CN113302313A - 乳腺癌的预测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对乳腺癌患者的Oncotype
Description
技术领域
本发明涉及对乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法、用于选择乳腺癌治疗的方法、以及治疗乳腺癌的方法。本发明还涉及试剂盒在这些方法中的用途。
背景技术
早期乳腺癌中的生物标志物对于预后目的和指导治疗决策至关重要。雌激素受体(ESR1/ER)、孕酮受体(PGR/PR)和人表皮生长因子受体2(ERBB2/HER2)是用于乳腺癌病理检查的主要生物标志物，其通过免疫组织化学(IHC)并且在不明确的病例中通过原位杂交(ISH)(Goldhirsch et al.，2013)进行常规评估。虽然通过增殖标志物Ki-67(MKI67)可获得的预后和预测信息是无可争议的(Yerushalmi et al.，2010)，但该标志物的常规应用存在不足的重现性(Varga et al，2012；Polley et al.，2013)。
近年来，由于引入了主要用于ER阳性/HER2阴性癌的多基因测定，在乳腺癌诊断中的预后和预测工具组得到了显著的扩展。通过越来越多的验证研究推动了这些测试作为早期乳腺癌化学治疗决策中补充论据的接受度的提高，这些研究显示这些测试至少在大型患者组群中确实可以预测对化学治疗的响应(Levine et al.，2016；Martin et al，2015；Harris et al，2016)。在这些测定中，Oncotype
复发评分(RS)是研究最为广泛的复发风险分类器之一，其已在前瞻性环境中得到验证(Sparano et al，2015)。可惜的是，其也是最昂贵的测定方法之一，这对大量乳腺癌患者来说仍然遥不可及。
数位研究人员研究了传统的组织学和免疫组织化学参数是否可预测RS，并因此可作为针对该测试的有成本效益的替代品，过滤掉患有低风险或高风险肿瘤的那些患者，从而可免于进一步昂贵的测试。已经提出了可基于常规组织病理学预后指标预测RS的评分算法(Flanagan et al，2008；Klein et al，2013；Ingoldsby et al，2013；Sahebjam et al，2011；Turner et al，2015；Harowicz et al，2017；Kim et al，2016)。大多数这些算法，特别是对于增殖标志物Ki-67，是基于半定量IHC的，并且因此在不同实验室中缺乏标准化。然而，如最近在调查不同量化方法的研究中所强调的，可获得另外水平的分析标准化(Bartlett et al，2016)。
最近的工作(Sparano et al，2018)显示，在一项前瞻性临床试验中，RS≤25指示在50岁以上绝经后妇女中的化学治疗(仅与内分泌治疗相比)缺乏益处。因此，对于相当大比例的患者来说，具有短周转时间并且低成本的可局部应用的能够安全预测RS≤25结果的测试，降低了针对测试结果的等待时间，并且同时为患者提供了获得高质量分子基因表达诊断的途径，该诊断目前由于高成本和缺乏补偿而对于许多患者来说无法获得。
因此，本发明的一个目的是提供负担得起的并且局部进行的Oncotype
RS预测因子(Varga et al，2017)，其可以以高度标准化和可靠的方式应用。
这个和其他目的通过将在下面描述的本发明解决。
发明内容
在一个方面中，本发明涉及对ERBB2阴性乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法，所述方法包括：
基于通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)确定的乳腺癌患者的乳腺肿瘤样品中ESR1、PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平来计算未缩放评分(score unscaled，su)，其中
a)较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ESR1 mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，将PGR mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，并且将MKI67mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联；或者
b)较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ESR1 mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，将PGR mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，并且将MKI67mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联。
在一个实施方案中，所述方法包括在计算su之前：
通过RT-qPCR确定乳腺肿瘤样品中ESR1、PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平。
在一个实施方案中，乳腺癌是ERBB2阴性且ESR1阳性的乳腺癌。
在一个实施方案中，在su的计算中，按照以下对ESR1、PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平(REL)进行加权：
REL(ESR1)：REL(PGR)：REL(MKI67)＝0.60(±0.09)：1(±0.15)：1.78(±0.27)。
在一个实施方案中，较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝基线+WF(ESR1)·REL(ESR1)+WF(PGR)·REL(PGR)-WF(MKI67)·REL(MKI67)，其中WF(ESR1)是REL(ESR1)的加权因子，WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
在一个实施方案中，较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝12.313+0.539·REL(ESR1)+0.902·REL(PGR)-1.602·REL(MKI67)。
在一个实施方案中，较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝-基线-WF(ESR1)·REL(ESR1)-WF(PGR)·REL(PGR)+WF(MKI67)·REL(MKI67)，
其中WF(ESR1)是REL(ESR1)的加权因子，WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
在一个实施方案中，较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝-12.313-0.539·REL(ESR1)-0.902·REL(PGR)+1.602·REL(MKI67)。
在一个实施方案中，该方法还包括：
计算所预测的RS≤25概率q，其中：
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
其中，优选地，等于或大于预定阈值的q指示高RS≤25概率，并且小于预定阈值的q指示低RS≤25概率。
在一个实施方案中，该方法还包括：
基于su来计算临床评分s，其中s的范围为0至100或者-10至10。
在一个实施方案中，
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则等于或大于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且小于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS≤25概率；以及
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则小于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且等于或大于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS≤25概率。
在另一个方面中，本发明涉及对ERBB2阴性乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法，所述方法包括：
基于通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)确定的乳腺癌患者的乳腺肿瘤样品中PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平来计算未缩放评分(su)，其中
a)较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将PGR mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联；或者
b)较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将PGR mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联。
在一个实施方案中，所述方法包括在计算su之前：
通过RT-qPCR确定乳腺肿瘤样品中PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平。
在一个实施方案中，乳腺癌是ERBB2阴性且ESR1阳性的乳腺癌。
在一个实施方案中，在su的计算中，按照以下对PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平(REL)进行加权：
REL(PGR)：REL(MKI67)＝1(±0.15)：1.60(±0.24)。
在一个实施方案中，较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝基线+WF(PGR)·REL(PGR)-WF(MKI67)·REL(MKI67)，
其中WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
在一个实施方案中，较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝25.490+0.847·REL(PGR)-1.353·REL(MKI67)。
在一个实施方案中，较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝-基线-WF(PGR)·REL(PGR)+WF(MKI67)·REL(MKI67)，
其中WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
在一个实施方案中，较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝-25.490-0.847·REL(PGR)+1353·REL(MKI67)。
在一个实施方案中，该方法还包括：
计算所预测的RS≤25概率q，其中：
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
其中，优选地，等于或大于预定阈值的q指示高RS≤25概率，并且小于预定阈值的q指示低RS≤25概率。
在一个实施方案中，该方法还包括：
基于su来计算临床评分s，其中s的范围为0至100或者-10至10。
在一个实施方案中，
