CN104263815A - 一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因及其应用 - Google Patents

一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104263815A
CN104263815A CN201410421408.6A CN201410421408A CN104263815A CN 104263815 A CN104263815 A CN 104263815A CN 201410421408 A CN201410421408 A CN 201410421408A CN 104263815 A CN104263815 A CN 104263815A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
seq
prognosis
sample
breast cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410421408.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104263815B (zh
Inventor
邵志敏
黄晓燕
徐晓晶
孙冰玉
赵莹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Biotechnology Corp
Fudan University Shanghai Cancer Center
Original Assignee
Shanghai Biotechnology Corp
Fudan University Shanghai Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Biotechnology Corp, Fudan University Shanghai Cancer Center filed Critical Shanghai Biotechnology Corp
Priority to CN201410421408.6A priority Critical patent/CN104263815B/zh
Publication of CN104263815A publication Critical patent/CN104263815A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104263815B publication Critical patent/CN104263815B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因及其应用，该组基因包括：基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67。该组基因的应用包括：用于激素受体阳性乳腺癌预后的多重平行检测液相基因芯片、用于激素受体阳性乳腺癌预后的试剂盒和用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因的评价系统。通过对基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的液相基因芯片检测可大大减少病理科医生大量读片、判片的工作，同时解决病理上可疑的读片结果，而且准确性与IHC相当，具有更高效、更灵敏并行检测易操作等优点。

Description

一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因及其应用
技术领域
本发明涉及基因及其应用，特别是涉及一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因及其应用。
背景技术
乳腺癌是全球女性最为常见的恶性肿瘤和死亡原因。随着我国经济的发展和生活方式的改变，国内特别是发达城市的乳腺癌的发病率呈现出快速上升趋势(以每年5％的速度上升)，年新发病人数接近18万。在上海等特大城市，乳腺癌已经跃居女性恶性肿瘤发病率之首。由于目前民众筛查意识的提高以及诊疗水平的提高，乳腺癌的死亡率随之下降，早期乳腺癌的5年存活率高达90％。
激素受体阳性的乳腺癌占总乳腺癌的70-80％，具有较好的临床预后，但是在这些病理分期早期的患者中，仍有一部分患者会在手术后很短时间内复发转移。虽然乳腺癌的临床病理特征:乳腺癌肿块的大小，肿瘤的核分级，淋巴结是否转移以及转移的个数等对预后都起到了举足轻重的作用,但是这些单个的因素又不能起到对于总体乳腺癌的预测作用。近年来，更有一些研究揭示，即使在乳腺癌治疗后5年后，乃至10年后会出现局部复发或远处转移。目前的乳腺癌对于预测乳腺的远处复发风险数据仍不充分。随着21世纪医学模式的革命性变化，生物领域的新技术(生物芯片，生物信息学)和新的研究方法(功能基因组学、蛋白组学)在临床中的应用，更新了乳腺癌治疗的科学基础。医疗实践从原来经验性医学向循证医学过渡，从基因，蛋白质等大分子水平研究疾病的发病机制，乳腺癌的治疗目标向特异性诊断，个体化治疗发展。伴随后基因组时代高通量组学技术的涌现与生物信息学的飞速发展，大量潜在的生物标记和这些标记的模式，可用于乳腺癌等级和分期的重新定义，以区别于临床的少数标记物所组合的分期分级。
国外已上市的比较成熟的两个基因芯片分别是：Oncotype DX，Mammaprint。Oncotype DX针对的是luminal型的绝经后乳腺癌的预后判断，一共选择了16个重要的基因和5个内参基因，根据不同的打分标准可以为luminal型的乳腺癌判断预后以进一步指导用药。但是Oncotype DX使用的是比较复杂的RT-PCR的技术，需要提取RNA，反转录的过程比较复杂，会减少其效率，同时其适用范围为绝经后乳腺癌患者，与我国年轻化乳腺癌国情不符，并不能很好的为中国人群服务。而Mammaprint有70个基因可以将患者分为高危和低危风险组，对于乳腺癌重要的分子分型并没有限制。由于其存在过多的未知功能的基因，在分析效率和实际运用都有很大的限制，广泛推广运用限制较大。而且Mammaprint需要的样本在临床上获取较难，需要新鲜冻存的标本，临床实用性欠佳，同时尚无法直接运用到中国人群中。
