WO2006137550A2

WO2006137550A2 - 癌診断方法及び肺癌診断方法

Info

Publication number: WO2006137550A2
Application number: PCT/JP2006/312671
Authority: WO
Inventors: Goshi Shiota; Norimasa Miura
Original assignee: Univ Tottori; Goshi Shiota; Norimasa Miura
Priority date: 2005-06-20
Filing date: 2006-06-19
Publication date: 2006-12-28
Also published as: JPWO2006137550A1

Description

明細書癌診断方法及び肺癌診断方法技術分野

本発明は、癌.診断方法及び肺癌診断方法に関し、特に、早期に肺癌か否かの診断ができ、また、抗癌剤が患者に有効か否かの判断をできる、高感受性且つ特異性のある癌診断方法及びそのような癌診断方法を用いた肺癌診断方法に関する。背景技術

肺癌は、過去 20年間において、生存率において少しの変化があったものの、依然として、悪性腫瘍関連死の主要な原因となっている。

そして、非小細胞肺癌（NSCLC (non— small cell lung cancer) )は、現在、総肺癌患者の 3/4を占めており、多くの患者が、新規な治療方法や外科的腫瘍学の進歩にもかかわらず、進行性かつ転移性の病気によって死に続けている。

また、メスなどを用いなレ、、診断ツールとして、 B重瘍マーカーがある。

この腫瘍マーカ一は、一般に、癌の診断や、治療指標として用レヽられている。

腫瘍マ一カーとしては、小細胞癌の診断には、例えば、 NSE (Neuron -specific enolase, 以下、単に、「NSE」という。）や proGRP (Pro— gastorin— releasing peptide,以下、単に、 rproGRPJとレ、う。）が有効なマ一力一とされてレ、る。

非小細胞癌（NSCLC (non— small cell lung cancer)、以下、単に、「NSCLC」とレヽう。）や、癌胎児性抗原（CEA (carcinoembryonic antigen)、以下、単に、「CEAjという。；)や、扁平上皮癌（SCC (squamous cell carcinoma)、以下、単に、「SCCJという。）や、サイトケラチン 2.1— 1フラグメント（シフラ 21 - 1) (CYFRA(cytokeratin 19 fragment)、以下、単に、「CY FRA」とレ、う。)や、シァリ /レ LeX— f几原 (SLX (sialyl Le antigen such as sialyl stage 一 specific antigen— 1)、以下、単に、「SLX」とレ、う。）や、 CA19 - 9 (carbohydrate antig en 19一 9、以下、単に、「CA19— 9Jという。）は、一般に、診断に用いられており、少なくとも、 CEA、 SCC及ぴ CYFRAの群力選択される 1つのマーカー力陽性の場合、 70%の患者が、非小細胞癌 (NSCLE)の患者である、とされてレ、る。

また、組織学的カテゴリーに基づけば、 CEAと CYFRAとの双方が陽性の割合は、腺癌（aden ocarcinoma)の患者において高ぐ CYFRAと SCCとの双方が陽性の割合は、扁平上皮癌 squ amous cell carcinoma) の唐、者におレヽてレヽ、とされてレヽる。

また、 X線診断 (X— ray examinations)や、従来の腫瘍マーカーを用いた診断や、気管支洗浄（bronchial lavage (BL)のような標準的な手法は、肺癌の発見に重要であるが、これらの手法は、臨床の初期段階における肺癌の発見には十分では無レ、、という問題がある。

また、上皮成長因子受容体（EGFR (epidermal' growth factor receptor)、以下、単に、「EGFR」という。）のチロシンキナーゼ活性（Tyrosine kinase activity)は、腫瘍細胞の増殖や、細胞生存や、血管形成や、滲出や、転移に関与し、また、合成ァニリノキナゾリン (a synthet ic anilinoquinazoline)、ゲフイチニブ (Gefitinib) (商品名：「ィレッサ J (登録商標）、販売会社：ァスロラゼネ力株式会社)の EGFRチロシンキナーゼ阻害作用をうける作用点でもある。

ゲフイチニブ（Gefitinib) (商品名：「ィレッサ」（登録商標）、販売会社：ァスロラゼネ力株式会社）の EGFRチロシンキナ一ゼ阻害作用は、患者によっては、極めて有効な薬剤である力他方、副作用の問題力;ある。

EGFRは、 NSCLCの組織標本の 80%に発現する力その発現は、小細胞癌（small cell lu ng carcinoma (SCLC)の進行性タイプ（progress type)に観察される。この意味において、 E GFRは、優れた肺癌の生体用マーカー（biomaker)であり、そして、 EFFRターゲット療法（EGF R— targeted therapies)に月里¾反応 (tumor responseリする分子決定因" 、molecular de taerminants でめ" o。

RGFRTが、腫瘍マーカーのように利用できれば、医師が、患者に対し、ゲフイチ-ブ（Gefitini b)を処方するか否かの判断するのが容易となり、また、患者に対し、ゲフイチニブ（Gefitinib)を処方後においても、ゲフイチ-ブ (Gefitinib)が腫瘍に有効であるか否力の追跡調査が容易に行える。

また、本発明者等は、患者の体液中から、体細胞-癌細胞成分として、 RNAのみを含む試料を得る工程と、 RNAのみを含む試料力逆転写酵素で cDNAを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いた PCRを、 hTERT mRNAの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、 PC Rにより増幅された PCR産物を前記 PCR産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測するェ程とを備える、癌診断方法を既に提案している。

しかしながら、この癌診断方法だけを用いて、例えば、肺癌か否かの癌診断をした場合、肺癌患者であるにも力かわらず、陰性と判断したり、また、肺癌患者でないにも力、かわらず、陽性と判断したりする場合が全く無い、とは言い切れない、という問題がある。

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【非特許文献 5】 Sugio K， Sugaya M， Hanagin T， Yasumoto K. Tumor mark er in primary lung cancer. JUOEH 2004; 1 :473— 9,

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【特許文献 11】WO2005049864号発明の開示

本発明は、上記した問題や医師等の要望を解決するためになされたものであって、癌、より具体的に説明すると、肺癌の初期において、癌細胞の存在証拠を血液中力検出でき、し力も、癌か否かの癌診断をした場合、肺癌患者であるにもかかわらず、陰性と判断したり、また、肺癌患者でないにもかかわらず、陽性と判断したりする場合を著しく低減した、癌診断方法及びそのような癌診断方法を用レヽた肺癌診断方法を提供することを目的としてレ、る。

請求項 1に記載の癌診断方法は、ある患者の体液中から、体細胞'癌細胞成分として、 RNAのみを含む試料を得る工程と、 RNAのみを含む試料力逆転写酵素で cDNAを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いた PCRを、 EGFR mRNAの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、 PCRにより増幅された PCR産物を PCR産物と結合した蛍光色素を用レ、、定量的に計測する工程とを備える、第一の癌診断方法と、前記ある患者の体液中から、体細胞'癌細胞成分として、 RNAのみを含む試料を得る工程と、 RNAのみを含む試料力逆転写酵素で cDNAを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いた PCRを、 hTERT mRNAの存在を検出する、ブライマ一セットを用いて行レ、、 PCRにより増幅された PCR産物を PCR産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第二の癌診断方法とを行い、第一の癌診断方法の結果が、陽性と判定され、且つ、第二の癌診断方法の結果が、陽性と判定された場合、癌と判断する。請求項 2に記載の癌診断方法は、請求項 1に記載の癌診断方法で用いる、 EGFR mRNAの存在を検出する、プライマーセットの、上流側プライマーが、 AACTGTGAGGTGGTCCTTGG であり、下流側プライマーが、 GTTGAGGGCAATGAGGACATである。

請求項 3に記載の癌診断方法は、請求項 1又は請求項 2に記載の癌診断方法で用いる、 hTE RTmRNAの存在を検出する、プライマーセットの、上流側プライマーが、上流側プライマーが、 CGGAAGAGTGTCTGGAGCAAであり、下流側プライマ一が、 GGATGAAGCGGAGTC TGGAである。

請求項 4に記載の癌診断方法は、請求項 1〜3のいずれかに記載の癌診断方法で用いる、体液力血液またはリンパ液である。 '

請求項 5に記載の肺癌診断方法は、請求項 1〜4のいずれかに記載の癌診断方法を用いた。発明の効果

本発明に係る癌診断方法は、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中力検出できるので、早期医療行為によって癌細胞を根絶することが可能になる。

また、体液中力 mRNAを含む試料を得るようにしたので、癌組織腫瘍形成、転移後の切除組織中力 EGFRを検出するような場合に比べ、癌細胞の有無を正確に検出することができる。

また、 PCRを行う際に使用するプライマーを工夫することにより、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中力検出できるようになった。

また、本発明に係る癌診断方法では、第一の癌診断方法と第二の癌診断方法の両方が、陽性と判断された場合を、癌と判断するようにしてレ、るので、癌でない者を誤って癌と誤って判断したり、癌であるにも力わらず癌では無レ、と誤って判断することがない。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明に係る癌診断方法と、その対象とを概略的に説明する説明図である。

