WO2023081988A1

WO2023081988A1 - Método para predição de eficácia de tratamento para câncer de mama

Info

Publication number: WO2023081988A1
Application number: PCT/BR2022/050424
Authority: WO
Inventors: Guilherme Portela COELHO
Original assignee: Coelho Guilherme Portela
Priority date: 2021-11-09
Filing date: 2022-11-04
Publication date: 2023-05-19

Abstract

A presente invenção se refere de modo geral a um método para predição de tratamento oncológico, mais particularmente, para tratamento de câncer de mama. O método para predição de tratamento oncológico compreende o índice de proliferação celular por MKI67 e pelo menos 5 genes de referência. Além disso, propõe, utilizando a mesma metodologia inovadora, ser o parâmetro melhor para avaliar quantitativamente outros genes que não o MKI67, também usando quantificação molecular de CK7, CK18 E CK19, em amostras de tumores epiteliais fixados em formalina e emblocados em parafina.

Description

MÉTODO PARA PREDIÇÃO DE EFICÁCIA DE TRATAMENTO PARA CÂNCER DE MAMA CAMPO DA INVENÇÃO [01] A presente invenção se refere de modo geral a um método para predição de tratamento oncológico. Mais particularmente, para predição de tratamento de câncer de mama, tal como um método de predição de tratamento de câncer de mama que compreende o índice de proliferação celular por MKI67 e parâmetros de quantificação de linfócitos que infiltram tumores (na língua inglesa, identificados pela sigla TIL’s), adicionados de pelo menos 5 genes de referência e avaliados na forma de um algoritmo inovador que visa a adicionar precisão aos métodos atualmente utilizados de quantificação (imuno- histoquímica e biologia molecular) de variáveis preditivas nos cânceres de origem epitelial (denominados carcinomas). ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [02] O câncer de mama é uma doença causada pela multiplicação desordenada de células anormais da mama, que forma um tumor com potencial de invadir outros órgãos. De modo geral, quatro de cada cinco casos de câncer de mama ocorrem após os 50 anos de idade, e esta malignidade é identificada principalmente em pacientes do sexo feminino. Fatores que podem aumentar o risco da doença podem ser divididos em a) fatores ambientais e comportamentais – tais como obesidade e sobrepeso após a menopausa, sedentarismo, ingestão de bebida alcoólica, exposição a radiações ionizantes, tabagismo; b) fatores da história reprodutiva e hormonal do paciente – tais como menstruação antes dos 12 anos de idade, mulheres sem filhos biológicos, primeira gravidez após os 30 anos, menopausa após os 55 anos, uso de contraceptivos hormonais ou reposição hormonal pós menopausa, principalmente por período superior a cinco anos; e c) fatores genéticos e hereditários – tais como histórico familiar de câncer de ovário, câncer de mama em homens ou mulheres e alteração genética, principalmente nos genes BRCA1 e BRCA2. [03] De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (Brasil), tal malignidade deve acometer aproximadamente 66.280 novos indivíduos no ano de 2021 e o país deve perder no mesmo período aproximadamente 18.295 vidas, sendo 18.068 mulheres e 227 homens. Tal estimativa de casos representa aproximadamente 30% das mulheres que são acometidas por câncer no país. [04] Sabe-se de modo geral que a detecção precoce do câncer de mama diminui radicalmente a probabilidade de morte do paciente. Assim, detectar e tratar o câncer de mama em seu estágio inicial é crucial para aumentar as chances do paciente sobreviver a esta doença. A detecção do câncer de mama pode ocorrer por meio de autoexame físico da mama, realizado pelo próprio paciente, ao apalmar a área da mama; ou por meio de exames clínicos, tais como mamografia, ultrassonografia ou ressonância magnética. Quando da identificação de quaisquer nódulos mamários no paciente, uma amostra de um fragmento da área suspeita (procedimento de biópsia) deve ser extraída por meio de punção e submetida à avaliação histológica por um patologista para determinação de se o nódulo é benigno ou maligno (câncer). [05] Em se identificando que a lesão é realmente um câncer de mama, a próxima etapa é a determinação dos possíveis métodos de tratamento adequados para cada paciente. Sabe-se, de