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则等于或大于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且小于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS≤25概率；以及
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则小于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且等于或大于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS≤25概率。
在另一个方面中，本发明涉及对ERBB2阴性乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法，所述方法包括：
基于通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)确定的乳腺癌患者的乳腺肿瘤样品中ERBB2、ESR1、PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平来计算未缩放评分(su)，其中
a)较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ERBB2 mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，将ESR1 mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，将PGR mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联；或者
b)较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ERBB2 mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，将ESR1 mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，将PGR mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联。
在一个实施方案中，所述方法包括在计算su之前：
通过RT-qPCR确定乳腺肿瘤样品中ERBB2、ESR1、PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平。
在另一个方面中，本发明涉及用于选择针对ERBB2阴性乳腺癌患者的乳腺癌治疗的方法，所述方法包括：
通过使用如上所限定的方法对乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测；以及
如果预测到高RS≤25概率，则选择内分泌治疗作为针对乳腺癌患者的乳腺癌治疗。
在一个实施方案中，如果su、q或s高于预定阈值，则预测高RS≤25概率。
在另一个方面中，本发明涉及在乳腺癌患者中治疗ERBB2阴性乳腺癌的方法，其包括：
通过使用如上所限定的方法来选择用于乳腺癌患者的乳腺癌治疗；以及
向乳腺癌患者施用所选的乳腺癌治疗。
在另一个方面中，本发明涉及用于如上所限定的治疗ERBB2阴性乳腺癌的方法的内分泌治疗化合物。
在另一个方面中，本发明涉及试剂盒在如上所限定的方法中的用途，其中该试剂盒包含：
至少一对ERBB2特异性引物；
至少一对ESR1特异性引物；
至少一对PGR特异性引物；和/或
至少一对MKI67特异性引物。
在一个实施方案中，试剂盒还包含至少一种ERBB2特异性探针、至少一种ESR1特异性探针、至少一种PGR特异性探针和/或至少一种MKI67特异性探针。
在一个实施方案中，试剂盒还包含至少一对参考基因特异性引物，以及任选地，至少一种参考基因特异性探针。
在一个实施方案中，参考基因选自B2M、CALM2、TBP、PUM1、MRLP19、GUSB、RPL37A和CYFIP1。
在另一个方面中，本发明涉及如上所限定的对乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法，或者如上所限定的用于选择针对乳腺癌患者的乳腺癌治疗的方法，所述方法是计算机实施的或部分计算机实施的。
在另一个方面中，本发明涉及数据处理设备/装置/系统，其包含用于执行如上所限定的计算机实施或部分计算机实施的方法的装置。
在另一个方面中，本发明涉及包含指令的计算机程序，当所述程序由计算机执行时，该指令使计算机执行如上所限定的计算机实施或部分计算机实施的方法。
在另一个方面中，本发明涉及暂时性或非暂时性计算机可读数据载体，其上存储有如上所限定的计算机程序。
附图说明
图1示出了在训练组群中未缩放评分1的ROC曲线。
图2示出了在验证组群中未缩放评分1的ROC曲线。
图3示出了根据商业和TailorX试验截止值在不同RS分类中未缩放评分值的分布(组A：训练组群，N＝202；组B：验证组群，N＝104)。虚线：在95％特异性下的训练集上限定的截止值(3.170)。实线：在97.5％特异性下的训练集上限定的截止值(3.892)。
图4示出了在验证组群2中再缩放评分1(LRP评分)的ROC曲线。
图5示出了针对在ESR1阳性/ERBB2阴性样品中模拟RS的再缩放评分1(LRP评分)的ROC曲线。
图6示出了根据商业和TailorX试验截止值在不同RS分类中再缩放评分1(LRP评分)的分布(组A：验证组群2，N＝54；组B：模拟RS组群N＝117(ESR1阳性/ERBB2阴性))。虚线：在95％特异性下的训练集上限定的截止值(-0.722，再缩放评分)。实线：在100％特异性下的训练集上限定的截止值(0，再缩放评分)。
从以下详细描述，特别是结合附图考虑时，本发明的其他目的、优点和特征将变得明显。
具体实施方式
尽管下面详细描述了本发明，但应理解本发明不限于本文中所述的具体的方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
在下文中，将描述本发明的某些要素。这些要素可与一些具体实施方案一起列出，然而，应理解，其可以以任何方式和任意数量组合以产生另外的实施方案。多方面描述的实例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选的要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则本申请中的所有描述的要素的任何排列和组合均应被视为通过本申请的说明书公开。
优选地，本文中使用的术语如“A multilingual glossary ofbiotechnologicalterms(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel和H.Kolbl，编辑，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland，(1995)中所述所定义。
除非另外指出，否则本发明的实践将采用在本领域中文献中说明的化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法(参见，例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，J.Sambrook et al.编辑.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor 2000)。
除非上下文中另有要求，否则在本说明书和随附的权利要求书通篇，词语“包括/包含”及其变化形式将被理解为意指包括所陈述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中，这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组可被排除，即，主题在于包括所陈述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文中另外指出或与上下文明显相反，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为表示一个/种或更多个/种。本文中值的范围的记载仅旨在用作单独引用落入该范围的每个单独的值的速记方法。除非本文中另外指出，否则每个单独值被并入说明书中，如同其在本文中单独地记载一样。除非本文中另外指出或在其他情况下与上下文明显相反，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。除非另外要求，否则本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(如，“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，并不对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言均不应被解释为表示对本发明的实践必要的任何未要求保护的要素。
在本说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文中引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)，无论在上文中还是在下文中，均通过引用整体在此并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这样的公开内容。
在一个方面中，本发明涉及对ERBB2阴性乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法，所述方法包括：
基于通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)确定的乳腺癌患者的乳腺肿瘤样品中ESR1、PGR和MKI67的mRNA的表达水平，优选相对表达水平来计算未缩放评分(su)，其中
a)较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ESR1 mRNA的较高表达水平与较高的su相关联，将PGR mRNA的较高表达水平与较高的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高表达水平与较低的su相关联；或者
b)较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ESR1 mRNA的较高表达水平与较低的su相关联，将PGR mRNA的较高表达水平与较低的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高表达水平与较高的su相关联。
术语“乳腺癌”涉及一种癌症类型，其来源于乳腺组织，最常见地来源于乳导管的内衬或向导管提供乳的小叶。来源于导管的癌症被称为导管癌，而来源于小叶的那些被称为小叶癌。乳腺癌偶尔作为转移性疾病存在。转移的常见部位包括骨、肝、肺和脑。乳腺癌发生在人和其他哺乳动物中。尽管绝大多数人病例发生在女性中，但是也可发生男性乳腺癌。在本发明的一个实施方案中，乳腺癌是原发性乳腺癌(也称为前期或早期乳腺癌)。原发性乳腺癌是尚未扩散到乳房或腋下淋巴结以外的乳腺癌。在本发明的一个实施方案中，乳腺癌是早期的ERBB2阴性且ESR1阳性乳腺癌，其为结节阴性或结节阳性。
术语“ERBB2阴性乳腺癌”(也称为“HER2阴性乳腺癌”)是指如通过本领域已知的方法，例如通过IHC和/或RT-qPCR确定的具有无或低ERBB2表达水平的乳腺癌。
术语“ESR1阳性乳腺癌”是指如通过本领域已知的方法，例如通过IHC和/或RT-qPCR确定的具有ESR1表达的乳腺癌。这样的乳腺癌也可被称为“激素受体阳性乳腺癌”。
本文中使用的术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论是恶性还是良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用。在本发明的一个实施方案中，肿瘤是实体瘤。