其中，关于基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67，其分别编码的蛋白为ER、PR、HER2和Ki67，它们的临床意义如下：
1)基因ESR1：ER雌激素受体α的编码基因，其编码的蛋白是乳腺癌中最为重要的蛋白。它可以形成二聚体，参与了乳腺癌，子宫内膜癌，骨质疏松等病理过程。在浸润性乳腺癌肿ER蛋白的表达达到73-75％。ESR1的mRNA的低表达被认为与雌激素受体阳性乳腺癌的三苯氧胺耐药相关。
2)基因PGR：PR孕激素受体蛋白的编码基因，在子宫内膜癌和乳腺癌参与其病理过程。PR在浸润性乳腺癌中表达率为55-58％。与ER一样，PR被认为是对内分泌治疗的预测因子以及雌激素受体阳性乳腺癌的预后因子。和ER相比，有些研究认为PR的重要性略输于ER，有的则认为PR是独立的预后因素。
3)基因ERBB2：酪氨酸激酶受体家族中成员HER2的编码基因。HER2蛋白本身并无配体，和外源性配体结合以后，可以激活HER2的酪氨酸激酶，同时可以激活PI3K-AKT-mTOR的细胞生存通路，RAS-RAF-MEK-ERK的细胞增殖的通路。乳腺癌中ERBB2过表达率为18-20％。ERBB2的过表达不但是预测因素，同时也是预后因素。在激素受体阳性乳腺癌中，ERBB2的过表达，明显降低了患者的无复发生存时间。针对ERBB2过表达，目前已经有曲妥珠单抗等靶向药物。
4)基因MKI67：编码Ki67蛋白，与细胞的增殖相关，与线粒体RNA的转录相关。Ki67蛋白在G1、S、G2和有丝分裂期发现表达，在G0不表达。是一个预后相关的因子。
虽然，国外的Cuzick研究发现ER、PR、HER2和Ki67的组合使用与Oncotype DX具有相同的效率，它们使用荧光显微镜对已经制作好的组织芯片进行荧光染色，同时对染色结果用比较复杂的H-score进行评分，然后根据评分判断预后。荧光染色的步骤比较复杂，同时荧光显微镜价格昂贵，H-score的评分系统复杂，需要专业的病理学家的大量工作。
在目前临床工作中，根据ER、PR、HER2和Ki67，其评判工作的指南更新很频繁，特别是对于临界状态的评判工作是病理科医生的难点，通常需要大量的时间和人力。这四个因子的表达又会对临床工作起到了指导作用，使病理科医生在判定时尤为困难。病理科医生的学习曲线时间较长。
鉴于我国乳腺癌发病的特点，发病年龄较国外人群年龄偏低，有很大一部分病人处于绝经前。国外已有的基因表达谱数据不能直接用于中国乳腺癌。因此，急需开发一种更加实用、简便且快速的用于检测乳腺癌预后的基因的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因及其应用。本发明通过以蛋白ER、PR、HER2和Ki67为基础，同时结合乳腺癌预后相关基因群的结果，通过优化组合，尽可能的减少基因数目，获得符合中国人群的相关基因表达谱，更具有临床实用性、更高效、灵敏、易操作、准确等优点。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因，其包括：基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67。该基因的组合能对中国人群的乳腺癌患者在手术后5年内复发和不复发的情况进行预后和分类，以便及时地进行干预，有效指导临床治疗。
因此，针对本发明的基因组，可提供一系列的应用，如包括：以下的用于激素受体阳性乳腺癌预后的多重平行检测液相基因芯片、用于激素受体阳性乳腺癌预后的试剂盒和用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因的评价系统等。
本发明的第二方面，提供一种用于激素受体阳性乳腺癌预后的多重平行检测液相基因芯片(该芯片是针对上述基因组进行检测的，以便检测基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67)，包括探针；其中，所述探针包括下列三组核苷酸序列之一：
(1)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列；
(2)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列中的每条序列的互补链；
(3)与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的序列中的每条序列有至少70％同源性的序列。
所述芯片还包括：SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示序列的探针。
本发明的第三方面，提供一种用于激素受体阳性乳腺癌预后的试剂盒，包括下列三组核苷酸序列之一的探针：
(1)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列；
(2)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列中的每条序列的互补链；
(3)与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的序列中的每条序列有至少70％同源性的序列。
所述试剂盒还包括：SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示序列的探针。
另外，该试剂盒还可包括用于检测基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的其他相应试剂。
本发明的第四方面，提供一种用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因的评价系统，利用该评价系统可根据患者乳腺癌原发病灶的多重平行定量检测结果并通过模块的方式进行评分，评分的高低判断乳腺癌患者的预后的好坏，即分数越高，其复发转移的风险高，预后差；分数越低，其复发转移的风险低，预后好。