antemão, que a quimioterapia antineoplásica tradicional (convencional) tem maior efeito na redução quantitativa das células cancerígenas quanto maior for o índice proliferativo (que se reflete em velocidade de crescimento) do tumor maligno (câncer). Ainda, os tratamentos normalmente são baseados nos estágios da doença no paciente – a saber estágio 0 (carcinoma in situ) e, em seguida, os estágios de I a IV. Quanto maior for o estágio detectado, por exemplo, estágio IV, mais avançada está a doença (Oncoguia, 2021). [06] Testes de expressão genica do câncer de mama também podem utilizados para melhorar a acurácia do entendimento da biologia tumoral no diagnóstico do câncer de mama e determinar se os pacientes, majoritariamente mulheres, se beneficiarão da quimioterapia antes ou após a cirurgia da mama, visto que a terapia hormonal é um tratamento padrão para o câncer de mama receptor hormonal positivo, mas nem sempre está claro quando fazer a quimioterapia. Tais testes levam em consideração diferentes conjuntos de genes do câncer de mama e são normalmente utilizados para estudo complementar de cânceres em estágio inicial, já que, por exemplo, nos cânceres em estágios avançados (III e IV) geralmente está clara a necessidade terapêutica da quimioterapia (www.oncoguia.org.br, acessado em 19 de agosto de 2021). Exemplos de tais testes são listados a seguir. [07] Oncotype DX^® - usado para tumores receptores de hormônio positivo, estágios I, II ou III, que não se disseminaram para mais de três linfonodos e são negativos para HER2. Também pode ser usado para carcinoma ductal in situ ou câncer de mama estágio 0. Tal método analisa um conjunto de 21 genes nas células da amostra do tumor para determinar uma pontuação de 0 a 100, em que quando a pontuação resultante encontra-se na faixa de 0 a 25 – significa que o tumor apresenta baixo risco de recidiva nos próximos 10 anos; e quando a pontuação se situa entre 26 e 100 – uma alta probabilidade de recidiva do tumor é atribuída. Ainda, segundo o método proposto, pacientes com baixo risco de recidiva provavelmente não se beneficiarão com o tratamento de quimioterapia, apresentando ainda bons resultados quando tratados sistemicamente apenas com hormonioterapia. Por outro lado, pacientes considerados de alto risco de recidiva provavelmente se beneficiarão da quimioterapia adicionada à hormonioterapia com o intuito de diminuir a chance da recidiva. [08] MammaPrint^® - usado para determinar qual a probabilidade dos cânceres de mama que são mais susceptíveis de metástases após o tratamento inicial. Pode ser usado com intenção de prognóstico e preditiva para qualquer tipo de câncer de mama invasivo com até 5 cm e que tenha se disseminado para não mais do que 3 linfonodos. Esse teste pode ser realizado independentemente do status hormonal e do status HER2. Tal exame analisa a atividade de 70 genes diferentes para determinar se o câncer é de baixo ou alto risco ou se existe a probabilidade de recidiva da doença em 10 anos. Classifica as lesões em tipos moleculares, a saber: Luminal (A e B), HER2 enriquecido e demais grupos que se encontram na denominação “triplo negativo”, ou seja, negativos para receptores hormonais (estrogênio e progesterona) e HER2. Sabe-se que os carcinomas do tipo Luminal A não respondem bem à quimioterapia clássica pelo motivo de se caracterizarem por um crescimento mais lento (menor índice de proliferação celular). [09] Prosigna^® - usado para prever o risco da recidiva em 10 anos em mulheres menopausadas e com câncer de mama invasivos receptor de hormônio positivo. Pode ser usado para testar tumores em estágio I ou II que não se disseminaram para os linfonodos, ou cânceres em estágio II com não mais que 3 linfonodos positivos. O teste analisa 50 genes classificando os resultados como risco baixo, intermediário ou alto. [010] Os testes supracitados, considerados de alta complexidade tendo em vista a análise de vários genes, não são normalmente realizados no Brasil por falta de estrutura técnica e/ou por força de registros e patentes e, por isso, podem envolver o dispêndio de milhares de dólares por parte do paciente. Um segundo inconveniente destes testes é também o longo tempo de espera pelos resultados – que pode ser de várias semanas - deixando o paciente em um alto nível de ansiedade quanto à eficácia do tratamento oncológico a ser seguido. [011] A patente EP3059322 intitulada “Gene expression markers for breast cancer prognosis” e depositada em 14 de janeiro de 2004 trata de um método para prever a probabilidade de sobrevivência a longo prazo de um paciente com câncer de mama sem a recorrência do câncer de mama, compreendendo: determinar o nível de expressão de um transcrito de mRNA de MDM2, em uma amostra de tecido de câncer de mama obtida do paciente, normalizado contra o nível de expressão de um conjunto de referência de transcritos de mRNA na amostra de tecido de câncer de mama; em que a expressão aumentada de mRNA de MDM2 indica um aumento da probabilidade de sobrevivência sem recorrência do câncer de mama; em uma modalidade particular, os níveis de expressão de pelo menos dois, ou pelo menos 5, ou pelo menos 10, ou pelo menos 15 dos transcritos de RNA prognóstico ou seus produtos de expressão são determinados. Em outra modalidade, o método compreende a determinação dos níveis de expressão de todos os transcritos de RNA de prognóstico ou seus produtos de expressão. [012] A patente EP2294215 intitulada “Tests to predict responsiveness of cancer patients to chemotherapy treatment options” e depositada em 12 de maio de 2009 descreve um método para predizer a probabilidade de resposta de pacientes acometidos por câncer à tratamento incluindo taxano ou ciclofosfamida. [013] Constitui ainda estado da técnica o pedido de patente US20130084587 intitulado “Levels of cytokeratins in blood and body fluids as biomarkers for cancer screening, diagnosis and treatment monitoring” e depositado de 01 de outubro de 2011, que descreve que as células cancerosas humanas expressam vários tipos de citoqueratinas, dependendo do tipo específico de célula cancerosa. Reivindica, dessa forma, um método para detectar os níveis de proteína de citoqueratina 7 (CK7) no sangue ou em fluídos corporais por reação imune como um biomarcador para diagnóstico e monitoramento de tratamento para câncer no pulmão e câncer de mama. [014] O pedido de patente internacional WO2020094399 intitulado “Predictive methods in breast cancer" publicado em 14 de maio de 2020 traz como invenção um método para prever a probabilidade de um resultado de pontuação de recorrência de baixo risco (RS) do teste Oncotype DX * (RS <25) para um paciente com câncer de mama ERBB2 negativo, o referido método compreendendo: calcular uma pontuação não selada (su) com base nos níveis de expressão relativa de mRNA de ESR1, PGR e MKI67 em uma amostra de tumor de mama do paciente com câncer de mama. SUMÁRIO DA INVENÇÃO [015] A presente invenção tem como objetivo fornecer um método alternativo aos acima propostos, provendo aos pacientes resultados mais rápidos, em até 7 dias, e a um custo menor independentemente de origem geográfica. Tal método compreende avaliar o índice de proliferação celular por MKI67 e pelo menos 5 genes de referência escolhidos e customizados de forma inovadora, portanto diversa dos testes atuais. Ainda pretende, pela mesma lógica metodológica que visa a maior acurácia de mensuração de biomarcadores moleculares, ser uma evolução no padrão de geração dos algoritmos quantitativos destes biomarcadores. Exemplos dos genes de referência que podem ser utilizados neste método são: genes das 3 citoqueratinas (CK7, CK18 e CK19) combinados a genes ubíquos de referência (Beta-actina, GAPDH, RPLPO, GUS, TFRC) DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [016] A menos que definidos de outros modos, os termos técnicos e científicos usados no presente documento são de conhecimento de um técnico no estado da arte à qual esta invenção pertence. [017] O termo “tumor” como usado no presente documento, refere-se a um crescimento ou proliferação celular neoplásica, que pode ser maligna ou benigna. [018] O termo “câncer” ou “canceroso” refere-se ou descreve uma condição encontrada em mamíferos que é tipicamente caracterizada por um crescimento celular não regulado, capaz de espalhar-se à distância e/ou com alta probabilidade de causar óbito por efeito de seu crescimento. [019] O termo “patologia” do câncer inclui