乳腺癌/肿瘤的数种分子亚型是技术人员已知的。本文中使用的术语“肿瘤的分子亚型”(或“癌症的分子亚型”)是指以不同的分子谱(例如基因表达谱)为特征的肿瘤/癌症的亚型。
在一个实施方案中，分子亚型选自包含ERBB2/HER2阳性、三阴性(也称为“基底样”)、管腔A型(样)和管腔B型(样)，优选由其组成的组。术语“基底样”是指这样的肿瘤在基因表达上与基底上皮细胞具有一些相似性的事实。术语“管腔”来源于肿瘤与管腔上皮之间基因表达上的相似性。在一个实施方案中，分子亚型选自包含根据13th St Gallen指南(Goldhirsch A.et al.，2013)的分子亚型，优选由其组成的组，所述分子亚型在下表1中示出。
在一个实施方案中，分子亚型通过蛋白质水平上的免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)和/或通过mRNA水平上的RT-qPCR，优选地仅在mRNA水平上来确定，例如，如WO 2015/024942 A1中所述，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，分子亚型(例如根据13th St Gallen指南的分子亚型)通过
试剂盒(BioNTechDiagnostics GmbH，Mainz，Germany；还参见Laible M.et al.，2016)的方式确定，例如基本上如实施例2中所述。
本文中使用的术语“患者”是指人或另一种哺乳动物。优选地，所述患者是人。优选地，所述患者是雌性患者。在一个实施方案中，所述患者是绝经后的雌性患者，其优选地大于50岁。
Oncotype
复发评分(RS)测试是公知的通常用于针对乳腺癌的个体化风险评估的测试。其被收录在来自例如美国临床肿瘤学会(American Society of ClinicalOncology，
)、国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，
)、圣加仑共识小组(St.Gallen Consensus panel)、国家医疗保健卓越研究所(National Institute for Health Care Excellence，NICE)、欧洲肿瘤内科学会(European Society for Medical Oncology，ESMO)和德国妇科肿瘤学会(GermanAssociation of Gynecological Oncology，AGO)的组织的临床指南中。该测试使用RT-PCR来测量21个基因的表达：16个癌症相关基因以及5个参考基因。RS≤25的测试结果指示低复发风险，并且已显示指示缺乏化学治疗益处(Sparano et al，2018)。
关于癌症的术语“复发”包括在原始疾病的同一部位和器官处重现肿瘤细胞、甚至可在癌症的初步诊断和治疗之后多年出现的转移、或局部事件，例如肿瘤细胞浸润至局部淋巴结中。“远位复发”是指癌细胞扩散(转移)到局部淋巴结以外的远位机体部分(即另一个器官)的情况。无复发存活通常限定为从随机化到第一次复发、再发、第二癌症、或死亡的时间。
术语“转移”意指癌细胞从其原始部位扩散到身体的另一个部分。转移的形成是一个非常复杂的过程，并且取决于恶性细胞从原发肿瘤脱离、侵袭细胞外基质、渗透内皮基底膜以进入体腔和血管，然后在通过血液运输之后，浸润靶器官。最后，新肿瘤在靶部位的生长取决于血管生成。甚至在去除原发肿瘤之后，肿瘤转移也经常发生，因为肿瘤细胞或组分可保留并发生转移潜能。
术语“mRNA”涉及“信使RNA”并且涉及编码肽或蛋白质的“转录物”。mRNA通常包含5’非翻译区(5’-UTR)、蛋白质或肽编码区和3’非翻译区(3’-UTR)。mRNA具有在细胞内和体外的有限半衰期。
根据本发明，通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)确定mRNA的表达水平。由于RNA不能在PCR中直接扩增，因此必须使用酶逆转录酶将其逆转录为cDNA。为此目的，可利用一步法RT-qPCR，其将通过PCR的逆转录反应与DNA扩增组合在同一反应中。在一步法RT-qPCR中，RNA模板被混合在含有逆转录酶、DNA聚合酶、引物和探针、dNTP、盐和洗涤剂的反应混合物中。在第一步中，使用靶标特异性反向引物通过酶逆转录酶逆转录靶RNA。然后，使用引物/探针和DNA聚合酶在PCR反应中扩增cDNA。
在一个实施方案中，定量PCR是基于荧光的定量实时PCR，特别是基于荧光的定量实时PCR。基于荧光的定量实时PCR包括使用荧光标记的探针。优选地，荧光标记的探针由用荧光报道子染料和猝灭剂染料二者标记的寡核苷酸组成(＝双标记探针)。
合适的荧光报道子和猝灭剂染料/部分是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于报道子染料/部分6-FAMTM、JOETM、
以及猝灭剂染料/部分dabcyl、TAMRATM、BHQTM-1、-2或-3。探针特异性产物的扩增导致探针的切割(＝扩增介导的探针置换)，从而产生报道子荧光的提高。反应中荧光的提高与靶扩增物的增加成正比。通过使用CFX96TM qPCR仪器(Bio-Rad)或
480II系统(Roche Diagnostics)或Versant kPCR系统(Siemens)或Mx3005P系统(Agilent Technologies)或等同的实时仪器用于检测来源于探针的荧光，可实时测量荧光的提高。在一个实施方案中，RT-qPCR用CFX96TM qPCR仪器(Bio-Rad)进行。在另一个实施方案中，RT-qPCR用除CFX96TM qPCR系统之外的qPCR系统进行，并且用所述系统获得的结果在数学上被转换以对应于用CFX96TM qPCR系统获得的结果。分析输出是每个靶基因/序列的Cq值(Cq＝定量循环)。Cq值(也称为循环阈值(cycle threshold，CT)值)由PCR扩增循环数决定，在此之后探针的荧光信号超过某个背景信号，其中Cq值是针对PCR扩增之前样品中靶分子的量的量度。优选地，用适当的软件(例如，MicrosoftExcelTM)或统计学软件包(例如，SAS
9.0.0、GraphPad Prism4、Genedata ExpressionistTM)进一步分析Cq值。可基于具有已知靶标浓度的标准曲线的Cq结果，将Cq值转换为绝对靶分子量(例如，ng/μl或分子/μl)。或者，可将靶标量报道为基于参照的x倍降低或提高的量(＝ΔCq)。与高ΔCq(大差异)相比，低ΔCq值(小差异)指示相对于参照更高的靶标量。合适的是通过从固定值(例如PCR循环数，例如40)中减去ΔCq来重新计算ΔCq。结果是与靶标量直接相关的值(高值＝高量)，并表示为40-ΔCq值，其中整数1表示靶标量加倍(例如，值34表示与值33一样多两倍的量)。根据所期望的系统的重现性和精度，可进行多个参照测定或用校准物的ΔCq重新计算/归一化样品的ΔCq，从而得到ΔΔCq值(1点校准；Pfaffl，2001，Nucleic Acid Res.29(9)：e45)。优选地，Cq值不通过可使Cq值的范围偏离的任何其他数学运算来转换。通过使用针对特异性探针的不同荧光团，还可在同一反应中进行多路复用(multiplex)的不同靶标测定。在PCR期间，并行地扩增多路复用中的每个靶标但利用不同的荧光发射单独地检测。
在一个实施方案中，本文中使用的术语“mRNA的表达水平”是指mRNA的绝对表达水平，优选作为Cq值给出。在一个实施方案中，Cq值直接用于计算(例如，从其他Cq值中减去)，而无需预先用一种或更多种参考基因进行归一化。
在另一个实施方案中，本文中使用的术语“mRNA的表达水平”是指mRNA的相对表达水平。
在一个实施方案中，qPCR的扩增效率为90％至110％。优选地，如果qPCR的扩增效率低于90％或高于110％，则校正相应的Cq值以与100％扩增效率一致。
优选地，根据本发明使用的引物的长度为15至30个核苷酸，特别是脱氧核糖核苷酸。在一个实施方案中，设计引物以使得(1)对靶mRNA序列(例如，ERBB2、ESR1、PGR或MKI67)具有特异性，(2)提供小于150bp(优选小于100bp)的扩增子尺寸，(3)检测所有已知的蛋白质编码剪接变体，(4)不包含已知的多态性(例如，单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphisms，SNP))，(5)是mRNA特异性的(考虑外显子/内含子；优选没有DNA的扩增)，(6)没有二聚化的趋势和/或(7)解链温度Tm在58℃至62℃的范围内(优选地，Tm为约60℃)。
本文中使用的术语“核苷酸”包括天然(天然存在的)核苷酸，其包括选自腺嘌呤(A)、胸苷(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)的含氮碱基、选自核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖以及脱氧核糖的组的糖(碱基和糖的组合通常称为“核苷”)，以及一至三个磷酸基团，并且其可形成磷酸二酯核苷间键。此外，本文中使用的“核苷酸”是指核苷酸类似物。本文中使用的“核苷酸类似物”应意指被DNA或RNA聚合酶(无论哪个合适)识别，并被并入DNA或RNA链(无论哪个合适)中的A、G、C、T或U的类似物(即，包含碱基A、G、C、T或U的核苷酸的类似物)。这样的核苷酸类似物的一些实例包括但不限于5-丙炔基嘧啶(即，5-丙炔基-dTTP和5-丙炔基-dCTP)、7-脱氮嘌呤(即，7-脱氮-dATP和7-脱氮-dGTP)、氨基烯丙基-dNTP、生物素-AA-dNTP、2-氨基-dATP、5-甲基-dCTP、5-碘-dUTP、5-溴-dUTP、5-氟-dUTP、N4-甲基-dCTP、2-硫代-dTTP、4-硫代-dTTP和α-硫代-dNTP。还包括标记的类似物，例如荧光类似物，例如DEAC-丙二胺(PDA)-ATP、基于吗啉代核苷类似物以及锁核酸(locked nucleic acid，LNA)类似物的类似物。
与根据本发明使用的引物结合使用的措辞“对靶mRNA序列具有特异性”，意指在适当的温度条件和溶液离子强度(特别是PCR条件)下引物与靶mRNA序列的cDNA杂交(即退火)的能力。温度条件和溶液离子强度决定了杂交的严格性。杂交需要两种核酸(即引物和cDNA)包含互补序列，但是根据杂交的严格性，碱基之间可能错配。在一个实施方案中，“适当的温度条件和溶液离子强度”是指在58℃至62℃范围内的温度(优选约60℃的温度)和通常在PCR反应混合物中使用的溶液离子强度。在一个实施方案中，引物序列与靶mRNA序列的cDNA的相应序列80％，优选85％，更优选90％，甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％或100％互补，如通过本领域已知的序列比较算法确定的。
在一个实施方案中，在严格或中等严格杂交条件下，引物与靶mRNA序列的cDNA杂交。如本文所限定的“严格杂交条件”涉及在68℃下在5×SSC/5×Denhardt溶液/10％SDS中杂交，并在室温下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤，或者涉及其本领域公认等同条件(例如，其中在60℃下在2.5×SSC缓冲液中进行杂交，随后在37℃下在低缓冲液浓度中进行数个洗涤步骤，并保持稳定的条件)。如本文中所限定的“中等严格杂交条件”涉及包括在42℃下在3×SSC中洗涤，或者其本领域公认等同条件。可改变盐浓度和温度的参数以实现引物与靶核酸之间的最佳同一性水平。关于这样的条件的指南可在本领域中获得，例如，J.Sambrooket al.编辑，2000，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor；和Ausubel et al.编辑，1995，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，N.Y.。