第 2図は、本発明に係る癌診断方法で使用するプライマーセットを説明する図である。

第 3図は、全長塩基配列を示す図である。

第 4図は、 EGFRの全長塩基配列を示す図である。

第 5図は、 EGFRの全長塩基配列を示す図である。

第 6図は、 hTERT mRNA及び EGFR mRNAの各々の組織と血清との間の相関関係を表すグラフであり、図 6 (a)は、 hTERT mRNAの組織と血清との間の相関関係を表すグラフであり、また、図 6 (b)は、 EGFR mRNAの組織と血清との間の相関関係を表すグラフである。

第 7図は、腫瘍マーカ一の臨床因子に関する多変量解析結果を示す図である。第 8図は、ロックカーブ解析 (ROC curve analyses)の結果を示すグラフである。

第 9図は、各種の腫瘍マーカ一の肺癌に対する感受性と特異性とを説明する図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明に係る癌診断方法の一例を更に詳しく説明する。

1.患者と標本の収集

図 1は、本発明に係る癌診断方法と、その対象とを概略的に説明する説明図である。

図 1に示す試験を行うために、 2003年 7月〜2004年 12月の期間、国立米子病院に許可された、 89人の肺癌患者を登録した。

患者の平均年齢は 63歳（22歳〜 90歳)であった。

これらの患者について、血清試験、胸部 X線、（ヘリカル)コンピュータ断層撮影法 (CT)、胸部又は脳の磁気共鳴映像法、細胞学的試験、経気管支、経皮、又は胸腔鏡下肺生体組織検査の後に外科的切除標本の病理的評価を診断した。

臨床病理学的所見 [性別、年齢、診断、腫瘍の大きさ、腫瘍の数、 CEA、 SCC、 CYFRA, pro GRP、 NSE (Neuron specific enolase)、 ΓΡΑ (tissue polypeptide antigeru及 Ό、 SLXといった腫瘍マ一カー検查、肝炎ウィルスの有無（presence of active hepatitis virus) , 喫煙暦 (smoke history (estimated by Pack— Year index)、転移や再発の有無 (presen ce of metastasis or recurrence)及び臨床病期 (IA〜IV) (clinical stage (IA〜IV) ) ]を評価した。また、対照群 (比較例）として、 12人の女性を含む 27人の健常人（22歳〜 78歳：平均年齢 53 歳）を用いた。

更に、同じ患者に関して、外科的処置の前と後（手術後 3週間後）の血清中の興味のある遺伝子を調べるため、また、腫瘍マ一カーとしての能力を決定するため、我々は、肺癌患者のヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT と略） mRNAと、 EGFR (epidermal growth factor recept or) mRNAとの発現を計量的に分析した。

この試験を行うに際し、患者力インフォ一ムドコンセントを得て、且つ、研究プロトコール (計画案）は、 1975年のヘルシンキ宣言の倫理的ガイドラインに従ったものとした。

且つ、鳥取大学の倫理委貝会 (the human research committee of Tottori Univers y)の承認を得た（承認番号第 138、 No. 138— 1 , 2001年（approval No. 138， No. 1 38- 1 , 2001) )。

本発明に係る癌診断方法では、まず、被験者 (患者)の血液を採取した。 ■

次に、血液中から RNAを含む試料を得た。

より具体的に説明すると、患者力採取した体液 (この例では、血液）（約 l〜2ml)について、 1 0°Cで 10分間、 3段階 (800xg、 lOOOxg, 1500xg)の遠心分離操作を行うことにより、リンパ球 (lymphocyte)の存在を無視できる量になるまで少させた血清（上澄み）（serum samples) を得た。

この血清（上澄み）（serum samples)中の hTERT mRNAと EGFR mRNA力肺の悪性腫瘍（pulmonary malignancies)に起源を発しそこ力放出されたものであるかを調べるため、 23名の肺癌患者の外科的切除肺組織と漿液 (sera)とを採取した。

2. RN Aの抽出と Real— time quantitative RT— PCR.

次に、 RNAを、従来公知の方法で、血清（上澄み） (serum samples)から、デォキシリボヌクレアーゼ (DNase； deoxyribonuclease)処理 (treatment)を用レ、て抽出した。

血清（上澄み） (serum samples) 200 μ 1中力ら抽出した RNAをヌクレアーゼフリーの水（H2 O)に溶角军した。

次に、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（quantitative RT- PCR (real time poly merase chain reaction)を、ワンステップ RT— PCRキット（One Step RT— PCR kit) (Qiagen社製）の中に、の RNA抽出物と 2 1の SYBR Green I (Roche, Basel, Sw itzerland)とを使用して、行った。

RNAは、同じ容量の血清を使用し HCC組織を用いて抽出し、その後、 20倍の濃度になるまで乾燥させた。 .