todos os fenômenos que comprometem o bem-estar do paciente, incluindo, mas sem limitação, crescimento celular anormal ou descontrolado, interferência no funcionamento normal de células vizinhas, liberação de citocinas e outros produtos secretados em níveis anormais, supressão ou agravamento de resposta inflamatória ou imunológica, neoplasia, pré- malignidade, malignidade, invasão de tecidos vizinhos ou distantes, tais como linfonodos, etc. [020] O termo “citocina” refere-se a uma designação genérica de certas substâncias segregadas por células do sistema imunitário que controlam a imunorreação do organismo. [021] O termo “citoqueratinas” (CQ, ou da língua inglesa CK) define constituintes do citoesqueleto das células epiteliais, pertencendo aos filamentos intermediários. Sua distribuição é específica para cada subtipo de epitélio, permitindo que sejam utilizadas como importantes marcadores de sua origem ou diferenciação. [022] O termo “prognóstico” como usado no presente documento, refere-se à predição de uma probabilidade de progressão ou morte atribuída a câncer, incluindo recorrência, metástase e resistência à fármacos, de uma doença neoplásica, como o câncer de mama. [023] O termo “predição” como usado aqui refere-se à probabilidade de que o paciente responda favoravelmente ou não a um fármaco ou conjunto de fármacos, e também à extensão destas respostas, ou se o paciente irá sobreviver, após a remoção cirúrgica de um tumor e/ou à quimioterapia por um período predeterminado de tempo sem recorrência de câncer. [024] O termo “sobrevivência à longo prazo” refere-se à sobrevivência de um paciente por pelo menos 3 anos, preferencialmente por pelo menos 8 anos e ainda mais preferencialmente por pelo menos 10 anos após a cirurgia ou outro tratamento contra o câncer. [025] O termo “estroma tumoral” refere-se a um compartimento morfológico muito importante na modulação do crescimento e invasão tumorais. As relações entre as células epiteliais e o respectivo estroma não são ainda completamente entendidas no estado da técnica. Problema técnico [026] Atualmente ainda é um gargalo da medicina predizer a necessidade de tratamento quimioterápico a indivíduos portadores de câncer cujos tumores foram removidos cirurgicamente, especialmente câncer de mama, até porque estes tratamentos quimioterápicos possuem a característica de produzir efeitos colaterais a curto prazo na maioria dos pacientes como náuseas, dor de cabeça, perda de peso, queda de cabelo, bem como efeitos a longo prazo, como queda da imunidade, toxicidade hepática, anemia, fadiga, infertilidade, etc. [027] O principal problema técnico para tratamento de pacientes acometidos por câncer é a determinação de um parâmetro acessível, que apresente acurácia e reprodutibilidade, para quantificar o provável efeito (benefício) de tratamento quimioterápico em pacientes com câncer, em especial câncer de mama do tipo carcinoma invasor luminal (RH+ e HER2 não amplificado), pois nem os parâmetros de biologia tumoral usualmente utilizados (índice de proliferação celular por ki67- imunohistoquímica, morfologia tumoral ao exame de microscopia óptica na forma de classificação histológica e graduação histológica), nem os parâmetros clínicos (por exemplo: estadiamento e/ou idade da paciente, comorbidades, etc.) fornecem uma resposta suficientemente conclusiva para a tomada de decisão de indicação ou não do referido tratamento em muitos casos. [028] Métodos como os listados no estado da técnica do presente documento visam a estabelecer parâmetros clínicos, morfológicos, genético-molecuares e histoquímicos para determinação da probabilidade de recorrência de câncer em pacientes, orientando assim a tomada de decisão sobre se tal paciente deve ou não ser submetido à tratamento quimioterápico citotóxico após procedimento de remoção do câncer, em especial o câncer de mama. Sabe-se, contudo, que tais exames genético-moleculares de grande complexidade são, na sua maioria, feitos em grandes centros dos Estados Unidos e Europa e, além de possuir o inconveniente de ter um alto custo para o paciente, podem levar várias semanas até que o resultado final seja emitido, o que pode ser prejudicial à saúde do paciente, uma vez que quanto mais cedo