KR102599695B1 - 마커 사람 부고환 단백질 4 (he4) 기반의 폐 선암 재발의 발견 방법 및 관련 용도 - Google Patents
마커 사람 부고환 단백질 4 (he4) 기반의 폐 선암 재발의 발견 방법 및 관련 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 마커 사람 부고환 단백질 4 (HE4) 및 임의의 시토케라틴-19 단편 (Cyfra21-1)에 기반하여 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법 및 폐 선암의 재발의 시험관 내 평가에서 마커의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 마커 사람 부고환 단백질 4 (HE4) 및 임의의 시토케라틴-19 단편 (Cyfra21-1)을 기반으로 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법 및 폐 선암의 재발에 대한 시험관 내 평가 마커의 사용에 관한 것이다.
폐암은 전 세계에서 가장 흔한 암으로, 2012 년에는 약 180 만 건의 새로운 사례와 160 만 건의 사망이 발생했다. 폐암 치료는 암의 특정 세포 유형, 확산 정도, 사람의 활동도에 따라 결정된다. 일반적인 치료에는 완화 치료, 수술, 화학 요법 및 방사선 요법이 포함된다. 폐암의 표적 치료는 진행성 폐암에서 그 중요성이 커지고 있다. 성공적인 치료 후에, 환자는 재발 여부를 신중하게 모니터링해야한다. NSCLC의 예후 인자로는 폐 증상의 유무, 종양 크기, 세포 유형 (조직학), 확산 정도 (병기) 및 다중 림프절 전이 및 혈관 침범 등이 있다. NSCLC의 경우, IA 병기 병변의 완전 수술적 절제로 5 년 생존률이 70 % 에 달하는 최상의 예후를 달성한다.
재발을 발견하기 위해 절제 후 폐 선암 (ACL) 환자를 감시하는 표준 치료는 고급 영상, 대부분의 사례에서 컴퓨터 단층 촬영이다. 현재까지 시험관 내 검사, 예를 들어, 마커 단백질 기반의 혈액-기반 검사는 재발의 조기 발견에 일상적으로 사용되지 않는다.
시토케라틴-19 단편 (Cyfra21-1)은 폐암의 재발을 발견하는 마커로 제안되고 있다. 재발한 소수의 환자 (n= 15)에서 Cyfra21-1 수준은 재발 전 또는 당시에 증가한 것으로 나타났다. 그러나, 환자는 조직학적으로 구별되지 않으며, 임상적 의사 결정을 돕는 교시 (예를 들어, 재발을 발견한 영상)도 없다 (Niklinski et al., 1995, J Cardiovasc Surg (Torino) 36(5): 501-514). 이 발견은 재발 시에 Cyfra21-1 수준 증가를 기술하기 위해 환자의 작은 코호트 (n= 15)에서, 역시 Cyfra21-1를 사용한, 다른 연구 집단에 의해 확인되었다 (Stieber et al., 1999, Anticancer Research 19:2665-2668). 그러나, 이 논문은 또한 ACL (폐 선암)과 비 ACL을 구별하지 않고 있다. 게다가, 재발의 초기 진단에서 Cyfra21-1은 아직 확립된 모니터링 마커가 되지 못했다.
따라서, 비용이 많이 들고 방사선 노출과 연관된, 상당한 크기의 종양에만 적합한, 상기 영상 기법의 필요성을 회피하거나 최소화하는 적합한 시험관 내 검사 방법이 여전히 필요하다.
놀랍게도, 임의로 Cyfra21-1과 조합된 사람 부고환 단백질 4 (HE4)가 재발의 조기 발견에 적합하다는 것이 밝혀졌다. 실시예 및 도 1에 나타낸 바와 같이, HE4는 Cyfra21-1보다 약간 우수한 것으로 밝혀졌으며, HE4 및 Cyfra21-1의 조합은 민감도 및 곡선 아래 면적 (AUC)에 대한 재발의 조기 발견에서 최상의 결과를 산출했다.
따라서, 첫 번째 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법에 관한 것이다:
a) 개체로부터 얻은 샘플에서 마커 분자 사람 부고환 단백질 4 (HE4)의 양 또는 농도를 측정하는 단계, 및
b) 단계 (a)에서 결정된 양 또는 농도를 대조군에서 확립된 양 또는 농도와 비교하여 재발을 발견하는 단계로서, 대조군에 비해 증가된 HE4의 값은 재발의 지표이다.
임의로, 단계 (a)는 개체로부터 얻은 샘플에서 마커 분자 시토케라틴-19 단편 (CYFRA 21-1)의 양 또는 농도를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 대조군에 비해 증가된 CYFRA 21-1의 값은 재발의 지표이다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법에 관한 것이다:
a) 개체로부터 얻은 샘플에서 마커 분자 HE4 및 CYFRA 21-1의 양 또는 농도를 측정하는 단계, 및
b) 단계 (a)에서 결정된 마커에 대한 조합된 값을 대조군에서 확립된 조합된 값과 비교하여 재발을 발견하는 단계로서, 대조군에 비해 증가된 조합된 값은 재발의 지표이다.
HE4는 고도로 보존된 WAP (유장 산성 단백질) 도메인 함유 단백질 (13kD)을 암호화하며, 이는 추정되는 세린 프로테아제 억제제 활성을 암시한다. 성숙한 당화 형태에서 이 단백질은 약 20-25 kD 이며 두 개의 WFDC (유장 산성 4-디설파이드 코어) 도메인을 함유하는 단일 펩타이드로 구성된다. 단백질은 정자 성숙과 관련이 있으며 잠재적으로 자연 면역에 역할을 하지만, HE4의 생물학적 기능은 알려져 있지 않다. 흥미롭게도, HE4는 개의 섬유화 신장에서 가장 상향 조절된 유전자로 식별되었다. HE4는 또한 생쥐의 섬유화 신장에서 현저히 상향 조절되는 것으로 보고되었고, 사람 신장 이식 생검에서의 전사 수준은 낮은 추정 사구체 여과율과 강하게 상관 관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 관찰에도 불구하고, 신장 섬유증에서의 HE4의 역할 및 추정되는 세린 프로테아제 활성은 아직 밝혀지지 않았다.
HE4 cDNA는 사람 부고환에서 처음으로 분리되었고 (Kirchhoff et al., 1991 Biol. Reprod. 45:350-357), 그 후에 HE4 cDNA는 난소암으로 제작된 cDNA 라이브러리에서 높은 빈도로 발견되었다 (Wang et al., 1999 Gene 229:101, Schummer 등, 1999 Gene 238:375). HE4a의 정정된 서열은 Hellstrom et al., 2003, Cane. Res. 63:3695-3700 및 미국 특허 제 7,270,960 호에 기재되어 있다. HE4a는 이전 발행물에서 HE4로 언급된 분자의 추론 서열과 매우 유사하지만, 구별되는 아미노산 서열을 나타낸다. 본 개시의 목적상, HE4 또는 HE4a는 동의어로 간주되며, 본 명세서에서는 HE4와 동의어로 지칭된다. HE4 및 정정된 서열 HE4a의 아미노산 서열은 Kirchhoff 등의 상기 문헌 및 US 7,270,960에서 각각 공지되어있다.
