：(b)获得所述卵巢的颗粒细胞，测量颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平；
如果颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平与正常值比较出现降低，则进一步判断受试者具有多囊卵巢综合征。
3.权利要求2的方法，其中还包括以下步骤：(c)测量受试者血清中促黄体激素(LH)的水平；和(d)测量受试者血清中促卵泡激素(FSH)的水平，
比较促卵泡激素(FSH)和颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平的相关性，以及比较促黄体激素(LH)和颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平的相关性，
如果颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平与促卵泡激素(FSH)水平的变化无相关性，以及与促黄体激素(LH)水平的变化呈负相关性，则进一步判断受试者具有多囊卵巢形态。
4.用于诊断多囊卵巢综合征的试剂盒或装置，其中包括(1)测量颗粒细胞中雄激素受体(AR)的表达水平的试剂；(2)测量受试者血清中促黄体激素(LH)的水平的试剂；和(3)测量受试者血清中促卵泡激素(FSH)的水平的试剂。
5.权利要求4的试剂盒或装置，其中所述测量雄激素受体(AR)的表达水平、测量促黄体激素(LH)水平和测量促卵泡激素(FSH)水平的试剂是免疫测定的试剂，例如通过特异性识别LH和/或FSH的抗体进行ELISA或蛋白质印迹的试剂。
6.权利要求5的试剂盒或装置，其为用于诊断多囊卵巢综合征的蛋白芯片，其具有检测雄激素受体(AR)/LH/FSH的特异性抗体，以及其中基因芯片被设置为具有不同分区，分别用于检测具有不同多囊卵巢形态(PCOM)的样品和给出对应的分析结果。
7.权利要求6的试剂盒或装置，其中所述不同分区用于检测卵巢中卵泡数目分别为小于19，大于等于19和小于24以及大于等于24的样品。
8.权利要求4的试剂盒或装置，其中所述测量雄激素受体(AR)的表达水平的试剂是检测雄激素受体(AR)的mRNA的存在或其数量的试剂，例如是通过RT-PCR检测样品中编码雄激素受体(AR)的mRNA的量的试剂。
9.权利要求8的试剂盒或装置，其为用于诊断多囊卵巢综合征的基因芯片，其具有检测雄激素受体(AR)的mRNA的引物或探针，以及其中基因芯片被设置为具有不同分区，分别用于检测具有不同多囊卵巢形态(PCOM)的样品和给出对应的分析结果。
10.权利要求9的试剂盒或装置，其中所述不同分区用于检测卵巢中卵泡数目分别为小于19，大于等于19和小于24以及大于等于24的样品。
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