优选地，根据本发明使用的探针的长度为20至35个核苷酸，特别是脱氧核糖核苷酸。在一个实施方案中，设计探针以使得(1)对靶mRNA序列(例如，ERBB2、ESR1、PGR或MKI67)具有特异性，(2)不包含已知的多态性(例如，单核苷酸多态性，SNP)和/或(3)解链温度Tm比相应引物的解链温度Tm高约5℃至8℃。
与根据本发明使用的探针组合使用的措词“对靶mRNA序列具有特异性”意指在适当的温度条件和溶液离子强度(特别是PCR条件)下探针与靶mRNA序列的(扩增的)cDNA杂交(即退火)的能力。温度条件和溶液离子强度决定了杂交的严格性。杂交需要两种核酸(即探针和cDNA)包含互补序列，但是根据杂交的严格性，可进行碱基之间的错配。在一个实施方案中，“适当的温度条件和溶液离子强度”是指在63℃至70℃范围内的温度和通常在PCR反应混合物中使用的溶液离子强度。在一个实施方案中，探针的序列与靶mRNA序列的(扩增的)cDNA的相应序列80％，优选85％，更优选90％，甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％或100％互补，如通过本领域已知的序列比较算法确定的。
在一个实施方案中，探针在如上文所限定的严格或中等严格杂交条件下与靶mRNA序列的(扩增的)cDNA杂交。
如上所限定的探针优选例如用选自荧光标记、荧光猝灭标记、发光标记、放射性标记、酶标记及其组合的标记进行标记。优选地，如上所限定的探针是包含荧光报道子部分和荧光猝灭剂部分的双标记探针。
在一个实施方案中，针对肿瘤样品中一种或更多种参考基因的(平均)表达水平将表达水平归一化。本文中使用的术语“参考基因”意指在被检查的系统(即癌症)中在RNA转录物/mRNA水平上具有相对恒定的表达水平的基因。这样的基因可被称为持家基因。在一个实施方案中，一种或更多种参考基因选自B2M、CALM2、TBP、PUM1、MRLP19、GUSB、RPL37A和CYFIP1。其他合适的参考基因是本领域技术人员已知的。
B2M是指β-2微球蛋白的基因(UniProt：P61769)，CALM2是指钙调蛋白-2的基因(UniProt：PODP24)，TBP是指TATA-box结合蛋白的基因(UniProt：P20226)，PUM1是指pumilio同源物1的基因(UniProt：Q14671)，MRLP19是指39S核糖体蛋白L19，线粒体的基因(UniProt：P49406)，GUSB是指β-葡糖醛酸酶的基因(UniProt：P08236)，RPL37A是指核糖体蛋白L37a的基因(UniProt：P61513)，以及CYFIP1是指胞质FMR1相互作用蛋白1的基因(UniProt：Q7L576)。
在一个实施方案中，根据本发明使用的引物选自如WO 2015/024942A1和/或WO2016/131875 A1中所述的引物，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，RT-qPCR通过
试剂盒(BioNTech Diagnostics GmbH，Mainz，Germany；还参见Laible M.etal.，2016)的方式进行，例如，基本上如实施例2中所述。
本文中使用的术语“相对表达水平(REL)”是指相对于一种或更多种参考基因(例如，如本文中限定的一种或更多种参考基因)的表达水平的给定标志物基因(例如，ERBB2、ESR1、PGR或MKI67)的表达水平。根据本发明，通过RT-qPCR在mRNA水平(转录水平)上确定表达水平。
在一个实施方案中，相对表达水平(REL)作为ACq值给出，所述ΔCq值通过从标志物基因的Cq值或平均值/中位数Cq值中减去一种或更多种参考基因的Cq值或平均值/中位数Cq值来计算。在一个实施方案中，通过从所述ΔCq值中减去校准物(例如，阳性对照，例如标志物基因的体外转录的RNA)的ΔCq值从而得到ΔΔCq值来进一步归一化ΔCq值。
在一个实施方案中，给定标志物基因的相对表达水平(REL)即REL(ERBB2)、REL(ESR1)、REL(PGR)或REL(MKI67)作为选自以下的值给出：ΔCq值、ΔΔCq值、X-ΔCq值和X-ΔΔCq值，其中优选地，X是整数，其中优选地，该整数是RT-qPCR的PCR循环数，例如40。在一个实施方案中，REL作为X-ΔΔCq值，例如40-ΔΔCq值给出。
在一个实施方案中，ΔCq值如下计算：患者样品的相应标志物(例如，ERBB2、ESR1、PGR和/或MKI67)的Cq-患者样品的参考基因(例如，B2M和/或CALM2)的Cq(＝计算方法1)。在一个实施方案中，Cq是中位数/平均值Cq。如果使用了多于一个参考基因，则ΔCq值如下计算：患者样品的相应标志物的Cq-患者样品的所选参考基因的平均值/中位数Cq(＝计算方法2)。
在一个实施方案中，ΔΔCq如下计算：ΔΔCq＝(患者样品的Cq标志物-参考样品的Cq标志物)-(患者样品的Cq参考基因-参考样品的Cq参考基因)(＝计算方法3)。
在另一个实施方案中，ΔΔCq值如下计算：(患者样品的Cq标志物-患者样品的Cq参考基因)-(对照样品的Cq标志物-对照样品的Cq参考基因)](＝计算方法4)。在一个实施方案中，Cq是中位数/平均值Cq。参考基因的Cq可以是单个参考基因的Cq或者两种或更多种参考基因的平均Cq(称为平均值/中位数CombRef)。优选地，在所有分析中使用相同的对照样品(也称为校准物)，并导致相同的RT-qPCR或qPCR结果。在一个实施方案中，校准物是阳性对照(positive control，PC)。在一个实施方案中，对照样品是细胞系RNA、体外转录的RNA、或DNA寡核苷酸的等摩尔混合物，其表示具有恒定比的标志物mRNA或cDNA或标志物扩增子或标志物扩增子的一部分。在一个实施方案中，CALM2和/或B2M作为参考基因使用，并且阳性对照例如体外转录的RNA作为对照样品(校准物)使用。
基因ERBB2(也称为HER2；位置：17q12，注释：染色体：17；NC_000017.10；UniProt：P04626)编码受体酪氨酸激酶的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)受体家族的成员。已在许多癌症(包括乳腺肿瘤和卵巢肿瘤)中报道了该基因的扩增和/或过表达。在NCBI数据库中，列出了ERBB2的两种mRNA变体，其编码两种蛋白质形式。蛋白质和mRNA序列可在登录号NM_001005862.1(受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2同工型b)和NM_004448.2(受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2同工型前体)下找到。
基因ESR1(位置：6q25，注释：6号染色体，NC_000006.11；UniProt：P03372)编码雌激素受体(estrogen receptor，ER)，所述雌激素受体是由对激素结合、DNA结合和转录活化重要的数个结构域构成的配体活化转录因子。已知雌激素受体参与病理过程，包括乳腺癌、子宫内膜癌和骨质疏松症。四种ESR1 mRNA变体是已知的，其中转录物变体在5’UTR不同和/或使用不同的启动子，但每种变体编码相同的蛋白质。
基因PGR(也称为PR；位置：11q22-q23，注释：染色体：11；NC_000011.9；UniProt：P06401)编码孕酮受体。类固醇激素例如孕酮及其受体参与真核基因表达的调节，并影响靶组织中的细胞增殖和分化。该基因使用两个不同的启动子和第一个外显子中的翻译起始位点来产生两种mRNA同种型A和B。这两种同种型除在同种型B的N端发现另外的165个氨基酸之外是相同的。
基因MKI67(也称为Ki67；位置：10q26.2，注释：染色体：10；NC_000010.10；UniProt：P46013)编码与细胞增殖相关并且可能是细胞增殖所必需的核蛋白。已描述了两种mRNA变体。相关的伪基因存在于10号染色体上。
在本发明的一个实施方案中，术语“乳腺肿瘤样品”是指从癌症患者分离的乳腺肿瘤组织样品(例如，乳腺肿瘤的活检或切除组织)。在一个优选实施方案中，乳腺肿瘤组织样品是乳腺肿瘤组织样品的冷冻切片或是化学固定的乳腺肿瘤组织样品。在一个更优选的实施方案中，乳腺肿瘤组织样品是福尔马林固定且石蜡包埋的(formalin-fixed andparaffin-embedded，FFPE)乳腺肿瘤组织样品。在一个实施方案中，乳腺肿瘤样品是从乳腺肿瘤组织样品中提取的(总)RNA。在一个特别优选的实施方案中，乳腺肿瘤样品是从FFPE乳腺肿瘤组织样品中提取的(总)RNA。在另一个实施方案中，乳腺肿瘤样品是一个或更多个循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)的样品或者是从一个或更多个CTC中提取的(总)RNA。本领域技术人员能够进行RNA提取程序。例如，可使用高纯度RNA石蜡试剂盒(Roche，Basel，Switzerland)、XTRAKT RNA提取试剂盒XL(Stratifyer MolecularPathology，Cologne，Germany)或
提取试剂盒(BioNTech Diagnostics GmbH，Mainz，Germany)从5至10μm FFPE肿瘤组织卷曲物中提取总RNA。还可将待使用/测试的样品材料储存在冰箱中，并在解冻各个样品材料之后的适当时间点进行本发明的方法。在一个实施方案中，乳腺肿瘤样品是治疗前乳腺肿瘤样品，即在开始/施用乳腺癌治疗之前从乳腺癌患者获得的乳腺肿瘤样品。
本文中使用的术语“治疗”(特别与癌症治疗相关)，涉及改善患者的健康状况和/或延长(提高)寿命的任何治疗。所述治疗可消除癌症、在患者中降低肿瘤的尺寸或数目、在患者中阻止或减慢癌症的发生、在患者中抑制或减慢新癌症的发生、在患者中降低症状的频率或严重程度、和/或在目前患有或先前曾患有癌症的患者中降低复发。
本文中使用的术语“乳腺癌治疗”可包括手术、药物(抗激素/内分泌治疗和化学治疗)、放射、免疫治疗/靶向治疗以及前述任一项的组合。
本文中使用的内分泌治疗(也称为“抗激素性治疗”或“抗激素”治疗)是指阻断或去除激素的治疗。内分泌治疗通过施用阻断/下调雌激素和/或孕酮受体的药物(例如他莫昔芬(tamoxifen)
或氟维司群(fulvestrant)
)，或者替代地用芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(anastrozole)
或来曲唑(letrozole)
)阻断雌激素的产生来靶向需要雌激素以继续生长的癌症。然而，芳香酶抑制剂仅适合于绝经后患者。这是因为绝经后女性中的活性芳香酶与绝经前女性中的普遍形式不同，并且因此这些药剂在抑制绝经前女性的主要芳香酶方面无效。本文中使用的术语“内分泌治疗化合物”或“内分泌治疗剂”意指在向患者施用之后阻断或去除激素的化合物/药剂/药物，特别是阻断/下调雌激素和/或孕酮受体或者阻断雌激素和/或孕酮的产生的化合物/药剂/药物。示例性化合物/药剂/药物包括但不限于他莫昔芬
氟维司群
和芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑
和来曲唑
)。在一个实施方案中，内分泌治疗包括施用芳香酶抑制剂。
化学治疗包括施用化学治疗剂。根据本发明的化学治疗剂或化合物包括细胞抑制性化合物和细胞毒性化合物。传统的化学治疗剂通过杀伤快速分裂(大多数癌细胞的主要特性之一)的细胞而发挥作用。根据本发明，术语“化学治疗剂”或“化学治疗化合物”包括紫杉烷类、铂类化合物、核苷类似物、喜树碱类似物、蒽环类和蒽环类类似物、依托泊苷、博来霉素、长春瑞滨、环磷酰胺、抗代谢物、抗有丝分裂剂和烷基化剂，包括与抗体缀合物相关的上述所公开的药剂，及其组合。在一个实施方案中，化学治疗是基于铂的，即包括施用基于铂的化合物，例如顺铂。根据本发明，对化学治疗剂的提及包括任何前药，例如酯、盐或衍生物例如所述药剂的缀合物。一些实例是所述药剂与载体物质的缀合物，例如蛋白质结合的紫杉醇例如白蛋白结合的紫杉醇。优选地，所述药剂的盐是可药用的。化学治疗剂通常以组合给出，通常持续3至6个月。最常见的治疗之一是环磷酰胺加多柔比星(阿霉素；属于蒽环类和蒽环类类似物的组)，称为AC。有时，添加紫杉烷类药物(例如多西他赛)，并然后将该方案称为CAT；紫杉烷类攻击癌细胞中的微管。因此，在一个实施方案中，化学治疗(例如，新辅助化学治疗)包括施用环磷酰胺、蒽环类和紫杉烷类。产生同等结果的另一种常见治疗是环磷酰胺、甲氨蝶呤(其是一种抗代谢物)和氟尿嘧啶(其是一种核苷类似物)(CMF)。另一种标准化学治疗性治疗包括氟尿嘧啶、表柔比星和环磷酰胺(FEC)，它们可补充有紫杉烷类(例如多西他赛)或补充有长春瑞滨。
在一个实施方案中，本文所用的术语“抗ERBB2药物”是指抗ERBB2/HER2抗体，特别是单克隆抗ERBB2/HER2抗体。单克隆抗ERBB2/HER2抗体包括曲妥珠单抗(trastuzumab)
和帕妥珠单抗(pertuzumab)
其可单独或以组合施用。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合也称为ERBB2/HER2的“双重阻断”。曲妥珠单抗仅在ERBB2/HER2过表达的癌症中有效。另一些单克隆抗体，例如厄妥索单抗(ertumaxomab)
目前正在进行临床试验。可对抗ERBB2/HER2抗体进行进一步修饰以包含治疗部分/治疗剂，例如细胞毒性剂、药物(例如，免疫抑制剂)、化学治疗剂或放射性核素或放射性同位素。因此，如果肿瘤治疗方案包含抗ERBB2/HER2治疗和化学治疗(的组合)，则可使用与化学治疗剂缀合的抗ERBB2/HER2抗体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害并且特别地杀伤细胞的任何药剂。一些实例包括美登素(mertansine)或emtansine(DM1)、泰素(taxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素(dihydroxyanthracin)、二酮类、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、鹅膏蕈碱(amanitin)、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，及其类似物或同源物。在一个实施方案中，抗体缀合物是曲妥珠单抗(T)-DM1，例如恩美曲妥珠单抗(trastuzumabemtansine)。用于形成抗体缀合物的另一些合适的治疗剂包括但不限于：抗代谢物(例如，甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(decarbazine))、烷基化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、塞替派苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(原名道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如，更生霉素(dactinomycin)(原名放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(anthramycin，AMC))以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。在一个优选实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或放射毒性剂。在另一个实施方案中，治疗剂是免疫抑制剂。在又一个实施方案中，治疗剂是GM-CSF。在另一个优选实施方案中，治疗剂是多柔比星、顺铂、博来霉素、硫酸盐、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺或蓖麻毒蛋白A。另一些治疗部分包括作用于mRNA和/或蛋白质合成的治疗部分。数种转录抑制剂是已知的。例如，既是转录抑制剂又是DNA损伤剂的放线菌素D嵌入到DNA中，并且因此抑制转录的起始阶段。夫拉平度(flavopiridol)靶向转录的延伸阶段。α-鹅膏蕈碱与RNA聚合酶II直接结合，这导致起始和延伸阶段二者均受抑制。抗ERBB2/HER2抗体还可与放射性同位素(例如，碘-131、钇-90或铟-111)缀合以产生细胞毒性放射性药物。在另一个实施方案中，本文中使用的术语“抗ERBB2药物”是指靶向ERBB2/HER2的小化合物，例如拉帕替尼(lapatinib)(
或
)、阿法替尼(afatinib)或来那替尼(neratinib)。
辅助治疗是除初级治疗、主要治疗或初始治疗之外(即在其之后)给予的治疗。辅助治疗的一个实例是在手术之后(手术后)给予的另外的治疗(例如通过化学治疗)，其中，优选地，已去除了所有可检测的疾病，但是由于隐性疾病而仍存在复发的统计学风险。新辅助治疗是在主要治疗之前给予的治疗，例如在手术之前的化学治疗(手术前化学治疗)。在一个实施方案中，本文所用的术语“化学治疗”是指辅助化学治疗。在另一个实施方案中，本文所用的术语“化学治疗”是指新辅助化学治疗。
在一个实施方案中，所述方法包括在计算su之前：
通过RT-qPCR确定乳腺肿瘤样品中ESR1、PGR和MKI67的mRNA的表达水平，优选相对表达水平。
在一个实施方案中，未确定除ESR1、PGR和MKI67以及任选地一种或更多种参考基因之外的基因的mRNA的表达水平，优选相对表达水平。
在一个实施方案中，乳腺癌是ERBB2阴性且ESR1阳性的乳腺癌。
在一个实施方案中，在su的计算中，按照以下对ESR1、PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平(REL)进行加权：
REL(ESR1)：REL(PGR)：REL(MKI67)＝0.60(±0.09)：1(±0.15)：1.78(±0.27)。
在一个实施方案中，较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝基线+WF(ESR1)·REL(ESR1)十WF(PGR)·REL(PGR)-WF(MKI67)·REL(MKI67)，
其中WF(ESR1)是REL(ESR1)的加权因子，WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
在一个实施方案中，较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝12313+0.S39·REL(ESR1)+0.902·REL(PGR)-1.602·REL(MKI67)。
在一个实施方案中，较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝-基线-WF(ESR1)·REL(ESR1)-WF(PGR)·REL(PGR)+WF(MKI67)·REL(MKI67)，
其中WF(ESR1)是REL(ESR1)的加权因子，WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
在一个实施方案中，较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝-12.313-0.539·REL(ESR1)-0.902·REL(PGR)+1.602·REL(MKI67)。
在一个实施方案中，该方法还包括：
计算所预测的RS≤25概率q，其中：
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
其中，优选地，等于或大于预定阈值的q指示高RS≤25概率，并且小于预定阈值的q指示低RS≤25概率。
在一个实施方案中，该方法还包括：
基于su来计算临床评分s，其中s的范围为0至100或者-10至10。
在一个实施方案中，临床评分s通过从su中减去预定阈值/截止值来计算，其中，优选地，s的范围为-10至10。
在一个实施方案中，
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则等于或大于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且小于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS≤25概率；以及
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则小于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且等于或大于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS≤25概率。
本文所述式中使用的合适基线以及预定阈值/截止值例如用于将评分二分为“低RS≤25概率”或“高RS≤25概率”的阈值/截止值可由技术人员基于他或她的常识和本文中提供的技术指导(参见实施例)容易地确定。例如，训练测试情况中的一致性研究可用于限定和验证合适的阈值/截止值。在一个实施方案中，阈值/截止值基于一个或更多个先前的临床研究来限定。此外，可进行另外的临床研究用于建立和验证阈值/截止值。阈值/截止值可通过本领域已知的技术确定/限定。在一个实施方案中，阈值/截止值基于训练组群中RS≤25的数据通过分区测试、ROC分析或其他统计学方法来确定/限定(例如，通过使用SAS软件
9.0.0)。
在另一个方面中，本发明涉及对ERBB2阴性乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法，所述方法包括：
基于通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)确定的乳腺癌患者的乳腺肿瘤样品中PGR和MKI67的mRNA的表达水平，优选相对表达水平来计算未缩放评分(su)，其中
a)较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将PGR mRNA的较高表达水平与较高的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高表达水平与较低的su相关联；或者
b)较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将PGR mRNA的较高表达水平与较低的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高表达水平与较高的su相关联。
在一个实施方案中，所述方法包括在计算su之前：
通过RT-qPCR确定乳腺肿瘤样品中PGR和MKI67的mRNA的表达水平，优选相对表达水平。
在一个实施方案中，未确定除PGR和MKI67以及任选地一个或更多个参考基因之外的基因的mRNA的表达水平，优选相对表达水平。
在一个实施方案中，乳腺癌是ERBB2阴性且ESR1阳性的乳腺癌。
在一个实施方案中，在su的计算中，按照以下对PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平(REL)进行加权：
REL(PGR)：REL(MKI67)＝1(±0.15)：1.60(±0.24)。
在一个实施方案中，较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝基线+WF(PGR)·REL(PGR)-WF(MKI67)·REL(MKI67)，
其中WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
在一个实施方案中，较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝25.490+0.847·REL(PGR)-1.353·REL(MKI67)。
在一个实施方案中，较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝-基线-WF(PGR)·REL(PGR)+WF(MKI67)·REL(MKI67)，
其中WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