该评价系统包括：幂函数模块和线性函数模块；
其中，幂函数模块，用于根据上述基因芯片测得的样本的基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的各自表达量，放入Cox回归，并通过预后情况以及每个患者从手术到出现复发转移的时间，得到每个基因表达量在幂函数中所得到的权重，将其作为底数，每个基因的表达量作为幂指数，将四个基因相加获得的分数通过受试者工作特征曲线(ROC)的最佳的临界值(cutoff)，能将样本分为预后好和预后差两组；
线性函数模块，用于通过二分类logist回归方法，将根据上述基因芯片测得的样本的基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的表达量计算其分别的权重，同时将权重与基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的各自表达量相乘，获得分数，通过受试者工作特征曲线(ROC)的最佳的临界值(cutoff)，能将样本分为预后好和预后差两组。
上述评价系统，还包括免疫组化模块，其用于将根据样本的基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67所表达的蛋白量作为上述幂函数模块和线性函数模块中的基因表达量，从而获得免疫组化的幂函数和线性函数，其中对蛋白Ki67的读数取常数e为底数的对数，即进行lnKi67，以用于判断预后。
通过多重平行定量检测技术(即对基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的液相基因芯片检测)，可以很好的对激素受体阳性的中国乳腺癌患者进行区分预后，筛选出预后好的患者。通过配对的组织标本，通过多重平行定量检测，同时检测了四个因子的mRNA的表达量，通过两种不同的数理模型，分别与临床诊断的金标准免疫组化进行对比，从诊断的准确性而言，无论是新鲜冻存标本，还是石蜡切片标本均无明显差异，与免疫组化准确性相当。同时通过幂函数的数理模型得到的石蜡切片的多重平行定量检测四因子结果，无论在重复抽样的内验证还是通过独立标本的外验证，对于预后的判断比常规的免疫组化更优，更稳定。更好的为激素受体阳性乳腺癌预后以及个体化治疗提供直观的依据。同时由于使用Branched DNA放大信好探针，检测可以更灵敏，同时更为直观的看到四个因子之间的表达差异。
多重平行定量检测不但能够获得等效的结果，同时操作简单，可以批量的检测，一次可以同时测四个因子，每次96个板孔，每个板孔可以同时进行4个因子的检测和读值，从石蜡切片开始以最大的耗时计算需要30个自然时。复旦大学附属肿瘤医院病理科是全国质检中心，拥有最先进的自动化免疫组化染色机器，即便如此，一台机器每次只能做三十张染色片子，每次需要3个小时，同时以每因子需要5分钟的最快速度评判，需要两次复核，不计算石蜡切片的时间，仅从染色到读出结果，96例患者的四因子检测的最少耗时为54个自然时。同时病理科医生的免疫组化的学习曲线时间较长，差异较大。通过对基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的多重平行定量检测(液相基因芯片检测)可以大大减少病理科医生大量读片、判片的工作，同时解决病理上可疑的读片结果，而且准确性与IHC相当，具有更高效、更灵敏并行检测易操作等优点。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是实施例中的数据处理流程示意图；
图2是IHC4_P模型的Kaplan-Meier曲线，其中，P值＝0.025；
图3是IHC4_L模型的Kaplan-Meier曲线，其中，P值＝7.445×10-6；
图4是FF4_P模型的Kaplan-Meier曲线，其中，P值＝0.004；
图5是FF4_L模型的Kaplan-Meier曲线，其中，P值＝0.05；
图6是FFPE4_P模型的Kaplan-Meier曲线，其中，P值＝0.038；
图7是FFPE4_L模型的Kaplan-Meier曲线，其中，P值＝2.70×10-5；
图8是新鲜冻存标本四因子的聚类分析图；
图9是石蜡切片标本四因子的聚类分析图。
具体实施方式
本实施例以中国乳腺癌人群为研究对象，以乳腺癌病理组织为样本，以多重平行检测液相基因芯片工具，进行中国人群乳腺癌分型、个体化用药指导。
其中，以下试验中所用的试剂如未特别说明，则为商业化试剂。
(一)样本收集和临床信息采集：
收集中国乳腺癌人群回顾性样本，采集临床信息，临床信息包括：治疗方案选择、完整临床病史、组织病理分型、组织学分级、有无脉管浸润、淋巴结情况、激素受体情况、免疫组化指标、治疗情况、随访资料等，并建立数据库。收集了从2006年至今的新鲜冻存的乳腺癌组织标本，均为手术之前未接受过任何治疗的标本，新辅助化疗的病例被排除，所有的病例术后的病理学检测均为淋巴结转移少于等于3个转移的可手术乳腺癌。选择的病例为明确出现局部复发或原处转移的标本。局部复发的患者具有细胞学明确诊断的。远处转移的患者多发的仅通过影像学确定，单发的需要病理学确诊。
一共挑选出103例的新鲜冻存和对应的石蜡切片的标本。这103例标本随机分为两组，其中，53例标本作为训练集(训练集中预后好21例，预后差32例)，50例标本作为验证集(验证集中预后好15例，预后差35例)。
(二)对于103例标本重新进行免疫组化ER、PR、HER2和Ki67的判读。标准如下：
ER和PR抗体使用商用的抗体，Dako(克隆号ER 1D5 1:35和PR 636 1:50)。ER和PR阳性的评判标准是乳腺癌核细胞阳性>1％。两个独立的病理科医生共同评判ER和PR的阳性，同时给予ER和PR半定量的免疫组化结果。细胞核阳性<1％ 0分(0)，1％-10％被评为1分(1+)，阳性在11％-50％被评为2分(2+)，大于51％被评为3分(3+)。