지금까지, HE4는 예후 인자로 제시되었지만, 모니터링 마커로서는 아니었다. 종양 바이오 마커는 다른 유형들로 나눌 수 있다. 예후 마커는 객관적으로 측정 가능하고 암 질환의 가능성있는 결과에 대한 정보를 제공하는 임상적 또는 생물학적 특징이다. 질병 진행 과정에서 환자가 얼마나 잘 행동하는지 (예를 들어, 더 공격적인 질병과 짧은 생존 여부 등), 질병이 어떤 시점에서 어떻게 행동할지를 알려준다. 그것은 환자의 전반적인 결과, 예컨대 표준 치료 후 암 재발 가능성을 객관적으로 평가하는 것을 목표로 한다. 전형적으로, 예후 바이오 마커는 진단 당시에 측정되고 평가된다. 예후 마커의 유무는 치료를 위해 환자를 선택하는 데 유용할 수 있다. 반대로 모니터링 마커는 암 재발의 시점에 대한 정보를 제공하고 암이 회귀하거나 회귀되는 시점을 예측하거나 지시하는 임상적 또는 생물학적 특징이다. 이는 특정 임상적 중재의 필요 시점을 객관적으로 평가하는 것을 목표로 한다. 중요하게, 예후 인자는 환자 또는 종양의 특성이 환자의 결과에 미치는 영향을 정의하는 반면, 모니터링 인자는 질병 재발의 시점을 정의힌다. 따라서, 모니터링 마커는 치료 후 측정된다. 측정은 환자를 모니터링하기 위해 반복, 예를 들어 빈번하게 (적어도 3, 4 또는 5 회), 일정 간격으로 (예를 들어, 3 또는 6 개월마다) 또는 미리 결정된 시간 등에 (예를 들어, 치료로부터 3, 6 또는 9 개월 또는 치료 후 1 년마다)할 수 있다.
본 발명 이전에, HE4 발현은 나쁜 예후와 관련되고, 폐 선암의 가능한 예후 인자라는 것이 밝혀졌다. (Yamashita et al., 2011, Tumor Biol. 32:265-271; Yamashita et al., 2012, J Thoracic Oncology 7 (6), Suppl.1, S44). 따라서 HE4는 예후적 가치가 있다고 제안되었다. HE4는 아직까지 폐 선암에 대한 모니터링 마커로 알려져 있지 않다.
Cyfra21-1은 시토케라틴 계열에 속한다. 시토케라틴은 세포 골격의 주요 구성 요소인 상피 매개체 필라멘트의 소단위를 형성하는 구조 단백질이다. 지금까지 40 내지 70 Kilodaltons (kD) 범위의 분자량을 갖는 20 개의 다른 시토케라틴 폴리펩타이드가 확인되었다. 세포에 의해 합성되는 시토케라틴의 유형은 또한 성장 및 분화율의 영향을 받는다. 그들의 특정 분포 패턴으로 인해 종양 병리학에서 분화 마커로 사용하기에 대단히 적합하다. CYFRA21-1은 상피 세포에서 세포 골격의 일부인 시토케라틴 19의 단편이며, 상피 기원의 종양에서 과발현된 방법으로 밝혀질 수 있다. 손상되지 않은 시토케라틴 폴리펩타이드는 잘 용해되지 않지만, 가용성 단편은 혈청에서 발견될 수 있다 (Bodenmueller et al., 1994, Int. J. Biol. Markers 9: 75-81). CYFRA21-1은 비소세포 폐암 (NSCLC)에 대한 잘 확립된 마커이다. CYFRA21-1의 주 지표는 비소세포 폐암 (NSCLC)의 진행 과정을 모니터링하는 것이다 (Sturgeon, 2001, Clinical Chemistry 48:1151-1159). 1차 진단에서 높은 CYFRA21-1 혈청 수준은 비소세포 폐암 환자에서 진행된 종양 병기와 나쁜 예후를 나타낸다 (van der Gaast 등, 1994, Br.J. Cancer 69:525-528). 정상 또는 약간 상승한 값은 종양의 존재를 배제하지는 않는다. 성공적인 치료는 CYFRA21-1 혈청 농도가 정상 범위로 급격히 떨어짐으로써 입증된다. 일정한 CYFRA21-1 값 또는 CYFRA21-1 값의 약간의 또는 완만한 감소는 종양의 불완전한 제거 또는 상응하는 치료 및 예후 결과를 갖는 다중 종양의 존재를 나타낸다.
폐암은 또한 폐의 암종 또는 폐암으로 알려져 있으며 폐 조직에서 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 악성 폐 종양이다. 치료를 받지 않으면, 이 성장은 인근 조직이나 신체의 다른 부위로의 전이 과정에 의해 폐를 넘어 확산될 수 있다. 원발성 폐암으로 알려진, 폐에서 시작하는 대부분의 암은 상피 세포에서 유래 된 암종이다. 폐암의 주요 4 가지 조직학적 유형은 편평 세포 암종, 선 암종, 대세포 암종 및 소세포암종 (SCLC)이다. 처음 세 가지 아형은 일반적으로 비소세포 암종 (NSCLC)이라고 하며 폐암의 약 80 %를 차지한다. 폐 종양의 진단은 일반적으로 영상 방법 및 생검 샘플 분석을 기반으로 한다. 2004 세계 보건기구 (WHO)의 폐 종양 체계는 폐암 분류의 토대가 되고 있다. 이것은 폐암종의 이종성 인식, 일부 신경 내분비 종양의 일상적 진단을 위한 진단 면역 조직 화학 염색 (IHC) 기술의 도입 및 새롭게 기술된 개체들, 예컨대 태아 선암종, 낭성 점액성 종양, 대세포 신경내분비 암종의 인지를 포함하는 많은 발전을 통합했다.
2011 년에는 국제 폐암 연구 협회 (IASLC), 미국 흉부 학회 (ATS) 및 유럽 호흡기 학회 (ERS)를 대표하는 종합 전문가 패널이 분류 시스템의 주요 개정판을 제안했다. 이러한 변화는 주로 선암의 분류와 편평세포 암종과의 구분에 영향을 미친다. 종양 전문의와 병리학자에 의한 종양 분류에 관한 현재의 국제 표준은 "폐, 흉막, 흉선 및 심장 종양의 WHO 분류"(Travis 외, 2015, WHO 종양 분류, 제 7 권, 4 판)에 의해 제공된다. 본 발명의 맥락에서 의심스러운 경우, 상기 표준이 적용되어야 한다.