在一个实施方案中，较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中su通过使用下式来计算：
su＝-25.490-0.847·REL(PGR)+1.353·REL(MKI67)。
在一个实施方案中，该方法还包括：
计算所预测的RS≤25概率q，其中：
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
其中，优选地，等于或大于预定阈值的q指示高RS≤25概率，并且小于预定阈值的q指示低RS≤25概率。
在一个实施方案中，该方法还包括：
基于su来计算临床评分s，其中s的范围为0至100或者-10至10。
在一个实施方案中，临床评分s通过从su中减去预定阈值/截止值来计算，其中，优选地，s的范围为-10至10。
在一个实施方案中，
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则等于或大于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且小于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS≤25概率；以及
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则小于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且等于或大于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS≤25概率。
在另一个方面中，本发明涉及对ERBB2阴性乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法，所述方法包括：
基于通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)确定的乳腺癌患者的乳腺肿瘤样品中ERBB2、ESR1、PGR和MKI67的mRNA的表达水平，优选相对表达水平来计算未缩放评分(su)，其中
a)较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ERBB2 mRNA的较高表达水平与较低的su相关联，将ESR1 mRNA的较高表达水平与较高的su相关联，将PGR mRNA的较高表达水平与较高的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高表达水平与较低的su相关联；或者
b)较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ERBB2 mRNA的较高表达水平与较高的su相关联，将ESR1 mRNA的较高表达水平与较低的su相关联，将PGR mRNA的较高表达水平与较低的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高表达水平与较高的su相关联。
在一个实施方案中，所述方法包括在计算su之前：
通过RT-qPCR确定乳腺肿瘤样品中ERBB2、ESR1、PGR和MKI67的mRNA的表达水平，优选相对表达水平。
在一个实施方案中，未确定除ERBB2、ESR1、PGR和MKI67以及任选地一个或更多个参考基因之外的基因的mRNA的表达水平，优选相对表达水平。
在另一个方面中，本发明涉及用于选择针对ERBB2阴性乳腺癌患者的乳腺癌治疗的方法，所述方法包括：
通过使用如上所限定的方法对乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测；以及
如果预测到高RS≤25概率，则选择内分泌治疗作为针对乳腺癌患者的乳腺癌治疗。
在一个实施方案中，如果su、q或s高于预定阈值，则预测高RS≤25概率。
在一个实施方案中，如果预测到高RS≤25概率，则将乳腺癌患者排除在化学治疗之外。
在一个实施方案中，如上限定的本发明的方法不包括任何其他诊断步骤，例如组织学肿瘤分级或确定(腋窝)淋巴结状态。在一个实施方案中，所述方法不包括任何涉及免疫组织化学(IHC)的步骤。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括考虑一种或更多种临床因素，例如组织学肿瘤分级、(腋窝)淋巴结状态、肿瘤大小、患者年龄等。
在另一个方面中，本发明涉及在乳腺癌患者中治疗ERBB2阴性乳腺癌的方法，其包括：
通过使用如上所限定的方法来选择用于乳腺癌患者的乳腺癌治疗；以及
向乳腺癌患者施用所选的乳腺癌治疗。
在另一个方面中，本发明涉及用于如上所限定的治疗ERBB2阴性乳腺癌的方法的内分泌治疗化合物。
在另一个方面中，本发明涉及试剂盒在如上所限定的方法中的用途，其中该试剂盒包含：
至少一对ERBB2特异性引物；
至少一对ESR1特异性引物；
至少一对PGR特异性引物；和/或
至少一对MKI67特异性引物。
在一个实施方案中，试剂盒包含：
至少一对PGR特异性引物；和
至少一对MKI67特异性引物。
在一个实施方案中，试剂盒包含：
至少一对ESR1特异性引物；
至少一对PGR特异性引物；和
至少一对MKI67特异性引物。
在一个实施方案中，试剂盒包含：
至少一对ERBB2特异性引物；
至少一对ESR1特异性引物；
至少一对PGR特异性引物；和
至少一对MKI67特异性引物。
在一个实施方案中，试剂盒还包含至少一种ERBB2特异性探针、至少一种ESR1特异性探针、至少一种PGR特异性探针和/或至少一种MKI67特异性探针。在一个实施方案中，试剂盒包含至少一种PGR特异性探针和至少一种MKI67特异性探针。在一个实施方案中，试剂盒还包含至少一种ESR1特异性探针、至少一种PGR特异性探针和至少一种MKI67特异性探针。在一个实施方案中，试剂盒还包含至少一种ERBB2特异性探针、至少一种ESR1特异性探针、至少一种PGR特异性探针和至少一种MKI67特异性探针。
在一个实施方案中，试剂盒还包含至少一对参考基因特异性引物，以及任选地，至少一种参考基因特异性探针。在一个实施方案中，参考基因选自B2M、CALM2、TBP、PUM1、MRLP19、GUSB、RPL37A和CYFIP1。在一个实施方案中，B2M和/或CALM2用作参考基因。
优选地，所述引物和/或探针如上文进一步限定。在一个实施方案中，所述引物提供的扩增子大小小于150bp，优选小于100bp。在一个实施方案中，所述探针的检测基于扩增介导的探针置换。在一个实施方案中，所述探针是包含荧光报道子部分和荧光猝灭剂部分的双标记探针。
在一个实施方案中，试剂盒不包含对另外的非参考基因有特异性的任何引物和/或探针。换句话说，试剂盒中不包含对除ERBB2、ESR1、PGR和MKl67、以及任选地一个或更多个参考基因以外的基因有特异性的引物和/或探针。在一个实施方案中，试剂盒中不包含对除ERBB2、ESR1、MKI67以及任选地一个或更多个参考基因以外的基因有特异性的引物和/或探针。在另一个实施方案中，试剂盒中不包含对除ESR1和MKI67以及任选地一个或更多个参考基因以外的基因有特异性的引物和/或探针。
在一个实施方案中，试剂盒还包含至少一种对照RNA样品。在一个实施方案中，至少一种对照RNA样品用作阳性对照和/或对照样品(校准物)，其中，优选地，至少一种对照RNA样品包含编码一种或更多种基因的一种或更多种基因产物(或其部分)的合成mRNA，所述一种或更多种基因选自ERBB2、ESR1、PGR、MKI67和一种或更多种参考基因。在一个实施方案中，一种或更多种参考基因选自B2M、CALM2、TBP、PUM1、MRLP19、GUSB、RPL37A和CYFIP1。在一个实施方案中，B2M和/或CALM2用作参考基因。
在一个实施方案中，试剂盒还包含逆转录酶和DNA聚合酶。在一个实施方案中，逆转录酶和DNA聚合酶以允许一步法RT-qPCR的酶混合物的形式提供。
在一个实施方案中，试剂盒还可包含DNA酶和DNA酶反应缓冲液。
如本文所用，术语“成套试剂盒(简称：试剂盒)”是指包括一个或更多个容器以及任选地数据载体的制品。所述一个或更多个容器可填充有一种或更多种上述装置或试剂。试剂盒中可包括另外的容器，其包含例如稀释剂、缓冲液和其他试剂，例如dNTP。所述数据载体可以是非电子数据载体，例如图形数据载体，例如信息手册、信息表、条形码或访问码；或者电子/计算机可读数据载体，例如光盘(CD)、数字通用光盘(DVD)、微芯片或另外的基于半导体的电子数据载体。访问码可允许访问数据库，例如因特网数据库、集中式或分散式数据库。所述数据载体可包含用于在本发明的方法中使用试剂盒的说明。数据载体可包含mRNA的(相对)表达水平或根据本发明的方法计算的评分的阈值或参考水平。在数据载体包含允许访问数据库的访问码的情况下，所述阈值或参考水平存储在该数据库中。另外，数据载体可包含关于如何执行本发明的方法的信息或说明。
在一个实施方案中，试剂盒是
试剂盒(BioNTech DiagnosticsGmbH，Mainz，Germany；也参见Laible M.et al.，2016)。
在另一个方面中，本发明涉及如上所限定的对乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法，或者如上所限定的用于选择针对乳腺癌患者的乳腺癌治疗的方法，所述方法是计算机实施的或部分计算机实施的。
术语“部分计算机实施的方法”是指这样的方法，其中仅特定步骤，例如计算步骤，是计算机实施的，而所述方法的其他步骤则不是。
在另一个方面中，本发明涉及数据处理设备/装置/系统，其包含用于执行如上所限定的计算机实施或部分计算机实施的方法的装置。
在另一个方面中，本发明涉及包含指令的计算机程序，当所述程序由计算机执行时，该指令使计算机执行如上所限定的计算机实施或部分计算机实施的方法。
在另一个方面中，本发明涉及暂时性或非暂时性计算机可读数据载体，其上存储有如上所限定的计算机程序。
本发明人已出乎意料地显示，如通过RT-qPCR确定的4-标志物集(ERBB2、ESR1、PGR、MKI67)或3-标志物集(ESR1、PGR、MKI67)或2-标志物集(PGR、MKI67)的mRNA表达水平，可作为乳腺癌患者，特别是患有ERBB2阴性且ESR1阳性的原发性乳腺癌的患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的可靠预测因子，从而放弃进行另外的Oncotype
RS测试。
通过以下实施例进一步举例说明本发明，所述实施例不应解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：使用
方案从FFPE样品中分离总RNA
用福尔马林固定肿瘤组织并随后包埋在石蜡中是临床病理学中的一种标准方法，并允许长期存档样品。由于FFPE样品中核酸的化学修饰，因此需要特殊的方案来提取可扩增的核酸。这需要三个步骤：(1)去除石蜡，(2)裂解组织并释放RNA(如果需要的话，对核酸进行脱修饰)，(3)通过数个洗涤步骤纯化RNA。
在第一步中，将FFPE切片中包含的石蜡在经优化的裂解缓冲液中液化。随后添加蛋白酶K导致组织裂解并释放细胞核酸(RNA和DNA)。使RNA结合到磁性颗粒上，该磁性颗粒被锗功能化并在针对有效富集RNA优化的结合缓冲液中允许非常有效的RNA结合。然后，在数个越来越严格的洗涤步骤中洗涤与磁性颗粒结合的RNA，以确保有效去除蛋白质和PCR抑制物质，并随后在洗脱缓冲液中洗脱。洗脱液可直接用于合适的分子生物学分析，例如逆转录、RT-qPCR、微阵列或NGS应用中。通过RT-qPCR方法或UV/VIS分光光度法进行定量是可行的。对于在
RTqPCR中使用
洗脱液(见下文)，不需要消化潜在的残留RNA。
实施例2：使用
试剂盒测量生物标志物的基因表达水平
为了通过PCR确定转录物水平上生物标志物的表达水平，需要首先通过逆转录酶将RNA转录成互补DNA(cDNA)(所谓的第一链合成)。然后通过DNA聚合酶扩增标志物特异性cDNA，并使用荧光标记的水解探针在PCR中实时检测扩增。RT-qPCR在