对于HER2阳性的判定我们使用的是单克隆抗体(Dako，克隆号PN2A 1:400)，HER-2阳性需要是肿瘤细胞细胞膜阳性，阳性比例超过10％。HER2也进行0到3+的半定量的评判，需要根据膜染色强度。0分(0)认为是没有染色；1分(1+)被认为是染色强度弱，细胞膜染色不完整；2分(2+)细胞膜染色强度弱到中等，至少染色比例超过10％；3分(3+)染色强度均匀一致，超过30％的比例)。在研究中，HER2免疫组化3+被认为是HER2有扩增，2+的结果需要根据HER2/neu基因扩增FISH检查的结果进一步判定。Ki67(Dako，克隆号MIB-1)，根据Ki67工作组的标准进行判读，直接判断其核染色的百分比。
(三)多重平行定量检测技术标本的准备，可按常规的实验手册所述的条件进行，具体可如下。
1)石蜡包埋切片组织匀浆液的制备
1.测量玻片上组织的面积，取5片玻片用干净的刮刀将玻片上的FFPE样本(石蜡切片样本)刮入1.5mL的离心管中。按照下表1加入相应体积的匀浆液和蛋白酶K(10mg/mL)。其中，匀浆液来自商业化试剂盒(Quantigene multiplex assay kit)。
表1 匀浆液和蛋白酶K的用量
组织面积(mm2) 匀浆液(μL) 蛋白酶K体积(μL)
25-100 300 3
100-225 600 6
>225 900 9
2.短暂地漩涡震荡样本后，将样本置于65±1℃水浴6小时，期间每过一个小时漩涡震荡1min。
3.室温下最大速度离心样品5min，沉淀细胞碎片，然后将匀浆液转移至新的离心管中，避免石蜡和碎片残留，如有必要重复操作来去掉碎片。
4.立即使用组织匀浆液或保存于-80℃冰箱中。
2)新鲜冻存组织的匀浆液的制备
1.新鲜组织从-80℃、液氮中或RNAlater保存液中取出后，快速于天平上称取适当组织重量(RNAlater中取出，需用吸水纸将液体吸干净)。
2.将组织置于2mL含2颗钢珠的离心管中，按照每5mg组织需要300μL匀浆溶液和3μL蛋白酶K(10mg/mL)的量添加匀浆液和蛋白酶K，漩涡震荡。
3.将离心管置于组织震荡破碎仪中，25赫兹处理1分钟。
4.如还有可见组织块，重复步骤3。
5.将离心管置于离心机中短暂离心后，65±1℃孵化匀浆样品30min。每隔10min漩涡震荡1min。
6.1600×g离心样品15min，沉淀细胞碎片，将上清液转移到新的离心管中，重复此步骤一次。
7.立即使用组织匀浆液或保存于-80℃冰箱中。
3)样本多重平行定量检测(液相基因芯片)实验步骤
1.将所需试剂从冰箱取出，置于室温融化平衡10min。组织匀浆液，如果是冷冻的，首先将其从-80℃冰箱取出并室温融化之后，置于37±1℃30分钟。孵育后，振荡混匀样本。放置于室温中。
2.将Lysis Mixture置于37±1℃水浴预热30分钟，并轻柔混匀。
3.根据所用样本数，结合下表2中所列配制工作液。
表2 工作液的组分
其中，上述组分中的Lysis Mixture、Blocking Reagent、Proteinase K和Capture Beads来自商业化的试剂盒(Quantigene multiplex assay kit)。
2.0Probe Set(SEQ ID NO.1-12所示的探针)中所涉及的探针为针对基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的捕获探针和杂交探针以及内参基因(ACTB和PPIA)的捕获探针和杂交探针(表3)。其中，每种探针的浓度为1μg/mL。
表3 探针
4.在96孔杂交板上，每孔加入60μL工作液以及40μL相应的样本(上述石蜡包埋切片组织匀浆液或新鲜冻存组织的匀浆液)，覆膜后，54±1℃600rpm振荡避光杂交18-22小时。
5.杂交完毕后，将杂交板中的液体，转入相应的磁力分离板的对应孔中。
6.将磁力分离板置于手持磁力架上。每个反应孔加入洗涤缓冲液(来自Quantigene multiplex assay kit)100μL洗涤20s，重复三次。
7.加入预扩增工作液(来自Quantigene multiplex assay kit)100μL，覆膜后，50±1℃600rpm振荡避光温浴1小时。
8.重复步骤6。
9.加入扩增工作液(来自Quantigene multiplex assay kit)100μL，覆膜后，50±1℃600rpm振荡避光温浴1小时。
10.重复步骤6。
11.加入Label Probe工作液(来自Quantigene multiplex assay kit)100μL，覆膜后，50±1℃600rpm振荡避光温浴1小时。
12.重复步骤6。
13.加入SAPE工作液(来自Quantigene multiplex assay kit)100μL，覆膜后，室温600rpm振荡避光温浴0.5小时。
14.将磁力分离板置于手持磁力架上，每个反应孔加入SAPE洗涤缓冲液(来自Quantigene multiplexassay kit)100μL洗涤20s，重复三次。
15.加入130μL SAPE洗涤缓冲液(来自Quantigene multiplex assay kit)于每个反应孔中，800rpm振荡1分钟后，置于Bioplex100液体芯片分析系统，读取荧光值数据。
多重平行定量检测同时进行新鲜冻存组织和石蜡标本的检测。新鲜冻存的标本直接术后从病理大标本中获得，放入液氮罐中，然后放在零下80℃的冰箱中冻存。所有石蜡标本是储存在病理科，根据新鲜冻存乳腺癌组织标本进行挑选的，挑选的石蜡标本都是经过病理科高年资的医生重新复读HE染色切片，保证所选择的石蜡标本是所有标本中，恶性肿瘤所占比例最高，同时至少满足50％的要求。对于不满足的标本予以剔除。
(四)多重平行定量检测(液相基因芯片)技术进行四因子检测
通过Bioplex100液体芯片分析系统读取上述检测得到的相关基因的荧光值，并用内参基因(ACTB和PPIA)的几何平均值对每个待测基因进行均一化分析，以得到每个样本每个基因的表达量。
(五)数据处理：
通过两种不同的模型对训练集中激素受体阳性患者的预后进行建模。将已有的标本病例随机分为两组，一组为训练集(训练集53例)，一组作为独立的验证集(验证集50例)。
·幂函数的方法是将每个基因的表达量，放入Cox回归，通过训练集中已知的预后的情况(即有无复发转移的情况)以及每个患者从手术到出现复发转移的时间，得到每个基因表达量在幂函数中所得到的权重，将其作为底数，每个基因的表达量作为幂指数，将四个基因相加获得的分数通过受试者工作特征曲线(ROC)的最佳的临界值(cutoff)，将训练集分为预后好和预后差两组。