선암은 현대 시리즈 중에서 폐암의 가장 흔한 유형으로, 폐암의 약 절반을 차지한다. 증가한 선암의 발병률은 1960년대에 저-타르 필터 담배의 도입으로 인한 것으로 생각되지만, 이러한 인과 관계는 증명되지 않았다. 폐 선암은 몸 전체의 점액 분비샘에서 형성되는 폐암의 한 유형이다. 폐 선암 I 및 Ⅱ 병기의 수용된 치료는 외엽 절제술보다 선호되는 전엽 또는 더 큰 절제인 수술적 절제술이다 (하기 참조). 체계적인 종격동 림프절 절제술의 수행은 병기의 정확성을 향상시키고 치료 효과를 가질 수 있다. 이 환자들의 적어도 50 %가 국소 재발 또는 원격 전이를 일으킬 것이다. 따라서, 재발의 조기 발견은 폐 선암과의 관련성이 높다.
본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명은 재발을 발견하는 것에 관한 것이다. 재발은 과거의 의학적 상태, 현재 폐 선암종의 재발이다. 상태의 징후와 증상은 관해 후에 되돌아간다. 암 재발은 치료 후 및 암이 발견될 수 없는 기간 후에 암의 회귀로 정의된다. 같은 암이 처음 발견되었던 같은 장소에 또는 매우 인접하게 다시 나타난다.
재발은 한 개체에게서 발견되어야 한다. 본 발명에 따른 개체는 임의의 사람 또는 비-사람 동물, 특히 포유 동물일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물은 사람 및 수의학적 질환 모두에 적용 가능하다. 명백하게, 특히 관심이있는 사람이 아닌 포유 동물은 가축, 애완 동물 및 상업적 가치 (예를 들어 가축, 예컨대 말) 또는 개인적 가치 (예를 들어, 애완 동물, 예컨대 개, 고양이)가 있는 동물을 포함한다.
이 방법은 재발에 대한 모니터링을 포함하는 진단 방법이 일반적으로 사용되는 사람 대상자에게 특히 바람직하다. 따라서 특히 바람직한 구현예에서, 개체는 사람이다. 선택적으로 또는 부가적으로, 개체는 폐 선암에 대하여, 특히 절제 및/또는 화학 요법에 의해 성공적으로 치료된 것으로 간주된다. 폐 선암에 대한 "성공적 치료"는 치료 후 환자가 더 이상 폐 선암의 어떠한 의학적 징후 및 증상도 나타내지 않는다는 것을 의미한다. 그러나 발견되지 않은 암세포는 치료 후 체내에 남아있어 나중에 암이 회귀하게 된다 (재귀 또는 재발로 지칭함).
"절제"는 손상된 장기 또는 구조의 일부 또는 전부를 수술적으로 제거하는 것, 특히 종양의 제거이다. 폐 절제는 폐의 전부 또는 일부를 수술적으로 제거하는 것이다. 절제 유형은 종양 위치, 크기 및 유형뿐만 아니라 진단 전 전반적인 건강 및 폐 기능을 기반으로 한다. 폐는 오른쪽에는 3 개의 엽(lobe)이 있고 왼쪽에는 2 개의 엽이 있다. 일반적으로 암 수술은 엽을 제거하는 것인데, 이를 폐엽 절제술 이라고 한다. 쐐기 절제술이나 분절 절제술은 일반적으로 종양 및 그 주위의 건강한 폐 조직의 작은 영역인 엽보다 작은 폐 영역을 제거하는 것을 지칭한다. 이것은 초기 암에 사용되는 치료법이며 때로는 암은 의심되지만 증명되지 않은 폐의 부분을 제거하는 치료법이다. 폐엽 절제술에서 수술 의사는 폐엽을 제거한다. 이것은 모든 암 조직을 제거하고 암이 다시 돌아올 가능성을 줄이는 가장 좋은 기회이기 때문에 폐암에 대해 수행되는 일반적인 수술이다. 폐 절제술은 폐 전체를 제거하는 것이다. 이 옵션은 종양이 특히 크거나 도달하기 힘든 또는 폐의 중앙 위치에 있는 경우 고려된다. 폐 절제술로 인해 기능이 크게 상실될 수 있지만, 많은 사람들이 하나의 폐만으로도 잘 살고 있다.
"화학 요법"은 암에 대한 약물 치료이다. 이는 일반적으로 전신을 통해 순환하며 영향을 미친다. 약물은 혈류에 들어가 비정상 세포를 죽이거나 분열을 막는다. 그들은 종종 정맥 주사 (IV)주입으로, 카테터를 통해 정맥으로, 또는 경구로 제공된다. 암의 유형, 병기 및 위치에 따라 화학 요법의 특정 의약, 강도 및 빈도가 결정된다. 이는 수술이나 방사선과 병용될 수 있다. 화학 요법은 수술 전에 (가끔 방사선 요법과 함께) 종양을 줄이기 위한 시도로 (선행 화학 요법), 수술 후에 (가끔 방사선 요법과 함께) 수술 후 남겨질 수 있는 임의의 암세포를 죽이기 위한 시도로(보조 요법) 또는 더욱 진행된 암 또는 수술을 할만큼 충분히 건강하지 못한 사람들을 위한 주 치료로 (가끔 방사선 요법과 함께) 적용될 수 있다. 이는 대개 치료기 (일반적으로 1 내지 3 일)와 신체가 회복되도록 하는 휴식기가 이어지는 사이클로 제공된다. 그러나 일부 화학 요법 치료제는 매일 제공된다. 사이클은 일반적으로 약 3 내지 4 주 정도 지속된다. 화학 요법 치료제의 예시로는 시스플라틴, 카보플라틴, 파클리탁셀 (Taxol®), 알부민-결합 파클리탁셀 (납-파클리탁셀, Abraxane®), 도세탁셀 (Taxotere®), 겜시타빈 (Gemzar®), 비노렐빈 (Navelbine®), 이리노테칸 (Camptosar®), 에토포시드 (VP-16®), 빈블라스틴 또는 페메트렉스 (Alimta®)를 포함한다. 대개, NSCLC 치료는 두 가지 화학 요법제를 조합하여 사용한다. 연구는 세 번째 약물을 추가하는 것이 큰 이득을 추가하지 않으며 부작용을 더 일으키는 원인이 되기 쉽다는 것을 보여주었다. 단일 약물 화학 요법은 가끔 병용 화학 요법을 잘 견디지 못하는 사람들, 예컨대 전반적인 건강 상태가 좋지 않거나 노인을 위해 사용된다. 조합을 사용하는 경우, 종종 시스플라틴 또는 카보플라틴에 다른 하나의 약물을 포함한다. 가끔 이 약들을 포함하지 않는 조합, 예컨대 비노렐빈과 겜시타민 또는 파클리탁셀이 사용될 수 있다. 특정 기준을 충족시키는 진행성 폐암을 가진 개체는 표적 치료 약물, 예컨대 베바시주맙 (Avastin®) 또는 세툭시맙 (Erbitux®)을 또한 치료에 추가할 수 있다.
방사선 요법은 종종 화학 요법과 함께 제공되며 수술이 적합하지 않은 NSCLC 환자의 치료 목적에 함께 사용될 수 있다. 고강도 방사선 요법의 이 형식을 라디칼 방사선 요법이라고 한다. 이 기술의 개선은 단시간 내에 높은 선량의 방사선 요법이 주어지는 연속 과분산화 가속 방사선 요법 (CHART)이다. 수술 후 흉부 방사선 요법은 일반적으로 NSCLC의 치료 목적의 수술 후 사용해서는 안된다. 암의 성장이 기관지의 짧은 부분을 막는 경우, 통로를 열기 위해 근접 방사선 요법 (국소 방사선 요법)를 기도 내부에 직접 제공할 수 있다. 외부 방사선 요법와 비교하여 근접 방사선 요법은 치료 시간을 줄이고 의료진에게 방사선 노출을 감소시킨다. 하지만 근접 방사선 요법에 대한 근거는 외부 방사선 요법의 것보다 적다.
재발을 발견하기 위해 샘플을 개체에게서 얻는다. 샘플은 본 발명에 따른 마커(들)를 측정하기에 적합한 임의의 샘플일 수 있으며, 시험관 내에서의 평가를 위해 얻어진 생물학적 샘플을 의미한다. 이 물질은 개체와 구체적으로 관련될 수 있고 개체에 관한 특정 정보를 결정, 계산 또는 유추할 수 있는 물질로 구성된다. 샘플은 환자로부터의 생물학적 물질의 전체 또는 일부 (예를 들어, 폐 생검으로부터 얻어진 고체 조직 샘플)로 구성될 수 있다. 샘플은 또한 개체 (예를 들어, 기관지 세척액)에 대한 정보를 제공하는 샘플에서 검사가 수행될 수 있도록 환자에게 접촉 한 물질일 수 있다. 샘플은 임의의 체액을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 검사 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액 및 폐로부터의, 예를 들어 기관지 내시경이나 기관지 세척술로 얻은 유체 (예컨대, 상피 표면 액체)를 포함한다. 샘플은 개체로부터 취하여 측정 단계 a) 전에 즉시 사용되거나 처리될 수 있다. 처리는 정제 (예를 들어, 분리, 예컨대 원심 분리), 농축, 희석, 세포 성분의 용해, 동결, 산성화, 보존 등을 포함할 수있다. 바람직한 샘플은 가장 편리한 샘플 유형을 나타내는 혈장, 혈청 또는 전혈과 함께 폐로부터의 전혈, 혈청, 혈장 또는 상피 표면 액체이다.
전형적으로, 혈액 관련 샘플은 본 발명의 맥락에서 사용하기에 바람직한 검사 샘플이다. 이를 위해, 혈액은 보통 팔꿈치 안쪽이나 손등으로부터의 정맥으로부터 채취할 수 있다. 특히 영유아의 경우, 란셋이라는 날카로운 도구를 사용하여 피부를 뚫고 피를 흘리게 할 수 있다. 혈액은 예를 들어, 피펫에 넣거나 슬라이드 또는 검사 스트립에 넣어 수집될 수있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 개체로부터 얻어진 샘플은 혈액 샘플, 특히 혈청, 혈장 및 전혈로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 혈액 샘플이다.
샘플에서, 마커 분자(들)의 양 또는 농도가 측정된다. 마커 분자 (특히 HE4 및/또는 Cyfra21-1)를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것을 사용할 수 있다.
바람직하게는, 마커(들)는 특이적 결합제의 사용에 의해 액체 샘플로부터 특이적으로 측정된다.
특이적 결합제는, 예를 들어 마커에 대한 수용체 또는 마커에 대한 항체 또는 마커 단백질에 관련된 핵산에 상보적인 핵산 (예를 들어, 마커의 mRNA 또는 이의 관련 부분에 상보적인 핵산)이다. 바람직하게는, 마커 분자(들)는 단백질 수준에서 측정된다.
마커 폴리펩타이드의 결합 파트너로서의 단백질의 결정은 효모 2-하이브리드 스크리닝 시스템, 예컨대 미국 특허 제 5,283,173 호, 제 5,468,614 호 또는 이와 동등한 것에 기술된 바와 같이 단백질 또는 폴리펩타이드와 특이적으로 상호 작용하는 단백질을 동정하고 얻기 위한 다수의 공지된 방법 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 특이적 결합제는 바람직하게는 상응하는 표적 분자에 대해 적어도 107 l/mol의 친화도를 갖는다. 특이적 결합제는 바람직하게는 그의 표적 분자에 대해 108 l/mol 또는 더욱 바람직하게는 109 l/mol의 친화도를 갖는다. 당업자는 샘플에 존재하는 다른 생체 분자가 마커에 특이적인 결합제에 현저히 결합하지 않음을 나타내기 위해 특이적이라는 용어를 사용한다. 바람직하게는, 표적 분자 이외의 생체 분자에 대한 결합 수준은 각각 표적 분자에 대한 친화도의 단지 10 % 이하, 더욱 바람직하게는 단지 5 % 이하인 결합 친화도가 된다. 바람직한 특이적 결합제는 친화도 및 특이도에 대한 상기 최소 기준 모두를 충족시킬 것이다.
특이적 결합제는 바람직하게는 마커, 특히 HE4 또는 Cyfra21-1과 반응하는 항체이다. 항체라는 용어는 다클론 항체, 단일 클론 항체, 그러한 항체의 항원 결합 단편, 단쇄 항체 및 항체의 결합 도메인을 포함하는 유전체 구조를 말한다.
용어 "항체"는 다클론 항체, 단일 클론 항체, 이의 단편, 예컨대 F(ab')2 및 Fab 단편뿐만 아니라 HE4 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분자인 임의의 자연 발생 또는 재조합으로 생성된 결합 파트너를 포함한다. 특이적 결합제의 상기 기준을 유지하는 임의의 항체 단편이 사용될 수 있다. 항체는 최첨단 절차에 의해, 예를 들어 Tijssen(Tijssen, P., 효소 면역 측정법의 실습 및 이론, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1990), 전체 책, 특히 43-78 페이지)에 기술된 바와 같이 생성된다. 또한, 당업자는 항체의 특이적 분리에 사용될 수 있는 면역 흡착제에 기반한 방법을 잘 알고 있다. 이러한 수단에 의해 다클론 항체의 품질 및 그에 따른 면역 분석법의 성능이 향상될 수 있다 (Tijssen, P., supra, 108-115 페이지).
본 발명에서 개시된 성과의 경우, 예를 들어, 염소에서 생성된 다클론 항체가 사용될 수 있다. 그러나, 명백하게는 다른 종, 예를 들어, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그로부터의 다클론 항체뿐만 아니라 단일 클론 항체도 사용될 수 있다. 단일 클론 항체는 일정한 성질을 충족하는 양으로 생산될 수 있기 때문에, 임상 실험을 위한 분석법 개발에 이상적인 도구이다.