测定中作为一步反应发生，即RNA的逆转录和随后的DNA的PCR在同一反应混合物中连续发生。除了酶(逆转录酶和DNA聚合酶)外，酶混合物还包含dNTP以及盐和PCR添加剂。针对
RT-qPCR，酶混合物中补充有水、测定混合物和RNA样品。
在三种测定混合物中的每一种中，将两种测定(测定＝针对各自靶序列具有特异性的引物对和探针)组合(＝双重的)。已使用具有不同荧光团标记的水解探针实现在双重测定中同时检测两个靶标；在每种测定混合物中，在一种测定中使用FAM而在另一种测定中使用JOE实施检测。水解探针在5′端以各自的荧光染料和在3′端以猝灭剂修饰。猝灭剂只要它接近染料就抑制染料的荧光。在扩增过程中，探针与靶序列结合。由于DNA聚合酶的核酸外切酶活性，结合的探针被降解，并且染料与猝灭剂分离。在每个循环结束时测得的所得荧光与合成的产物的量成正比。在使用水解探针的实时PCR测定中，获得大于背景信号的荧光信号所需的PCR循环数被用作反应开始时存在的靶分子的数目的量度。可在背景信号之上检测到信号时的PCR循环数称为定量循环数(Cq)。在相对表达分析中，确定靶测定和参考测定的Cq值之差(＝ΔCq)，以补偿RNA起始材料量的变化。此外，ΔCq值相对于校准物进行偏移，以校正针对一个制造商的不同仪器的运行间和仪器间变异(ΔΔCq)。
以以下方式选择标志物特异性的引物和探针：在没有靶基因RNA或具有不期望的序列或分析物(例如，基因组DNA)的情况下不会发生扩增和/或检测，而目的靶基因被灵敏地检测到。合适的引物描述于例如WO2015/024942 A1和/或WO 2016/131875 A1中。
使用
试剂盒，每次RT-qPCR运行分析至少一个患者样品。此外，在每次运行中分析外部对照，这确定运行的有效性/无效性。为此目的，
试剂盒中提供了也用作校准物的阳性对照RNA(阳性对照＝PC)和水(用于制备反应以及阴性对照＝NC)。每个患者样品/对照用每种测定混合物(1、2和3)分析。以一式三份进行分析，导致每个样品/对照进行3×3＝9个反应。测定混合物1包含生物标志物ERBB2(FAM)和ESR1(JOE)的测定，测定混合物2包含生物标志物测定MKI67(FAM)和参考测定B2M(JOE)，以及测定混合物3包含生物标志物测定PGR(FAM)和参考测定CALM2(JOE)。两种参考测定用于确定是否存在用于分析患者样品的足够的分析物(RNA)。无效的样品不得用于计算结果。针对有效的样品(足够的RNA)，分析从组合参考的计算(CombRefSample，B2M和CALM2的中位数Cq值的几何平均值)开始。然后，通过从生物标志物ERBB2、ESR1、PGR和MKI67的四个中位数Cq值中减去CombRefSample来确定标志物特异性ΔCq样品值。
然后使用校准物通过减去校准物ΔCqPC来校正所得的标志物特异性ΔCq值。从阳性对照的相应标志物Cq值中减去CombRefPC(CombRefPC，阳性对照PC的B2M和CALM2的中位数Cq值的几何平均值)，以计算标志物特异性校准物。
这产生ΔΔCq值：
ΔΔCq＝ΔCq样品-ΔCqPC，
其中
ΔCq样品＝(中位数Cq[标志物样品]-[CombRefSample])，
并且
ΔCqPC＝(中位数Cq[标志物PC]-[CombRefPC])。
通过从PCR循环总数(40)中减去ΔΔCq值获得最终结果(40-ΔΔCq值)，以使测试结果与标志物表达呈正相关，这是便于对临床决策进行解释的一种形式。
对于肿瘤亚型分型，基于临床验证的阈值(截止值)，将标志物特异性40-ΔΔCq值二分为“阳性”或“阴性”。此外，报告了每个定量标志物确定的连续值。然后四个标志物结果(阳性/阴性)的组合可用于确定肿瘤样品的分子亚型(表1)。因此，为了确定亚型，有必要在一次运行中分析所有三种测定混合物，以获得样品的四个40-ΔΔCq值。
表1.根据13th St Gallen指南(Goldhirsch A.et al.，2013)的
单标志物结果向分子亚型的翻译
| ERBB2 | ESR1 | PGR | MKI67 | St Gallen亚型 |
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 管腔B型样(HER2阳性) |
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阴性 | 管腔B型样(HER2阳性) |
| 阳性 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 管腔B型样(HER2阳性) |
| 阳性 | 阳性 | 阴性 | 阴性 | 管腔B型样(HER2阳性) |
| 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阳性 | 未确定 |
| 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | 未确定 |
| 阳性 | 阴性 | 阴性 | 阳性 | HER2阳性(非管腔型) |
| 阳性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | HER2阳性(非管腔型) |
| 阴性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 管腔B型样(HER2阴性) |
| 阴性 | 阳性 | 阳性 | 阴性 | 管腔A型样 |
| 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 管腔B型样(HER2阴性) |
| 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阴性 | 管腔B型样(HER2阴性) |
| 阴性 | 阴性 | 阳性 | 阳性 | 未确定 |
| 阴性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | 未确定 |
| 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阳性 | 三阴性(导管) |
| 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 三阴性(导管) |
实施例3：未缩放评分的训练和验证
从具有已知RS结果和肿瘤细胞含量≥20％的FFPE乳腺癌样品的整个表面10μm切片中提取总RNA。ERBB2、ESR1、PGR和MK167 mRNA的表达通过RT-qPCR在CFX96qPCR循环仪上使用
试剂盒进行测量。在MammaTyper ERBB2阴性样品(40-ΔΔCq＜40.4)和ESR1阳性样品(40-ΔΔCq≥36.9)上，使用多变量逻辑斯谛回归建立针对RS≤25结果的预测模型。基于该模型和训练数据，针对临床环境中低化学治疗获益患者的置信预测的两个截止值在95％和97.5％特异性下建立。然后在第二、单独的乳腺癌样品集中固定和验证模型和截止值。ROC分析用于表征由预测模型产生的连续值的预测能力。还使用两个预定截止值在验证样品上确定了用于检测RS≤25结果的阳性和阴性预测值。
用于训练预测模型的样品集包含202个样品，其包含29个(14.4％)RS＞25的样品。在具有所有四种标志物的初始多变量模型中，PGR和MKI67是最强的预测因子，而在模型中ESR1的影响较低但仍然显著。在该ERBB2阴性样品集中ERBB2是非显著预测因子，并且因此将ERBB2从仅基于三种标志物的最终模型中排除。该3-标志物模型在训练样品中实现了0.920(95％CI：0.871-0.968)的AUC(图1)。将来自训练数据集的固定模型应用于第二单独收集的104个样品的集(包含20个(19.2％)RS＞25的样品)，记录的AUC为0.883(95％CI：0.810-0.955)(图2)。当进一步应用在训练集中建立的两个预定截止值时，104个验证样品中的45个和36个(43.3％和34.6％)(图3)具有预测的低化学治疗获益结果(RS≤25)。即使采用较不严格的截止值，来自验证组群的RS＞25案例中也没有一个被错误地预测为RS≤25样品。
基于以上所述，使用多变量逻辑斯谛回归建立了用于预测Oncotype
低风险RS(RS≤25)的两个未缩放评分(su)。未缩放评分为(su＝未缩放评分；REL(ESRl)、REL(PGR)、REL(MKI67)＝使用
试剂盒以40-ΔΔCq测定的相对表达水平)：
su＝12.313+0.539·REL(ESR1)+0.902·REL(PGR)-1.602·REL(MK167)(＝“评分1”)，以及
su＝25.490+0.847·REL(PGR)-1.353·REL(MKI67)(＝”评分2”).。
REL(MKI67)是使用CALM2作为唯一的参考基因确定的。
将较高的未缩放评分值与较高的RS≤25结果概率相关联。可使用例如3.892的截止值将具有高RS≤25概率的样品与具有低RS≤25概率的样品分离(当评分≥3.892时RS≤25概率高，当评分＜3.892时RS≤25概率低)。
符号(+/-)可在各个式中交换，其产生的未缩放评分与RS＞25(高风险)结果的概率而不是RS≤25(低风险)结果的概率相关联。
除了使用截止值的二元分类之外，针对每个样品可计算单独的pCR预测概率。
未缩放评分是在来源于CFX96 qPCR仪器的数据上训练的。要将评分应用到来源于除CFX96以外的qPCR平台的数据上，可将来源于这样的平台的40-ΔΔCq值转换为在CFX96系统上对该样品所预期的40-ΔΔCq值。40-ΔΔCq值的该转换可通过使用线性方程或者通过从相应的40-ΔΔCq值加/减预定Cq值，从而模拟CFX96表达值来进行。另一种可能的方法是将评分转移到另一个平台。在其中使用CFX96系统和另一个平台测量相同样品的数据集中，来自另一个平台的40-ΔΔCq值可用作预测因子，以使用线性回归分析确定从在CFX96系统上针对相同样品确定的40-ΔΔCq值计算的pCR评分。
实施例4：预测评分的进一步验证
然后将基于发现组群建立的算法和主要截止值(参见实施例3)应用于另一个单独收集的样品集，这些样品的RS值先前已被确定。
预测算法(评分1)也应用于在CFX96系统上测量的模拟RS值可用的样品集。这些RS模拟基于对来自Oncotype DX的所有目标和参考基因的Nanostring测量，以及基于也已针对真实RS值进行训练的算法的RS值的计算(Bayani et al，2017)。
也称为低风险预测(low-risk-predict，LPR)评分并且是通过从未缩放评分su(此处：评分1)中减去主要截止值(3.892)获得的最终再缩放评分在两个组群(图4和图5)中都实现了高AUC。当应用更严格的0截止值而且当应用较不严格的-0.722截止值时，都没有(模拟)RS值＞25被遗漏(图6)。
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Claims (31)
1.对ERBB2阴性乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法，所述方法包括：
基于通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)确定的所述乳腺癌患者的乳腺肿瘤样品中ESR1、PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平来计算未缩放评分(su)，其中
a)较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ESR1 mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，将PGR mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，并且将MKI67mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联；或者