·线性函数是通过二分类logist回归方法，将四个因子的表达量计算其分别的权重，同时将权重与四个因子的表达量相乘，获得分数，通过受试者工作特征曲线(ROC)的最佳的临界值(cutoff)，将训练集分为预后好和预后差两组。
·将免疫组化半定量的结果作为表达量直接代入公式，同时由于Ki67的分布不完全符合正态分布，对其读数取常数e为底数的对数(自然对数)，即进行lnKi67，使lnKi67更符合正态分布，通过优化，得到免疫组化四个因子两种数理模型的IHC4_L(免疫组化四因子_线性函数)，IHC4_P(免疫组化四因子_幂函数)
·多重平行定量检测技术通过Bioplex100液体芯片分析系统读取相关基因的荧光值，并用内参基因的几何平均值对每个待测基因进行均一化分析，以得到每个样本每个基因的表达量。对于使用新鲜冻存标本获得的四因子结果分别用FF4_L(新鲜冻存标本多重平行定量检测_线性函数)、FF4_P(新鲜冻存标本多重平行定量检测_幂函数)。使用石蜡切片标本获得的四因子结果用FFPE4_L(石蜡切片标本多重平行定量检测_线性函数)、FFPE4_P(石蜡切片标本多重平行定量检测_幂函数)。
·由于将同样的训练集建立模型，所有的单因素生存分析及多因素生存分析均使用重复抽样(Bootstrapping)1000次进行内部验证。
·独立验证集进行外部验证。
·Kaplan-Meier生存分析进行分组因素水平间的线性趋势检验。
·运用Cluster3.0以及JavaTree view将多重平行定量检测的四因子进行了聚类分析。
·所有的研究结果都以P值<0.05认为具有统计学差异。
(六)研究结果
1、多重平行定量检测新鲜冻存标本和石蜡标本中ESR1、PGR、ERBB2和MKI67和免疫组化中相对蛋白的对应关系。将103例常规病理科半定量性质的免疫组化结果进行赋值，同多重平行定量检测的标准化后的mRNA定量读值进行比较，发现有较好的一一对应关系。尤其是在石蜡切片中的结果较新鲜冻存标本的结果更好(表4)。
表4 配对标本多重平行定量检测与免疫组化半定量结果之间的一一对应结果
注：*95％可信区间是从1000次重复抽样中获得
ER为蛋白，其对应的基因为ESR1；
PR对应的基因为PGR；
HER2对应的基因为ERBB2
Ki67对应的基因为MKI67；
左侧为蛋白的半定量结果，右侧分别为多重平行定量检测结果的读值的平均值，P值代表各组间平均值的是否具有统计学差异，P值小于0.05代表有差异。
2、通过训练集的53例标本的生存信息以及免疫组化的结果以及多重平行定量检测的结果，利用两种不同的数理模型，对在新鲜冻存标本中的四因子的结果和石蜡切片检测出的四因子的结果建立模型，模型的结果如下：
1)IHC4_P＝0.882ER+0.929PR+1.212HER2+1.514lnKi67
2)IHC4_L＝-0.287*ER+0.024*PR+0.869*HER2+1.164*lnKi67-0.645
3)FFPE_P＝0.305ESR1+1.248PGR+1.007ERBB2+1.805MKI67
4)FFPE_L＝-1.173*ESR1-0.081*PGR+0.108*ERBB2+0.281*MKI67+0.281
5)FF4_P＝0.191ESR1+0.111PGR+0.888ERBB2+0.240MKI67
6)FF4_L＝–2.871*ESR1-3.039*PGR-0.085*ERBB2-1.892*MKI67+2.948
其中，上述1)-2)是免疫组化的结果，3)-4)是石蜡切片的结果，5)-6)是新鲜冻存标本的结果。1)～6)中，ER表示ER的蛋白量，PR表示PR的蛋白量，HER2表示HER2的蛋白量，Ki67表示Ki67的蛋白量；ESR1表示利用多重平行定量检测(液相基因芯片)得到的ESR1基因的表达量，PGR表示利用多重平行定量检测(液相基因芯片)得到的PGR基因的表达量，ERBB2表示利用多重平行定量检测(液相基因芯片)得到的ERBB2基因的表达量，MKI67表示利用多重平行定量检测(液相基因芯片)得到的MKI67基因的表达量。
另外，训练集中这六个模型的曲线下面积(AUC)-受试者工作特征曲线(ROC)从0.658-0.778不等(表5)，将免疫组化的结果建立的模型作为金标本，这六个模型的受试者工作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)的结果之间无明显差异(表6)。
其中，表6中，单因素生存分析和多因素生存分析可按照常规的方法进行，具体可如下：
单因素生存分析：就是把六个模型分别作为一个因素，和患者的预后情况(预后好，预后坏)以及无复发生存时间进行COX回归检验，如果P值小于0.05，说明这个模型(这个因素)是与预后相关的因素；
多因素生存分析：在研究中，其他的一些临床病理学资料(如月经状态，有无绝经，肿瘤的大小，核分级)在单因素生存分析中都是与预后相关的因素，把这些临床病理学资料和六个模型中的一个分别同时放入COX回归中，P值如果小于0.05，那么这个因素就是独立的预后相关因素。在研究中，经过训练集和验证集以及重复抽验的内、外部检验，FFPE_P是最为稳定的独立的预后因素。
表5 免疫组化和多重平行定量检测在训练集和验证集中受试者工作特征曲线下面积
注：IHC4_L(免疫组化四因子_线性函数)
IHC4_P(免疫组化四因子_幂函数)
FF4_L(新鲜冻存标本多重平行定量检测_线性函数)
FF4_P(新鲜冻存标本多重平行定量检测_幂函数)
FFPE4_L(石蜡切片标本多重平行定量检测_线性函数)
FFPE4_P(石蜡切片标本多重平行定量检测_幂函数)
受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)，又称为感受性曲线(sensitivity curve)
ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式(cutoff)，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线。