측정을 위해, 개체로부터 얻은 샘플을 결합제 마커-복합체의 형성에 적합한 조건 하에서 문제의 마커에 대한 특이적 결합제와 함께 인큐베이션한다. 숙련된 당업자는 어떠한 큰 노력이 없이도 그러한 적절한 인큐베이션 조건을 용이하게 식별할 수 있기 때문에 그러한 조건은 명시될 필요가 없다. 결합제 마커-복합체의 양은 측정되고 본 발명의 방법 및 용도로 사용된다. 숙련된 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 관련 교과서 (참고로, 예를 들어, Tijssen P., 상기 문헌, 또는 Diamandis, E.P. 및 Christopoulos, T.K. (eds.), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))에서 상세하게 기술된 특정 결합제 마커-복합체의 양을 측정하는 다수의 방법이 있다.
특히, 마커(들) (HE4 및 임의의 Cyfra21-1)에 대한 단일 클론 항체는 정량적 (마커(들)의 양 또는 농도가 결정됨) 면역 측정법에 사용된다.
바람직하게는, 마커는 샌드위치 유형 분석법 포맷으로 발견된다. 이러한 분석법에서, 첫 번째 특이적 결합제가 한 쪽 면에서 해당 마커를 포획하는데 사용되고, 직접 또는 간접적으로 발견 가능하도록 표지된 두 번째 특이적 결합제 (예를 들어, 두 번째 항체)가 다른 면에서 사용된다. 두 번째 특이적 결합제는 발견 가능한 리포터 잔기 또는 표지, 예컨대 효소, 염료, 방사성 핵종, 발광성 그룹, 형광성 그룹 또는 비오틴 등을 함유할 수 있다. 임의의 리포터 잔기 또는 표지는 그러한 신호가 세척 후에 지지체 상에 남아있는 결합제의 양에 직접적으로 관련되거나 비례하는 한, 본 명세서에 개시된 방법으로 사용될 수 있다. 이어서, 고체 지지체에 결합된 두 번째 결합제의 양은 특정 발견 가능한 리포터 잔기 또는 표지에 적합한 방법을 사용하여 결정된다. 방사성 그룹의 경우, 일반적으로 섬광 계수 또는 자동 방사선 방법이 적합하다. 항체-효소 접합체는 다양한 커플링 기술 (예를 들어, Scouten, W.H., Methods in Enzymology 135 : 30-65, 1987 참조)을 사용하여 제조될 수 있다. 분광학 방법은 염료 (예를 들어, 효소 반응의 표색 산물을 포함함), 발광 그룹 및 형광 그룹을 발견하는 데 사용할 수 있다. 비오틴은 상이한 리포터 그룹 (일반적으로 방사성 또는 형광성 그룹 또는 효소)에 커플링된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 사용하여 발견할 수 있다. 효소 리포터 그룹은 일반적으로 기질의 첨가 (일반적으로 특정 기간 동안), 이어서 반응 생성물의 분광, 분광 광도 또는 다른 분석에 의해 발견될 수 있다. 표준 및 표준 추가는 잘 알려진 기술을 사용하여, 샘플의 항원 수준을 결정하는 데 사용할 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, HE4를 측정하는 다양한 방법이 있다. HE4를 측정하기위한 시판용 제품은 HE4 효소 면역 측정법 (EIA) (Fujirebio Diagnostics Inc., Goteborg, Sweden) 및 ARCHITECT HE4 분석법 (Abbott, Wiesbaden, Germany)을 포함한다. 바람직하게는, HE4는 HE4의 정량적 측정을 위한 전기 화학 발광 면역 측정법 (ECLIA)인 "Cobas Elecsys® HE4" (물질 번호: 05950929 190, Roche Diagnostics, Ltd, Rotkreuz, Switzerland)를 사용하여 측정한다.
또한 Cyfra21-1 수준의 측정을 위해, 다양한 분석이 존재한다. "CYFRA21-1"에 대한 분석법은 순환계에 존재하는 시토케라틴 19의 가용성 단편을 특이적으로 측정한다. CYFRA21-1의 측정은 전형적으로 두 개의 단일 클론 항체를 기반으로 한다 (Bodenmueller et al., 1994, Int. J. Biol. Markers 9:75-81). Cyfra21-1을 측정하기 위한 시판용 제품에는 Enzymum-Test CYFRA 21-1 (Boehringer Mannheim, 독일 Mannheim), 시토케라틴 19 단편 (CYFRA 21-1) 면역 방사선 측정 분석 키트 (Cisbo Assays, Codolet, 프랑스), Cytokeratin Fragment Antigen 21-1의 ELISA Kit (Wuhan USCN Business Co., Ltd., 중국) 및 ARCHITECT Cyfra21-1 분석 (Abbott, Wiesbaden, 독일)을 포함한다. 독일 Roche Diagnostics의 CYFRA21-1 분석법에서 두 개의 특이적인 단일 클론 항체 (KS 19.1 및 BM 19.21)가 사용되었으며 분자량이 약 30,000 Dalton인 시토케라틴 19의 가용성 단편이 측정되었다. 바람직하게는, CYFRA21-1은 제조자의 지시에 따라 Roche 제품 번호 11820966160을 사용하여 Elecsys® 분석기 상에서 측정한다.
본 발명에 따르면, 마커의 양 또는 농도가 재발을 발견하기 위해 결정된다. 물질의 양은 기본 개체, 예컨대 원자, 분자, 전자 및 기타 입자의 총체적 크기를 측정하는 표준 정의량이다. 때로는 화학량이라고도 지칭한다. 국제 단위계 (SI)는 존재하는 기본 개체의 수에 비례하는 물질의 양을 정의한다. 물질 양에 대한 SI 단위는 몰이다. 단위 기호 mol이 있다. 물질의 농도는 성분의 양을 혼합물의 총 부피로 나눈 것이다. 수학적 기술의 몇 가지 유형이 구분될 수 있다: 질량 농도, 몰 농도, 수 농도 및 체적 농도. 농도라는 용어는 임의의 종류의 화학 혼합물에도 적용될 수 있지만, 가장 자주 사용되는 것은 용액의 용질 및 용매를 지칭한다. 몰 (양) 농도는 변이형, 예컨대 정상 농도 및 삼투압 농도를 갖는다.
마커의 수준을 측정하는 단계는 하기와 같이 수행될 수 있다: 결합제의 마커로의 결합을 허용하는 조건 하에서, 샘플 및 임의의 캘리브레이터 및/또는 대조군은 (예를 들어, 고체 상으로 고정될 수 있는) 결합제와 접촉할 수 있다. 결합되지 않은 결합제는 분리 단계 (예를 들어, 하나 이상의 세척 단계)에 의해 제거될 수 있다. 결합된 결합제를 발견하여 결합제의 결합 및 정량화를 허용하기 위해 두 번째 작용제 (예를 들어, 표지된 작용제)를 첨가할 수 있다. 결합하지 않은 두 번째 작용제는 제거될 수 있다. 마커의 양에 비례하는 두 번째 결합제의 양은 예를 들어, 표지를 기반으로 정량화될 수 있다. 정량화는 예를 들어, 측정 값 대 각 캘리브레이터의 농도를 플로팅하여, 예를 들어 각 분석에 대해 구성된 캘리브레이션 곡선을 기반으로 수행할 수 있다. 샘플에서 마커 농도 또는 양은 칼리브레이션 곡선으로부터 읽을 수 있다.