b)较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ESR1 mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，将PGR mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括在计算su之前：
通过RT-qPCR确定所述乳腺肿瘤样品中ESR1、PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述乳腺癌是ERBB2阴性且ESR1阳性的乳腺癌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在su的计算中，按照以下对ESR1、PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平(REL)进行加权：
REL(ESR1)∶REL(PGR)∶REL(MKI67)＝0.60(±0.09)∶1(±0.15)∶1.78(±0.27)。
5.根据权利要求4所述的方法，其中较高的评分su指示较高的RS≤25概率，并且其中su通过使用下式来计算：
su＝基线+WF(ESR1)·REL(ESR1)+WF(PGR)·REL(PGR)-WF(MKI67)·REL(MKI67)，其中WF(ESR1)是REL(ESR1)的加权因子，WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中较高的评分su指示较高的RS≤25概率，并且其中su通过使用下式来计算：
su＝12.313+0.539·REL(ESR1)+0.902·REL(PGR)-1.602·REL(MKI67)。
7.根据权利要求4所述的方法，其中较低的评分su指示较高的RS≤25概率，并且其中su通过使用下式来计算：
su＝-基线-WF(ESR1)·REL(ESR1)-WF(PGR)·REL(PGR)+WF(MKI67)·REL(MKI67)，
其中WF(ESR1)是REL(ESR1)的加权因子，WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
8.根据权利要求1至4和7中任一项所述的方法，其中较低的评分su指示较高的RS≤25概率，并且其中su通过使用下式来计算：
su＝-12.313-0..539·REL(ESR1)-0.902·REL(PGR)+1.602·REL(MKI67)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其还包括：
计算所预测的RS≤25概率q，其中：
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
其中，优选地，等于或大于预定阈值的q指示高RS≤25概率，并且小于预定阈值的q指示低RS≤25概率。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其还包括：
基于su来计算临床评分s，其中s的范围为0至100或者-10至10。
11.根据权利要求1至8和10中任一项所述的方法，其中：
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则等于或大于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且小于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS≤25概率；以及
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则小于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且等于或大于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS≤25概率。
12.对ERBB2阴性乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法，所述方法包括：
基于通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)确定的所述乳腺癌患者的乳腺肿瘤样品中PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平来计算未缩放评分(su)，其中：
a)较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将PGR mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，并且将MKI67 mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联；或者
b)较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将PGR mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，并且将MKI67mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在计算su之前：
通过RT-qPCR确定所述乳腺肿瘤样品中PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述乳腺癌是ERBB2阴性且ESR1阳性的乳腺癌。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中在su的计算中，按照以下对PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平(REL)进行加权：
REL(PGR)∶REL(MKI67)＝1(±0.15)∶1.60(±024)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中较高的评分su指示较高的RS≤25概率，并且其中su通过使用下式来计算：
su＝基线+WF(PGR)·REL(PGR)-WF(MKI67)·REL(MKI67)，
其中WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中较高的评分su指示较高的RS≤25概率，并且其中su通过使用下式来计算：
su＝25.490+0.847·REL(PGR)-1.353·REL(MKI67)。
18.根据权利要求15所述的方法，其中较低的评分su指示较高的RS≤25概率，并且其中su通过使用下式来计算：
su＝-基线-WF(PGR)·REL(PGR)+WF(MKI67)·REL(MKI67)，
其中WF(PGR)是REL(PGR)的加权因子，并且WF(MKI67)是REL(MKI67)的加权因子。
19.根据权利要求12至15和18中任一项所述的方法，其中较低的评分su指示较高的RS≤25概率，并且其中su通过使用下式来计算：
su＝-25.490-0.847·REL(PGR)+1.353·REL(MKI67)。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其还包括：
计算所预测的RS≤25概率q，其中：
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则通过使用下式来计算q：
其中，优选地，等于或大于预定阈值的q指示高RS≤25概率，并且小于预定阈值的q指示低RS≤25概率。
21.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其还包括：
基于su来计算临床评分s，其中s的范围为0至100或者-10至10。
22.根据权利要求12至19和21中任一项所述的方法，其中：
a)如果较高的评分su指示较高的RS≤25概率，则等于或大于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且小于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS≤25概率；以及
b)如果较低的评分su指示较高的RS≤25概率，则小于预定阈值的评分s或评分su指示高RS≤25概率，并且等于或大于所述预定阈值的评分s或评分su指示低RS＜25概率。
23.对ERBB2阴性乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测的方法，所述方法包括：
基于通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)确定的所述乳腺癌患者的乳腺肿瘤样品中ERBB2、ESR1、PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平来计算未缩放评分(su)，其中
a)较高的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ERBB2 mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，将ESR1 mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，将PGR mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，并且将MKI67mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联；或者
b)较低的评分su指示较高的RS≤25概率，其中将ERBB2 mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联，将ESR1 mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，将PGR mRNA的较高相对表达水平与较低的su相关联，并且将MKI67mRNA的较高相对表达水平与较高的su相关联。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法包括在计算su之前：
通过RT-qPCR确定所述乳腺肿瘤样品中ERBB2、ESR1、PGR和MKI67的mRNA的相对表达水平。
25.用于选择针对ERBB2阴性乳腺癌患者的乳腺癌治疗的方法，所述方法包括：
通过使用根据权利要求1至24中任一项所述的方法对所述乳腺癌患者的Oncotype
低风险复发评分(RS)结果(RS≤25)的概率进行预测；以及
如果预测到高RS≤25概率，则选择内分泌治疗作为针对所述乳腺癌患者的乳腺癌治疗。
26.根据权利要求25所述的方法，其中如果su、q或s高于预定阈值，则预测高RS≤25概率。
27.在乳腺癌患者中治疗ERBB2阴性乳腺癌的方法，其包括：
通过使用根据权利要求25或26所述的方法来选择用于所述乳腺癌患者的乳腺癌治疗；以及
向所述乳腺癌患者施用所选的乳腺癌治疗。
28.试剂盒在根据权利要求2、13和24中任一项所述的方法中的用途，其中所述试剂盒包含：
至少一对ERBB2特异性引物；
至少一对ESR1特异性引物；
至少一对PGR特异性引物；和/或
至少一对6KI67特异性引物。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述试剂盒还包含至少一种ERBB2特异性探针、至少一种ESR1特异性探针、至少一种PGR特异性探针和/或至少一种MKI67特异性探针。
30.根据权利要求28或29所述的用途，其中所述试剂盒还包含至少一对参考基因特异性引物，以及任选地，至少一种参考基因特异性探针。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的用途，其中所述参考基因选自B2M、CALM2、TBP、PUM1、MRLP19、GUSB、RPL37A和CYFIP1。
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