for tratado o câncer, maiores as chances de sobrevivência do paciente. Solução do problema [029] A presente invenção visa a fornecer um método alternativo de determinação da probabilidade de recorrência do câncer em indivíduos, especialmente em indivíduos portadores de câncer de mama, avaliando o índice de proliferação celular por MKI67 e pelo menos 5 genes de referência. Exemplos dos genes de referência que podem ser utilizados neste método são: genes das 3 citoqueratinas (CK7, CK18 e CK19) combinados a genes ubíquos de referência (Beta-actina, GAPDH, RPLPO, GUS, TFRC). Além disso, propõe, utilizando a mesma metodologia inovadora, ser o parâmetro melhor para avaliar quantitativamente outros genes que não o MKI67, tais como ERS, RP, HER2, CD3, CD163 ou PDL1, também usando quantificação molecular de CK7, CK18 E CK19. Efeitos vantajosos da invenção [030] De acordo com um aspecto da presente invenção, o presente método que inclui as citoqueratinas 7, 18 e 19 na função de controlador (genes de referência) e/ou no cálculo de estimativa de celularidade neoplásica dentro da amostra procedente da massa tumoral de um indivíduo fornecerá resultados mais precisos para indicação de terapia quimioterápica para pacientes com câncer, em especial câncer de mama. [031] Especificamente em relação ao teste Oncotype®, o presente método possui a vantagem de incluir as citoqueratinas 7, 18 e 19 na função de controlador (genes de referência) e/ou no cálculo da estimativa de celularidade neoplásica procedente da massa tumoral. Modalidades da invenção [032] Em uma modalidade da invenção é fornecido um método de predição de tratamento para câncer, mais especificamente para câncer de mama, que inclui avaliar a expressão genica das citoqueratinas 7, 18 e 19 com pelo menos cinco genes de referência (GR) universais. [033] Tal método surge como solução alternativa para parametrizar o resultado final da avaliação subjetiva do índice de proliferação celular por KI67 com auxílio de expressão de genes de referência (não associados ou pouco associados à biologia do câncer de mama) mas que se expressem virtualmente com exclusividade nas células epiteliais (o carcinoma de mama é um câncer de origem epitelial onde há variação de densidade destas células - em relação ao estroma - em diferentes amostras submetidas a avaliação molecular). Em um dado exemplo, Células de Carcinomas da Mama do tipo Luminal sem superexpressão de Her2 (Receptor Hormonal+/HER2-) expressam citoqueratinas de peso molecular 7, 18 e 19, tendo estas, entre outras, a função de constituir seu citoesqueleto. Nas células endoteliais, leucócitos e fibroblastos (estroma tumoral) essa expressão é virtualmente ausente. As diferentes proporções de epitélio maligno e estroma tumoral nas diferentes amostras submetidas a estudo molecular são potencial fator de confusão na interpretação quantitativa das variáveis (biomarcadores) em estudo, salvo se parametrizadas pela expressão molecular de marcadores epiteliais (citoqueratinas). [034] Materiais de biópsia de mama com diagnóstico de câncer do tipo carcinoma luminal (RH+/HER2-) medindo seu potencial de predição do efeito quimioterápico em pacientes submetidos à quimioterapia neoadjuvante (ou seja, antes da cirurgia) através do desfecho padronizado denominado RCB (Residual Cancer Burden) que é mensurável no produto de ressecção cirúrgica do local da mama afetado pelo câncer que ocorre posteriormente são testados conforme exame anatomopatológico padrão. [035] Para definição dos parâmetros do presente método, foram analisadas centenas amostras de tumores de mama provenientes do banco de dados do Laboratório Diagnose e parceiros, do tipo luminal. [036] Em um aspecto, a Celularidade Tumoral Total da amostra é estimada pela adição e/ou associação das citoqueratinas 7, 18 e 19 (CKs) com 5 genes de referência (GR) universais; [037] a Celularidade Neoplásica é estimada pela expressão gênica das queratinas 7, 18 e 19; e, [038] a Celularidade do Estroma Tumoral é estimada pela relação e/ou subtração (GR)-(CKs). [039] A quantificação de MKI67 das células neoplásicas (X) é determinada pela diferença da MKI67 total da amostra da área tumoral menos a MKI67 do estroma tumoral conforme Fórmula 1 a seguir:

[040] De outro modo tem-se na Fórmula 2 a seguir a relação das diferenças de ciclo de amplificação da reação de PCR em tempo real e/ou Sequenciamento de Nova Geração (em inglês, sigla NGS):

[041] onde: ^CT é diferença de ciclo de amplificação da reação de PCR em tempo real entre MKI67 e os demais parâmetros de referência (sejam citoqueratinas (CKs) ou genes de referência (GR), avaliados isoladamente ou em conjunto. [042] Resumidamente tem-se ainda a Fórmula 3:

em que, • se X > A – indica que o paciente portador de câncer de mama se beneficiará de tratamento quimioterápico; • se X < A – indica que o paciente portador de câncer de mama não se beneficiará de tratamento quimioterápico; ou, • se X = A – indica que o paciente portador de câncer de mama se beneficiará de tratamento quimioterápico.^ [043] Várias modificações são possíveis dentro do escopo de um aspecto da presente invenção definido pelas reivindicações, e as modalidades que são produzidas mediante a combinação adequada dos meios técnicos revelados de acordo com diferentes modalidades também estão incluídas no escopo técnico da presente invenção. Também está incluída no escopo técnico da presente invenção uma configuração na qual elementos constituintes, descritos nas modalidades e tendo mutuamente os mesmos efeitos, são substituídos uns pelos outros.

Claims

REIVINDICAÇÕES: 1. MÉTODO para predizer se um indivíduo portador de câncer de mama se beneficiará de tratamento quimioterápico caracterizado por compreender: - medir um nível de expressão de pelo menos três citoqueratinas (CK) em uma amostra tumoral de um paciente; - medir um nível de expressão de MKI67 na dita amostra tumoral do paciente; - medir o nível de expressão de pelo menos cinco genes de referência (GR); e - comparar os níveis de expressão das pelo menos três citoqueratinas, dos pelo menos cinco genes de referência (GR) e do nível de expressão de MKI67, ERS, RP, HER2 ou PDL1 da amostra tumoral do paciente para avaliar a probabilidade de um indivíduo se beneficiar de tratamento quimioterápico para o dito câncer de mama. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas pelo menos três citoqueratinas serem CK7, CK18 e CK19. 3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os genes de referência (GR) serem selecionados de Beta- actina, GAPDH, RPLPO, GUS e TFRC. 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os níveis de expressão de citoqueratinas (CK), dos pelo menos cinco genes de referência (GR) e do nível de expressão de MKI67 estarem relacionados pelas seguintes Fórmulas:

em que, • se X > A – indica que o paciente portador de câncer de mama se beneficiará de tratamento quimioterápico; • se X < A – indica que o paciente portador de câncer de mama não se beneficiará de tratamento quimioterápico; ou, • se X = A – indica que o paciente portador de câncer de mama se beneficiará de tratamento quimioterápico. 5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o câncer ser Carcinoma da Mama do tipo Luminal sem superexpressão de Her2 (Receptor Hormonal+/HER2-). 6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as ditas medições de MKI67 serem feitas pelo método de Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) em tempo real e/ou Sequenciamento de Nova Geração.