HCC組織からの RNAの抽出は、 TRIzol (登録商標）試薬 (Reagent)を使用し、この試薬の製造販売会社（Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA, USA)の使用説明書に従って行つた。 '

この実験に使用したプライマー及び標的塩基配を、図 2に示す。

即ち、 EGFRを検出するためのプライマーセットとして、上流側プライマ一（EGFR— F)を、 AACTGTGAGGTGGTCCTTGG とし、下流側プライマー（ E G F R — R ) を、 GTTGAGGGCAATGAGGACATとした。尚、上流側プライマーは、標的塩基配列の順方向（5'→3')に設定し、下流側プライマーは、標的塩基配列の上流側プライマーの順方向に相当する鎖に対し、相補的配列で且つ逆方向に設定したものである。

図 3〜図 5に、 EGFRの全長塩基配列を示す。

この増幅ターゲットは、 EGFRのチロシンキナーゼ加リン酸サイト（a tyrosine kinase pho sphorylation site of EGFR)であり、また、このプライマーは、その塩基配列中に変異を含んでいなレ、ものとした。

また、比較のため、 hTERTを検出するプライマ一セットとして、上流側プライマー（hTERT- F) を、 CGGAAGAGTGTCTGGAGCM とし、下流側プライマ一（hTERT— R)を、 GGATGAAGCGGAGTCTGGAとした。

また、 2— microglobinでは、上流側プライマー（ 2— microgl ob in— F )を、 TGAGTGCTGTCTCCATGTTTGA とし、下流側プライマー（ 2— microglobin— R)を、 TCTGCTCCCCACCTCTAAGTTGとした。

リアルタイム PCR(RT— PCR)の条件は、最初の逆転写反応を、 50°Cで 30分間行い、その後、反応活性化段階として、 95°Cに、 12分間保ち、その後、 PCR反応を 50サイクル（95°C (0秒）、 55°C (10秒）次いで 72°C (15秒)行レ、、そして、 40°Cで 20秒間、熱変性した。

hTERT mRNAと EGFR mRNAに対するリアルタイム PCR (RT— PCR) 分析の射程範囲は、この分析では、約 5コピーであり、そして、我々は、患者と比較例からの血清試料中、誤って陰性とする可能性を排除することができた。この PCRは、 hTERTに対し、 131 bpの産出物を、 EGFRに対し、 1 14 bpの産出物を、また、 β 2-microglobin RNA に対し、 88bpの産出物を、各々、産生した。

この RT-PCR分析は、 2回、繰り返し、この定量化については、ライトサイクラ一（LightCycler (登録商標）（ロッシュ社 (Roche, Basel, Switzerland) )を用レ、ることで、繰り返し再現性があることを確かめた。

3.免疫組織学的検討（Immunohistochemistrv)

切除組織をパラフィン中に包埋する（paraffin embedding)ための処理をした。免疫組織研究のため、血清中に腫瘍マーカーの強い蛋白質発現を有する、患者を 3人ずつ（全員で 12名の患者）選び出し、 hTERT, EGFR, SCC (シグマ（Sigma)社製）及び CYFRA (シグマ（Sigma) 社製）の各々を識別する抗体を用レ、て、肺癌横断研究を行った。

免疫組織研究において、 4%パラホルムアルデヒド中に固定した肝臓組織 (liver tissues)をパラフィンに包埋（embedded)した。免疫組織分析のため、次に示す抗体を連続したセクション (^sections)に:! ¾· しに；肺の切除標本の a mouse monoclonal antibody 5— micron— th ick sectionsが、一連のキシレン浴脱パラフィン化（a series of xylene baths)され、また、これらの試料は、等級に分けら: Hたアルコール（graded alcohols)中で再水和化（rehydrate d)された。 ·

染色された全てのセクション（sections)は、電子レンジを用レ、、 600Wで、 15分間、 10 mmo 1/litterのクェン酸ナトリゥム緩衝液中で加熱処理された。

PBS (phosphate buffered saline リン酸〔塩〕）緩衝生理的食塩水の略）中で洗浄後、これらの切断面は、 avidin― biotin― eroxidase complex (Vector Laboratories, Burlinga me, CA)によって染色された。

ェピトープ（epitope、抗原決定基）エキスポ一ジャー（exposure)を高める（enhance)するために、スライドを、 98°Cで、 10— mmol/litterのクェン酸緩衝液（citrate buffer)用い、 H6 で、 90分間、前処理した。

セクション（sections )は、その際に、非特異性の結合を減じるために 2. 5 %の遮断血清 (blocking serum)中で培養された。これに引き続き、試料を、 37°Cで、プライマリーモノクロ一ルマウス hTERT (H - 231) sc— 7212 抗体（primary monoclonal mouse hTERT (H— 231) sc— 7212 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ) hu man EGFR (1005)、 sc— 03抗体 (sc— 03 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) )を使用して、 90分間、パラフィンセクションの上で、 1 : 50の希釈で、培養した。これらのセクシシヨン (sections)は、企業 (Vector Laboratories,' Burlingame, CA, USA)の推奨に従って、標準アビジン一ピオチン免疫化学（standard avidin -biotin immunochemistryjで処理されに。