마커의 양 또는 농도가 결정된 후, 얻어진 값을 대조군 (예를 들어, 대조군 샘플 또는 대조군 코호트 또는 대조군 모집단 또는 대조군 그룹)에서 확립된 바와 같은 각각의 마커의 양 또는 농도와 비교한다. "양 또는 농도를 대조군 샘플의 확립된 양 또는 농도와 비교하는"이라는 표현은 단지 숙련된 당업자에게 명백한 것을 추가로 설명하기 위해 사용된 것이다. 대조군 샘플은 내부 또는 외부 대조군일 수 있다. 한 구현예에서, 내부 대조군이 사용되는데, 즉, 동일한 피험체로부터 채취된 하나 이상의 다른 샘플(들)뿐만 아니라 검사 샘플에서 마커 수준(들)이 평가되어 상기 마커(들)의 수준(들)에 어떤 변화가 있는지를 결정한다. 다른 구현예에서는 외부 대조군이 사용된다. 외부 대조군의 경우, 개체로부터 유래된 샘플의 마커의 존재 또는 양을 주어진 조건 (예를 들어, 폐암 또는 폐암의 재발)이 없는 것으로 밝혀진 개체 또는 개체의 모집단, 즉, "정상적인 개체"의 양 또는 농도와 비교한다. 일반적으로 샘플의 마커 수준은 직접적으로 또는 간접적으로 진단과 연관되고, 마커 수준은 예를 들어, 개체가 재발했는지 또는 재발할지를 결정하는 데 사용된다. 적절한 대조군 샘플/모집단/코호트/그룹 및 이에 확립된 마커에 대한 대조군 또는 기준값을 선택하는 것은 종사자의 기술 내에 있다. 당업자는 하나의 구현예에서의 이러한 대조군이 연령이 일치하고 교란성 질환이 없는 기준 모집단으로부터 얻어진 점을 이해할 것이다. 또한 당업자에게 명백한 바와 같이, 대조군에서 확립된 절대 마커값은 사용된 분석법에 따라 다를 것이다. 적절한 기준 모집단으로부터 100 명 이상의 잘 특성화된 개체로부터의 샘플을 대조(기준)값을 확립하는데 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는 기준 모집단은 적어도 20, 30, 50, 200, 500 또는 1000 개체로 이루어지도록 선택될 수 있다. 건강한 개체는 기준을 확립하기 위한 바람직한 기준 모집단을 나타낸다. 대안적으로, 기준 모집단이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 건강한 개체의 하나의 모집단 및 재발했다고 알려진 개체의 하나의 모집단).
본 발명에 따라, 대조군에 비해 증가된 마커(들)의 양 또는 농도의 값은 재발의 지표이다. 값이 증가하면 재발이 발생했거나 곧 발생한다. 이에 의해 식별된 개체는 추가의 혈액 검사, 영상 요법, 화학 요법 또는 수술을 포함하는 추가의 진단 또는 치료 방법의 대상이 될 수 있다. 숙련된 종사자는 현행 국가의 의학적 관행에 따라 적절한 수단을 선택할 수 있다.
하나의 구현예에서, 값이 대조군 또는 기준값에 대해 적어도 110 %, 더욱 바람직하게는 적어도 120 %, 더욱 바람직하게는 적어도 130 %, 더욱 바람직하게는 적어도 140 %, 더욱 바람직하게는 적어도 150 %, 더욱 바람직하게는 적어도 160 %, 더욱 바람직하게는 적어도 170 %, 더욱 바람직하게는 적어도 180 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 190 % 까지 도달하면 값이 증가한다.
대안적으로, 대조군 그룹 또는 대조군 모집단에서 측정된 HE4 및 임의의 Cyfra21-1에 대한 값은 예를 들어 컷-오프 값 또는 기준 범위를 확립하는데 사용된다. 이러한 컷-오프 값 초과 또는 기준 범위 밖의 값과 그 상위 끝은 증가한 것으로 간주된다. 하나의 구현예에서, 고정된 컷-오프 값이 확립된다. 이러한 컷-오프 값은 관심있는 진단적 질문과 일치하도록 선택된다. 하나의 구현예에서, 대조군 그룹 또는 대조군 모집단에서 측정된 HE4 및 임의의 Cyfra21-1에 대한 값은 기준 범위를 확립하는데 사용된다. 바람직한 구현예에서, HE4 및 임의의 Cyfra21-1 농도는 측정된 값이 기준 범위의 90 %-백분위수 초과인 경우 증가된 것으로 간주된다. 추가의 바람직한 구현예에서, HE4 및 임의의 Cyfra21-1의 값은 측정된 값이 기준 범위의 95 %-백분위 수, 96 %-백분위 수, 97 %-백분위 수 또는 97.5 %-백분위수 초과인 경우 증가된 것으로 간주된다. 현재의 경우, 컷-오프 값은 재발한 개체를 재발하지 않은 개체와 구별하기 위한 적절한 값을 나타낸다.
적절한 컷-오프 값은 원하는 민감도 및 특이도에 따라 선택될 수 있다. 민감도 및 특이도는 통계에서 분류 기능으로 알려진 2 진 분류 검사의 성능에 대한 통계적 측정이다.
민감도 (진양성율이라고도 함)는 정확하게 식별된 양성 반응의 비율 (예를 들어, 상태를 갖고 있는 것으로 정확하게 식별된 재발한 사람의 백분율)을 측정한다.
특이도 (진부정율이라고도 함)는 정확하게 식별된 부정 반응의 비율 (예를 들어, 상태를 갖고 있지 않은 것으로 정확하게 식별된 재발한 사람의 백분율)을 측정한다.
어떤 검사의 경우에도, 대개 측정 간에 트레이드-오프가 있다. 예를 들어, 안전에 대한 잠재적 위협을 검사하는 공항 보안 환경에서, 스캐너는 항공기 및 탑승자에게 위협이 되는 물건 누락의 위험성을 줄이기 위해서 (높은 민감도), 벨트의 버클 및 열쇠와 같이 저위험 물품에도 작동되도록 설정될 수 있다 (낮은 특이도). 이 트레이드-오프는 수신기 작동 특성 곡선 (하기 참조)으로서 그래프로 표현될 수 있다. 완벽한 예측 인자는 100 % 민감하고 (예를 들어, 모든 병자가 아픈 것으로 식별됨), 100 % 특이적으로 (예를 들어, 모든 건강한 사람들이 아픈 것으로 식별되지 않음) 기술된다; 그러나 이론적으로 임의의 예측 인자는 Bayes 오류율로 알려진 최소 오류 경계를 갖는다. 민감도 또는 특이도를 증가시키기 위해 컷-오프를 설정할 수 있다.
통계에서, 수신자 작동 특성 (ROC) 또는 ROC 곡선은 구별 임계값이 다양할 때 2 진 분류 시스템의 성능을 보여주는 그래프 플롯이다. 곡선은 여러 임계값 설정에서 위양성률 (FPR)에 대한 진양성률 (TPR)을 플로팅하여 작성된다. 상기 기술한 것처럼, 진양성률은 신호 탐지 및 생의학 정보학에서 "d-prime"으로 알려진 민감도 또는 민감도 색인 d' 또는 기계 학습에서의 재현율(recall)로도 알려져 있다. 위양성 비율은 또한 폴-아웃으로 알려져 있으며 (1 - 특이도)로 계산할 수 있다. ROC 곡선은 이분법 결과를 예측하는 능력값의 범위에 걸쳐 민감도 대 특이도를 비교한다. 곡선 아래 영역 (AUC)는 검사 성능을 비교하기 위한 전반적인 정확도를 나타낸다 (Florkowski CM, 2008, Clin Biochem Rev 29 (Suppl 1): S83-S87). 민감도는 개체를 질병에 걸린 것으로 정확하게 분류하는 검사의 능력이다. 개체를 질병이 없는 것으로 정확히 분류하는 검사의 능력을 특이도라고 한다. 공식은 실시예 1 에 보여진다 (Fawcett T, 2006, Pattern Recognition Letters 27: 861-874).
ROC 분석은 가능한 최적의 모델을 선택하고 (그리고 특정하기 전에) 비용 맥락 또는 분류 분포로부터 독립적으로 차선책을 버리는 도구를 제공한다. ROC 분석은 진단적 의사 결정의 비용/이익 분석에 직접적이고 자연스러운 방식으로 관련되어 있다.
2 개의 마커, 즉 HE4 및 Cyfra21-1이 본 발명의 방법에 사용되는 경우, 조합된 값은 Cy4ra21-1의 양/농도뿐만 아니라 HE4의 양/농도를 사용하여 계산될 수 있다. 조합된 값은 동일한 수학적 절차를 사용하여 얻어진 대조군 샘플의 조합된 값과 비교된다. 바람직한 구현예에서, 결합된 값은 샘플의 마커 분자의 양 또는 농도의 가중 계산에 의해 얻어진다. 이것은 마커 중 하나가 다른 마커보다 높은 가중 인자를 부여받음을 의미한다. HE4의 수준 (양 또는 농도) ([HE4]) 및 Cyfra21.1의 수준 (양 또는 농도) ([Cyfra21.1])를 기반으로 계산된 조합된 값 C는, 예를 들면 하기 식에 의해 얻어질 수 있다. : C = a*[HE4] + b*[Cyfra21.1], 식 중 a 및 b 는 가중 인자를 나타낸다. 바람직하게는, 가중 인자는 기준 모집단을 분석함으로써 얻어진다.
예를 들어, 종속 변수로서 2 진 결과 재발 및 비재발 및 독립 변수로서 Cyfra21-1 및 HE4 의 조합의 로지스틱 회귀 분석을 수행할 수 있다. 분류 정확도는 ROC (Receiver-Operating Characteristic) 곡선 아래 영역(AUC)에 의해 평가할 수 있으며 민감도와 특이도를 계산할 수 있다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 폐 선암의 재발의 시험관 내 평가에서 마커 분자로서의 HE4의 용도에 관한 것으로, 여기에서 개체로부터 얻어진 샘플에서 대조군에 비해 증가된 HE4의 양 또는 농도의 발견은 재발의 지표이다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 폐 선암의 재발의 시험관 내 평가에서 마커 조합으로서 HE4 및 CYFRA 21-1의 용도에 관한 것으로, 여기에서 개체로부터 얻어진 샘플에서 대조군의 것에 비해 마커 조합의 증가된 조합 값의 발견은 재발의 지표이다.
세 번째 및 네 번째 측면에 따른 용도는 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 방법에 대해 특정된 바와 같이 추가로 정의될 수 있다. 특히, 본 개시의 세 번째 및 네 번째 측면에서 사용되는 용어들에 관하여, 이는 본 개시의 첫 번째 및 두 번째 측면에서 사용된 용어, 실시예 및 특정 구현예를 지칭하며, 이는 본 개시의 세 번째 및 네 번째 측면에도 적용가능하다.
일반적으로, 본 명세서는 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜 및 시약에 한정되지 않는데, 그것들이 다양할 수 있기 때문이다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 것이며, 본 개시의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 본 명세서 및 첨부된 청구 범위에 사용된 단수 형태 "한", "하나의" 및 "그"는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 유사하게, "포함하다", "함유하다"및 "망라하다"라는 단어는 배타적이지 않고 포괄적으로 해석되어야한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어 및 모든 약어는 본 개시 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에서 기술된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 명세서에서 제시된 바와 같이 실시될 수 있지만, 구체적인 방법 및 물질은 본 명세서에 기술되어 있다.
본 개시는 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명되며, 비록 도면과 실시예가 단지 설명의 목적으로 포함되지만, 달리 구체적으로 지시되지 않는 한 본 개시의 범위를 제한하려는 의도는 아니라는 것이 이해될 것이다.
도 1은 아데노 NSCLC 환자의 재발 발견을 설명한다(재발: 42 건, 비재발: 639 건). 본 명세서의 Cyfra21-1, HE4에 대한 실시예 및 이 마커의 조합에서 기술된 실험에서 얻어진 ROC (Receiver Operating Characteristic) 곡선 데이터의 곡선 아래 면적 (AUC) 분석의 요약을 나타낸다.
실시예
실시예 1 : 기준 모집단에서 대조군 값 및 임의의 가중 인자 확립
실시예 1은 적절한 기준 코호트에서 대조군 값과 임의의 가중 인자를 얻을 수 있는 방법을 기술한다.
모범적이고 적합한 기준 코호트는 바람직하게는 절제술 후 조기 선암 NSCLC 환자를 포함하지만 건강한 피험자도 포함할 수 있다. 건강한 피험자는 재발없는 환자로 다루어진다.
최적으로 NSCLC 환자의 일부에게 재발이 관찰되었고, HE4 및 임의의 Cyfra21-1의 농도 수준은 이들의 재발 발견 시점에 알려졌다.
A) 유일한 마커로서의 HE4 : 컷-오프 값 결정
마커 HE4의 수준은 기준 코호트에서 취한 샘플에서 결정될 것이다. HE4의 수준은 재발이 있는 환자 그룹 및 임의의 재발하지 않은 환자에 대해 결정될 것이다. 새로운 환자의 평가를 위해 나중에 사용될 수 있는 적절한 컷-오프 값은 숙련된 당업자에게 공지된 바와 같이 결정될 수 있다. 컷-오프는 검사의 적절한 민감도 및 특이도를 고려하여 선택될 수 있다.