ROC曲线越靠近左上角，试验的准确性就越高。最靠近左上角的ROC曲线的点是错误最少的最好cutoff，其假阳性和假阴性的总数最少。
在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。
表6
表6(续)
表6(续)
表6(续)
表6中，符合含义如下：
IHC4_L(免疫组化四因子_线性函数)
IHC4_P(免疫组化四因子_幂函数)
FF4_L(新鲜冻存标本多重平行定量检测_线性函数)
FF4_P(新鲜冻存标本多重平行定量检测_幂函数)
FFPE4_L(石蜡切片标本多重平行定量检测_线性函数)
FFPE4_P(石蜡切片标本多重平行定量检测_幂函数)
P值小0.05具有统计学差异。
将曲线下面积(AUC)-受试者工作特征曲线(ROC)所获得的临界点(cutoff)在独立的验证集中进行验证，曲线下面积(AUC)-受试者工作特征曲线(ROC)从0.718到0.820不等(表5)，验证集中受试者工作特征曲线(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)结果与标准的免疫组化结果相比无明显的差异。
3、将免疫组化的结果IHC4_P、IHC4_L作为金标准，连同FFPE4_P、FFPE4_L、FF4_P、FF4_L作为一个独立的预后因子，将训练集53例标本进行了单因素的回归分析，这四个因子的组合六个模型都是和无复发生存时间相关的预后因子。经过了1000个标本的重复抽验(Bootstrapping)和独立验证集(50例标本)的外部验证后，在单因素生存分析中，FF4_P和FFPE4_P仍是稳定的具有统计学差异的预后因子(表6)。
4、将这四个因子组合的六个模型和其他临床中与预后相关绝经状态、淋巴结转移的数目、肿瘤的大小一起放入多因素回归分析，这六个模型是独立的预后因子。同样经过内部验证和独立外部验证后，FFPE4_P是最为稳定的具有显著统计学差异的独立预后因子(表6)。
5、通过曲线下面积(AUC)-受试者工作特征曲线(ROC)获得的不同的临界点(cutoff)，把训练集中高于临界点(cutoff)的分值以及低于临界点(cutoff)的分值分为两组，同时把训练集临界点(cutoff)作为验证集的临界点(cutoff)将验证集分为高低两组用Kaplan-Meier生存分析的方法进行分组因素水平间的线性趋势检验，均可以训练集和验证集中分数高低两组之间地线性趋势差异，P值具有统计学差异(图2-7)。
其中，图2-7中，用训练集ROC曲线中最佳的cutoff值进行评估，高于cutoff值作为训练集的高危组，低于cutoff值的作为训练集的低危组，其cutoff值在验证集中也同样区分，Kaplan-Meier生存分析进行分组因素水平间的线性趋势检验。P值小于0.05，说明这个cutoff值能够很好的区分不同的预后。
6、运用聚类的方法，将多重平行定量检测的四因子进行了聚类分析，无论是训练集还是验证集都能很好的区分不同的预后。新鲜冻存标本的训练集的聚类分析，对于预后判断的准确性为69％，验证集的判断准确性为70％，石蜡标本的训练集的聚类分析对于预后判断的准确性为62％，验证集的判断准确性为61％(图8-9)。

Claims (7)

1.一种用于激素受体阳性乳腺癌预后的多重平行检测液相基因芯片，其特征在于，包括探针；
其中，所述探针包括下列三组核苷酸序列之一：
(1)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列；
(2)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列中的每条序列的互补链；
(3)与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的序列中的每条序列有至少70％同源性的序列。
2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述芯片还包括：SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示序列的探针。
3.一种用于激素受体阳性乳腺癌预后的试剂盒，其特征在于：包括下列三组核苷酸序列之一的探针：
(1)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列；
(2)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示序列中的每条序列的互补链；
(3)与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的序列中的每条序列有至少70％同源性的序列。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：SEQ ID NO.9～SEQ IDNO.12所示序列的探针。
5.一种用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因的评价系统，其特征在于，包括：幂函数模块和线性函数模块；
其中，幂函数模块，用于将根据权利要求1所述芯片测得的样本的基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的各自表达量，放入Cox回归，并通过预后情况以及每个患者从手术到出现复发转移的时间，得到每个基因表达量在幂函数中所得到的权重，将其作为底数，每个基因的表达量作为幂指数，将四个基因相加获得的分数通过受试者工作特征曲线的最佳的临界值，能将样本分为预后好和预后差两组；
线性函数模块，用于通过二分类logist回归方法，将根据权利要求1所述芯片测得的样本的基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的表达量计算其分别的权重，同时将权重与基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的各自表达量相乘，获得分数，通过受试者工作特征曲线的最佳的临界值，能将样本分为预后好和预后差两组。