最後に、色素原として、ジァミノベンゼンを用い、そして、核対比染色として、へマトキシリンを用いた。陰性対象として、一時抗体を省略して染色処理を行った。結果をパーセンテージで表した。核小体 (nucleolar) hTERTは、テロメァ機能と関係している。核小体染色された細胞だけが分子計算器 (numerator)に含められた。免疫反応性は、蛍光色素接合 2次抗体を用いて視覚化した。 hTERT染色は、陰性（く 50% of tumor cells positive at the nucleolar level)と陽性（〉50% of them)とに分類した。

4.統計解析

SPSS II (SPSS Corp. , Tokyo, Japan)を使用して、 hTERT、 EGFR及びその他のマ一カーに影響する重要な臨床病理学的知見を行った。

各々の臨床因子 (パラメーター）における層別分類は、論理学的回帰分析モデノレを使用して、多変量解析法によって評価した。

各々の腫瘍マーカ一について、多変量解析法によって、肺疾患の間に見られる重要な相違を調べた。

hTERT mRNA, EGFR mRNA, 従来の腫瘍マ一カー及び臨床的因子（パラメ一ター）間の相関を調べるために、ピアソンの相関係数 (Pearson' s relative index)を計算した。

この結果、 0. 05以下の確立で、統計上の差異があることが、判った。 .

診断試験（diagnostic tests)の正確さを査定（assess)するため、 SPSS II (SPSS Corp. , Tokyo, Japan)を使用して、 CEA, SCC, CYFRA, EGFR mRNA 及び hTERT m RNAの各々に関する、マッチ試:験（the matched data sets (肺癌患者と肺癌ではない患者間 (patients with and without malignancies in lung) ) ¾ , ROC (receiver operator characteristic)カーフ' (curve)分析 (analysis)を行った。

この評価分析は、コピー数（copy number)と RNAコントロール（RNA controls) (r > 0. 9 9)を用いた PCRサイクノレ (PC cycles)との間に強い直線関係があることを示していた。肺組織と血清との間の hTERT mRNA と EGFR mRNAとの相関関係は、 2点試験法（Paired t test) 及びスペアマン試験（Spearman ' s test)の両方を使用して解析した。

各々の定量分析において、コピー数と RNAコントロール（RNA controls)を用いた PCRサイクル（PCR cycles)との間には、強い直線関係が示された（r²>0. 99)。

hTERT mRNA及び EGFR mRNA の発現は、疾病の進行に伴って、徐々に、増加作用を示し、また、その定量値は、健常人に比べ、肺癌において、有意に髙くなつていた（Pく 0. 0 1) 。

また、ピアソンの相関係数（Pearsons' relative index) によれば、 hTERT mRNA レべノレは、 EGFR mRNA レべノレ（level)、肺疾患、 TPA (tissue polypeptide antigen)、 SC C：、及ぴ、腫瘍数と有意差を持って関係がなレ、ことが判った（各々、 P = 0. 015、 P = 0. 017、 P く 0. 001及び P= 0. 042)。

また、ピアソンの相関係数（Pearson' s relative index) によれば、 EGFR. mRNAは、（癌に）占拠された肺葉 i (occupied lobular segment)の数，転移、再発及び臨床病期と有意差を持って相関関係があった（各々、 Ρ=0· 033、 Ρ=0. 043、 Ρ=0. 002及び Ρ<0. 001)。スペアマン試験（Spearman' s test)は、肺癌組織における hTERT mRNAと EGFR mRN Aと、血清中の hTERT mRNA と EGFR mRNAとが強い関係があることを示していた（各々、 P = 0. 021及ぴ P = 0. 002) ₀

図 6は、 hTERT mRNA及び EGFR mRNAの各々の組織と血清との間の相関関係を表すグラフであり、図 6 (a)は、 hTERT mRNAの組織と血清との間の相関関係を表すグラフであり、また、図 6 (b)は、 EGFR mRNAの組織と血清との間の相関関係を表すグラフである。

この組織と血清との間の相関は、血清中の hTERT mRNAと EGFR mRNAとが肺癌組織から由来していることを示している。

多変量解析によって、臨床病理学的知見として、血清中の hTERTおよび EGFRの発現には強レ、関係があることが判った（図 7を参照)。

喫煙、腫瘍の大きさ、腫瘍数、転移や再発の有無は、 hTERT mRNA発現と強い関係があること力半 IJつた（各々、 P = 0. 029、 p = 0. 002、 P = 0. 003、 P = 0. 004及び P = 0. 013) ' 腫瘍数、腫瘍の大きさ、再発及び臨床ステージは、 EGFR mRNA発現と強い関係があること力 S判った（各々、 P= 0. 047、 P= 0. 043、 P = 0. 037及び P = 0. 032)。

肺癌において、全ての腫瘍マーカーは、病因との関係を示さない。従来の腫瘍マーカーはどうかといえば、 CEAレベルは、喫煙や肺癌に占拠された肺葉の数と強い関係が有り（各々、 P = 0. 031)、 SCCレベルは、腫瘍数、腫瘍の大きさ及び転移と強い関係が有り（各々、 P = 0. 016、 P = 0. 015及び P - 0. 044)、また、 CYFRA レベルは、腫瘍数、腫瘍の大きさ、転移及ぴ再発と強い関係がある（各々、 P= 0. 017、 P=0. 019, P=0. 045及び P=0. Oi l) (図 7を参照)。 '

図 8は、ロックカーブ解析 (ROC curve analyses)の結果を示すグラフである。

図 8から、肺癌に対する hTERT mRNAと EGFR mRNA の感受性/特異性は、各々、 7 1. 8%/72. 5% 及ぴ 60. 8%/62. 5%,であることが判った（図 9を参照）。

hTERT mRNAと EGFR mRNAの発現のォプティマルカットオフ値（Optimal cut-off values) (ま、統計学的に、各々、 103. 76copies/0. 2 ml、 101. 21 copies/0. 2 mlであるとして計算された。

また、癌形成時の陽性予見値 (PPV) /陰性予見値 (NPV)は、各々、 hTERT mRNAにおレヽて、 0. 775/0. 667であり、また、 EGFR mRNAこおレヽて、 0. 667/0. 407であった。

CYFRA、 SCC及び CEAの癌形成時の陽性予見値 (PPV) Z陰性予見値 (NPV)は、各々、 0. 650/0. 500、 0. 207/0. 875、及び、 0. 650/0. 391であった。

癌形成時の陽性予見値 (PPV) /陰性予見値 (NPV)についての感受性/特異性の比較によつて、多くの患者の定量化を用いた正確なカットオフ値（cut— off value)の設定（set— up)により、 hTERT mRNAと EGFR mRNAの統計的な評価を更に改善できた。

次に、外科的処置の前と後（術後 3週間）の hTERT mRNAと EGFR mRNAの定量値について説明する。

切除前と外科的処置後 3週間後との比較によれば、 hTERT mRNAと EGFR mRNAの術後の定量値は、術前の定量値に比べ低くなつていた。

免疫組織学的試験において、 hTERT mRNA, EGFR mRNA、 SCC及び CYFRAの高い発現は、 hTERT、 EGFR, SCC, CYFRA 蛋白質の高い発現を示しており、結果として、血清中における測定値は、組織中における測定値と ¾全に互換できるものであった。

また、血清中と腫瘍組織との間にある hTERT mRNAと EGFR mRNAとの相関は、血清中において見出された hTERT mRNA腫瘍細胞由来であることを強く示してレ、た。

また、 RNAは、採血後 24時間以内においては安定である。ここで、 hTERT発現は、健常人の血清中において非常に、微弱である。

また、肝細胞癌（HCC)患者の血清中の hTERT mRNAの発現の感受性 Z特異性力;、他の従来の腫瘍マーカ一よりも優れてレ、る。

一方、 EGFRは、細胞増殖、アポトーシス、血管新生、細胞死や、転移のような、発癌過程に関係する。

即ち、 EGFR発現と増殖潜在能力とは、非小細胞癌患者には、独立の予後因子（パラメータ）である。

EGFRは、グリア芽細胞腫（33%)、結腸直腸癌 (70%)、頸部新生物（cervical neoplasia) , 頭部と類部 SCC (head and neck SCC) (41 %)、メラノーマに発現する。

SCC、 CYFRA、 CEA、 NSE、 proGRP、 TP Aおよび SLX は、腺腫、うろこ細胞癌腫、小細胞肺癌、その他の病理的な種類を含む肺癌に、広く使われてレ、る信頼できるマーカ一である。 - しかしながら、この試験により、 hTERT mRNAと EGFR mRNA は、ロックカーブ解析 (ROC curve analysis (感受性 "特異性（sensitivityZspecificity) )、 PPV/NPV及び計算したカットオフ値（calculated cut-off point)に基づけば、総合的に他のものより優れている、とレ、うことが判った（図 8及び図 9を参照)。

hTERT mRNA は、癌細胞の発達においての、癌細胞それ自体の発現と、 EGFR mRNA に関連することが提案されてレヽるので、肺癌患者の hTERT mRNA の発現は、特に、 TPA, S CC、腫瘍の数、活動的な肝臓の炎症の発現（各々、 P=0. 017、 Pく 0. 001、 P=0. 042及び p = 0. 015)と関係が有り、そして、 EGFR mRNA の発現は、ピアソンの相関係数（Pearson s ' relative index)を用いれば、転移、再発の発現や、有意差のある、医学的な段階相関性がある（各々、 P = 0. 043、 P= 0. 002及ぴ Pく 0. 001)。

さらに、多変量解析によれば、 hTERT mRNAは、特に、腫瘍の大きさ、喫煙、転移の存在、再 Sの存在と、 B重瘍の数に（各々、 P = 0. 002、 P = 0. 029、 P= 0. 004、 P = 0. 013及ぴ P=0. 003)、 EGFR mRNA,多かれ少なかれ、腫瘍の大きさ、再発、臨床ステージ、腫瘍の数と、関系カある（各々、 P= 0. 043、 P= 0. 037、 P = 0. 032及び P = 0. 047)。

喫煙は、持続する炎症を引き起こす急激な細胞周期による発癌の危険性を増すことが示され、 CEA は、喫煙 (P = 0. 031 ) と相関関係があり、 hTERT mRNA は、 CEAよりは、喫煙とより強い相関関係がある。

血清中と、腫瘍組織との間の hTERT mRNAと EGFR mRNAとの相関関係は、血清中で検出される hTERT mRNA が特に腫瘍細胞に由来することを示している（図 6を参照。）。

一方、 EGFR mRNAは、 hTERT mRNAほど分散しなレヽ（各々、 Ρ= 0· 002及び Ρ= 0. 021)。

これは、比較試料が十分でなぐ且つ、炎症レベルがこのものの発現には介在しなレ、、という理由で、血清中の EGFR mRNAの発現、即ち、 EGFR mRNAの on/offが明らかである肺癌組織にだけ検出できる力である。

EGFR陰性患者（19/89患者；陽性割合は、 78. 7%)中に、我々は、共通する因子 (パラメ —タ）を見出ことは出来な力た。 17名（17Z19)の患者に、いかなる発現も見ることが出来ず、そして、一般に、 EGFR mRNAが不存在か存在するのかを区別するのは難しいと言われているように、 2名の患者の EGFR mRNAは、 cut— off value以下で発現した。

しかしながら、本発明に係る癌診断方法は、血清中に何ら力 ^処理をする前にこの発現を検出することによって、このことを可能とし、この点に光を当てるものである。

これと同時に、 EGFR発現をターゲットする抗癌剤が有効か有効でないかについての適用と見積もりの双方に決断することができる。

また、この試験により、 hTERT mRNAの発現が高い肺癌組織において、 11. 5% (3 26患者）が、血清中において、カットオフ値 (cut— off)以下の低い発現を示してレ、ることを認識した。また、今回の試験では、 89人の肺癌患者のうち 15人の患者は、陰性であった。血清中の hTE RT mRNAの計算された、陽性のものは、 81. 3%であり、間違って陰性としてレ、るものをカバーするための他の生体マーカーが必要である。

また、肺癌を持った患者の中で他のマ一力一と比較して、 hTERT mRNAは、'より高い感度および特異性を示した。

hTERTと EGFRは肺癌に対し必ずしも特異的ではないが、そのようなバイオマーカーの臨床への適用は、臨床相におけるより簡単な診断おょぴ評価に役立つ。

また、肺癌の診断に、 hTERT mRNAと EGFR mRNAとの 2 つのバイオマ一カーを適応させた場合には、その検知割合は、 87. 8% (78ノ 89患者）（Pく 0. 0001)になる、ことが判った。また、 hTERT mRNAは、感度と特異性の両方を改善するだけでなぐ腫物サイズや腫瘍の数と密接な相関性力 ¾ることが、判った。生物学の特性として、肺癌は、処置後、繰り返し、再発するので、 hTERT mRNA及ぴ EGFR mRNAの血清の測定は、 1ポイント分析（one— point diagnosis)と同様、詳細に、再発や治療効果を把握することを可能にするものである。

また、外科的処置前と外科的処理後 3週間後を比較すると、外科手術後において、両方のバイォマ一力一の定量値は、手術前の両方のバイオマーカーの定量値に比べ低くなつており、このことは、両方のバイオマーカー正確な腫瘍マ一カーでありえることを示唆していた。

今回の研究結果、次のことが明らかになった。

hTERT mRNA及ぴ EGFR mRNAは、肺癌を患者に対し、 EGFR mRNAと比較して、より高レ、感受性と特異性を示した。

血清中の hTERT mRNAおよび EGFR mRNAの定量化することは、肺癌診断によって重要な意味合いを持つ。

即ち、本発明に係る癌診断方法は、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できるので、早期医療行為によって癌細胞を根絶することが可能になる。

また、体液中力も mRNAを含む試料を得るようにしたので、癌組織腫瘍形成、転移後の切除組織中力 EGFRを検出するよう場合に比べ、癌細胞の有無を正確に検出することができる。また、 PCRを行う際に使用するプライマーを工夫することにより、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中力検出できるようになった。

また、本発明に係る癌診断方法を用いれば、医師が、患者に対し、ゲフイチニブ（Gefitinib) のような EGFRチロシンキナ一ゼ阻害作用剤を処方するか否かの判断するのが容易となり、また、患者に対し、ゲフイチニブ（Gefitinib)のような EGFRチロシンキナーゼ阻害作用剤を処方後においても、ゲフイチ-ブ（Gefitinib)のような EGFRチロシンキナーゼ阻害作用剤が腫瘍に有効であるか否かの追跡調査が容易に行える。

更に、本発明に係る癌診断方法及び肺癌診断方法では、ある患者の体液中から、体細胞 '癌細胞成分として、 RNAのみを含む試料を得る工程と、 RNAのみを含む試料力、ら逆転写酵素で cD NAを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いた PCRを、 EGFR mRNAの存在を検出する、プライマーセットを用いて行レ、、 PCRにより増幅された PCR産物を前記 PCR産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第一の癌診断方法と、前記ある患者の体液中から、体細胞'癌細胞成分として、 RNAのみを含む試料を得る工程と、 RNAのみを含む試料から逆転写酵素で cDNAを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いた PCRを、 hTERT mRN Aの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、前記 PCRにより増幅された PCR産物を前記 PCR産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第二の癌診断方法とを行い、第一の癌診断方法と第二の癌診断方法の双方の結果が、陽性と判定された場合、癌と判断するようにしてレ、るので、肺癌患者であるにもかかわらず、陰性と判断してしまったり、また、肺癌患者でないにも力かわらず、陽性と判断する場合を著しく低減する。

尚、本明細書の、発明を実施するための最良の形態では、本発明に係る癌診断方法として、血液中力 RNAを抽出した例を示した力本発明に係る癌診断方法では、血液から RNAを抽出する場合に限られず、血液以外の体液力 RNAを抽出するようにしてもよい。産業上の利用可能性

本発明に係る癌診断方法及び肺癌診断方法は、癌の初期におレ、て癌細胞の存在証拠を血液中力ら検出できるので、早期医療行為によって癌細胞を根絶することが可能になり、また、患者に処方する前に、本発明に係る癌診断方法及び肺癌診断方法を行えば、その結果に基づいて、抗癌剤が有効か否かの判断や、患者に抗癌剤を処方後に、その患者を治療する際に、本発明に係る癌診断方法及び肺癌診断方法を行うことで、その患者に処方されている抗癌剤が有効か否かを判断できるので、癌治療の効果を高めることが可能になるので、産業上の利用可能性が髙ぃ。

Claims

青求の範囲

1.ある患者の体液中から、体細胞'癌細胞成分として、 RNAのみを含む試料を得る工程と、前記 RNAのみを含む試料力、ら逆転写酵素で cDNAを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いた PCRを、 EGFR mRNAの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、前記 PCRにより増幅された PCR産物を前記 PCR産物と結合した蛍光色素を用レ、、定量的に計測する工程とを備える、第一の癌診断方法と、

前記ある患者の体液中から、体細胞，癌細胞成分として、 RN Aのみを含む試料を得る工程と、前記 RNAのみを含む試料力逆転写酵素で cDNAを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いた PCRを、 hTERT mRNAの存在を検出する、プライマーセットを用いて行い、前記 PCR により増幅された PCR産物を前記 PCR産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、第二の癌診断方法とを行い、

前記第一の癌診断方法の結果が、陽†生と判定され、且つ、前記第二の癌診断方法の結果が、陽性と判定された場合、癌と判断する、癌診断方法。

2. 前記 EGFR mRNAの存在を検出する、プライマーセットが、上流側プライマーが、 AACTGTGAGGTGGTCCTTGG であり、下流側プライマーが、 GTTGAGGGCAATGAGGACATである、請求の範囲第 1項記載の癌診断方法。

3.前記 hTERT mRNAの存在を検出する、プライマーセットが、上流側プライマ一が、 CGGA AGAGTGTCTGGAGCAAであり、下流側プライマーカ GGATGAAGCGGAGTCTGGA である、請求の範囲第 1項又は請求の範囲第 2項記載の癌診断方法。

4.前記体液が、血液である、請求の範囲第 1〜3項のいずれかに記載の癌診断方法。

5.請求の範囲第 1〜4項のいずれかに記載の癌診断方法を用いた、肺癌診断方法。