B) 마커 조합으로서의 HE4 및 Cyfra21-1 : 가중 인자의 결정
마커 HE4 및 Cyfra21-1의 수준은 기준 코호트로부터 취한 샘플에서 결정될 것이다. 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 가중 인자를 얻을 수 있다. 종속 변수는 샘플 채취 시점에서 재발 여부를 나타내는 2 진 지표이다. 상응하는 시점에 취한 샘플에서 측정한 Cyfra21-1 및 HE4의 수준은 독립 변수가 된다.
그 다음 회귀 계수를 가중 인자로 사용하여 기준 코호트의 각 환자의 조합된 값 C를 계산할 수 있다.
이 조합된 값 C를 기반으로, 나중에 새로운 환자의 평가를 위해 사용될 수 있는 기준값을 설정할 수 있다. 기준값이 가져야 하는 바람직한 비율에 따라, 재발이 발견된 환자 또는 재발하지 않은 환자에게서 기준값을 설정할 것이다.
새로운 환자에서 재발을 발견하기 위해 높은 확실성을 원한다면 재발이 발견 된 환자의 대다수의 조합된 값 C가 이 기준값을 초과하는 방식으로 기준값 (예를 들어, 환자의 90 %)을 선택할 것이다.
그러나 조합된 값이 기준값을 초과하는 새로운 환자가 실제로 재발하고 위양성이 아니라는 높은 확실성을 원한다면 재발이 없는 환자의 대다수(예를 들어, 90 %)가 기준값으로서 더 작은 조합된 값 C를 갖는 방식으로 기준값을 선택할 것이다.
실시예 2 : NSCLC 환자의 코호트에서 바이오 마커 다변수 분석
이 분석은 Cyfra21-1 및 HE4의 혈청 바이오 마커 수준을 기준으로 재발 환자를 식별하기 위한 것이었다.
분석 모집단에는 모두가 종양 절제술을 받은 130 명의 조기 선암종 NSCLC 환자가 포함되었다. 환자를 주기적으로 관찰하였고, 각 방문 시마다 재발이 발생한 경우 기록하였고 혈액 샘플을 채취하고 Cyfra 및 HE4 의 농도를 측정하였다. 총 681 회의 방문을 기록하였다. 681 건의 방문 중 42 건에서 재발이 발견되었다.
종속 변수로서 각 방문에서 2 진 결과 재발 및 비재발 및 독립 변수로서 상응하는 방문에서 Cyfra21-1 및 HE4 수준의 조합의 로지스틱 회귀 분석을 실시예 1에 기술된 바와 같이 확립하였다.
로지스틱 회귀 모델로부터 유도된 계수에 기반하여, 각각의 환자에 대해 조합된 값 C를 계산하였다. 이 실시예에서 C 의 공식은 하기와 같았다:
C= -10.472 + ln(Cyfra21-1) * 1.424 + ln(HE4) * 1.525
식 중, ln ()은 자연 대수이다.
이어서, 이 조합된 값 C가 재발이 있거나 없는 방문을 얼마나 잘 구별 할 수 있는지를 평가하였다. 분류 정확도는 ROC (Receiver-Operating Characteristic) 곡선 아래 면적 (AUC)에 의해 평가하였으며 민감도와 특이도가 보고되었다.
ROC (Receiver-Operating Characteristic) 곡선은 구별 임계값이 다양할 때 2 진 분류 시스템의 성능을 보여주는 그래프 방식이다. 이는 이분법 결과를 예측하는 능력값의 범위에 걸쳐 민감도 대 특이도를 비교한다. AUC는 검사 성능 비교를 위한 전반적인 정확도를 나타낸다 (Christopher M F 2008 Clin Biochem Rev). 민감도는 개체를 질병에 걸린 것으로 정확하게 분류하는 검사의 능력이다. 개체를 질병이 없는 것으로 정확하게 분류하는 검사의 능력을 특이도라고 한다. 공식은 하기에서 보여진다 (Fawcett Tom 2006 Pattern Recognition Letters).
민감도 = TP/(TP+FN)
특이도 = TN/(TN+FP)
Cyfra21-1 :
AUC : 77.9 %
민감도 (@ 90.0 % 특이도) : 45.2 %
특이도 (@ 88.1 % 민감도) : 33.3 %
HE4 :
AUC : 79.6 %
민감도 (@ 90.0 % 특이도) : 52.4 %, 컷오프 : 113.1 pmol/mL
특이도 (@ 88.1 % 민감도) : 28.3 %, 컷오프 : 58.8 pmol/mL
Cyfra + HE4 :
AUC : 83.6 %
민감도 (@ 90.1 % 특이도) : 57.1 %, C 스케일의 컷오프 값 : -2.279
특이도 (@ 88.1 % 민감도) : 64.2 %, C 스케일의 컷오프 값 : -3.203
실시예 3 : 새로운 환자 모니터링
만약 절제 후 새로운 환자를 모니터링하기 위해 HE4와 임의의 Cyfra21-1을 사용하고자 한다면 적절한 시점에서 주기적으로 혈액 샘플을 수집하고 각 샘플에서 HE4와 임의의 Cyfra21-1의 농도를 측정할 것이다. 각각의 샘플/방문에 대하여, 실시예 1에서 기술된 바와 같이 확립될 수 있는 가중 인자를 사용하여 조합된 값 C를 계산하거나, 실시예 2로부터 이들을 사용할 수 있다. 새롭게 취한 혈액 샘플에서 이 조합된 값 C가 기준값보다 높으면 이 환자는 재발이 있는 것으로 가정할 것이다. 기준값은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 확립될 수 있거나 실시예 2로부터 취해질 수 있다.
Claims (13)
- 하기를 포함하는, 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법:
a) 개체로부터 얻은 샘플에서 마커 분자 HE4 및 CYFRA 21-1의 양 또는 농도를 측정하는 단계, 및
b) 단계 (a)에서 결정된 마커에 대한 조합된 값을 대조군에서 확립된 조합된 값과 비교하여 재발을 발견하는 단계로서, 대조군에 비해 증가된 조합된 값은 재발의 지표임. - 제 1 항에 있어서, 조합된 값은 샘플에서의 마커 분자의 양 또는 농도의 가중 계산에 의해 얻어지는, 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 가중 인자는 기준 모집단을 분석함으로써 얻어지는, 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈액 샘플인, 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 혈액 샘플은 혈청, 혈장 및 전혈로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 분자(들)가 단백질 수준에서 측정되는, 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 사람인, 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 폐 선암에 대하여 성공적으로 치료된 것으로 간주되는, 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 개체가 절제 및/또는 화학 요법에 의해 성공적으로 치료된 것으로 간주되는, 개체에서 폐 선암의 재발을 발견하는 방법.
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