6.如权利要求5所述的评价系统，其特征在于：所述评价系统还包括免疫组化模块，其用于将根据样本的基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67所表达的蛋白量作为所述幂函数模块和线性函数模块中的基因表达量，从而获得免疫组化的幂函数和线性函数，其中，对蛋白Ki67的读数取常数e为底数的对数，以用于判断预后。
7.一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因，其特征在于，包括：基因ESR1、PGR、ERBB2和MKI67。
CN201410421408.6A 2014-08-25 2014-08-25 一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因及其应用 Active CN104263815B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410421408.6A CN104263815B (zh) 2014-08-25 2014-08-25 一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410421408.6A CN104263815B (zh) 2014-08-25 2014-08-25 一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104263815A true CN104263815A (zh) 2015-01-07
CN104263815B CN104263815B (zh) 2017-01-25

Family

ID=52155390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410421408.6A Active CN104263815B (zh) 2014-08-25 2014-08-25 一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104263815B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106939337A (zh) * 2017-03-21 2017-07-11 重庆市肿瘤研究所 激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法
WO2018001295A1 (zh) * 2016-06-30 2018-01-04 博奥生物集团有限公司 分子标志物、内参基因及其应用、检测试剂盒以及检测模型的构建方法
CN108664971A (zh) * 2018-05-22 2018-10-16 中国科学技术大学 基于2d卷积神经网络的肺结节检测方法
CN113278700A (zh) * 2021-06-04 2021-08-20 浙江省肿瘤医院 一种用于乳腺癌分型及预后预测的引物组及试剂盒
CN113302313A (zh) * 2018-11-05 2021-08-24 拜恩科技诊断有限责任公司 乳腺癌的预测方法
CN113383091A (zh) * 2018-09-27 2021-09-10 百欧恩泰诊断有限责任公司 乳腺癌的预测和预后方法
CN114529554A (zh) * 2021-12-28 2022-05-24 福州大学 一种胃癌her2数字病理切片智能辅助判读方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921858A (zh) * 2010-08-23 2010-12-22 广州益善生物技术有限公司 乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片
CN102971435A (zh) * 2010-03-31 2013-03-13 斯维丹诊断有限责任公司 用于内分泌治疗下的乳腺癌复发预测的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102971435A (zh) * 2010-03-31 2013-03-13 斯维丹诊断有限责任公司 用于内分泌治疗下的乳腺癌复发预测的方法
CN101921858A (zh) * 2010-08-23 2010-12-22 广州益善生物技术有限公司 乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRANC¸OIS BERTUCCI1等: "Identification and validation of an ERBB2 gene expression signature in breast cancers.", 《ONCOGENE》, vol. 23, 31 December 2004 (2004-12-31), pages 2564 - 2575, XP008042086, DOI: doi:10.1038/sj.onc.1207361 *
IVAN BIE`CHE等: "Molecular Profiling of Inflammatory Breast Cancer: Identification of a Poor-Prognosis Gene Expression Signature.", 《CLINICAL CANCER RESEARCH》, vol. 10, 15 October 2004 (2004-10-15), pages 6789 - 6795, XP002561152 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018001295A1 (zh) * 2016-06-30 2018-01-04 博奥生物集团有限公司 分子标志物、内参基因及其应用、检测试剂盒以及检测模型的构建方法
CN107574243A (zh) * 2016-06-30 2018-01-12 博奥生物集团有限公司 分子标志物、内参基因及其应用、检测试剂盒以及检测模型的构建方法
CN107574243B (zh) * 2016-06-30 2021-06-29 博奥生物集团有限公司 分子标志物、内参基因及其应用、检测试剂盒以及检测模型的构建方法
CN106939337A (zh) * 2017-03-21 2017-07-11 重庆市肿瘤研究所 激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法
CN108664971A (zh) * 2018-05-22 2018-10-16 中国科学技术大学 基于2d卷积神经网络的肺结节检测方法
CN113383091A (zh) * 2018-09-27 2021-09-10 百欧恩泰诊断有限责任公司 乳腺癌的预测和预后方法
CN113302313A (zh) * 2018-11-05 2021-08-24 拜恩科技诊断有限责任公司 乳腺癌的预测方法
CN113278700A (zh) * 2021-06-04 2021-08-20 浙江省肿瘤医院 一种用于乳腺癌分型及预后预测的引物组及试剂盒
CN114529554A (zh) * 2021-12-28 2022-05-24 福州大学 一种胃癌her2数字病理切片智能辅助判读方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104263815B (zh) 2017-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104263815A (zh) 一组用于激素受体阳性乳腺癌预后的基因及其应用
CA2580937C (en) Methods and computer program products for analysis and optimization of marker candidates for cancer prognosis
CN105319364B (zh) 用于预测小肝癌复发的联合诊断标记
CN105102636B (zh) 用于检测和测定前列腺癌预后的组合物和方法
CN102667472B (zh) Tivozanib应答预测
CN101027412A (zh) 用于膀胱癌检测的尿标记物
Brügmann et al. Testing HER2 in breast cancer: a comparative study on BRISH, FISH, and IHC
CN108169490B (zh) 一组用于评估胶质母细胞瘤预后的联合蛋白及其应用
CN104046624B (zh) 用于肺癌预后的基因及其应用
CN105986024B (zh) 一组用于三阴性乳腺癌预后的基因及其应用
CN109844534B (zh) 预后和预测乳腺癌复发的方法、在其中采用的标志物及其试剂盒
Hu et al. Prognostic value of the preoperative lymphocyte-to-C-reactive protein ratio and albumin-to-globulin ratio in patients with osteosarcoma
CN113933505B (zh) 一组多维分析预测胃癌免疫治疗疗效的tiic指标及其应用
CN104975082B (zh) 一组用于评估肺癌预后的基因及其应用
CN103687963A (zh) 利用与转移相关的多基因标签来确定肝细胞癌的预后的方法
Graham et al. Tissue microarray technology in the routine assessment of HER‐2 status in invasive breast cancer: a prospective study of the use of immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization
Stuchbery et al. Reduction in expression of the benign AR transcriptome is a hallmark of localised prostate cancer progression
CN112946276B (zh) I期肺腺癌患者术后复发风险预测系统及其应用
Stackhouse et al. Measurement of glut-1 expression using tissue microarrays to determine a race specific prognostic marker for breast cancer
CN108508212B (zh) 高级别浆液性卵巢癌靶向治疗和预后判断的标志物
Hanna et al. Human epidermal growth factor receptor 2 testing in primary breast cancer in the era of standardized testing: A Canadian prospective study
CN115612742B (zh) 一种预测中晚期直肠癌新辅助治疗疗效的分子标志物模型及其应用
Lee et al. Effectiveness of silver-enhanced in situ hybridization for evaluating HER2 gene status in invasive breast carcinoma: a comparative study
AL-Bedairy et al. Molecular Subtypes by Immunohistochemical for Iraqi Women with Breast Cancer
Di Cosimo et al. Can we define breast cancer HER2 status by liquid biopsy?

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant