PL230661B1 - Metoda predykcyjna in vitro do przewidywania i/lub wykluczenia obecnosci raka pluc, zastosowanie in vitro metody predykcyjnej oraz zestaw testowy do wykrywania in vitro raka pluc - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest metoda predykcyjna in vitro do przewidywania i/lub wykluczenia obecności raka płuca, zastosowanie in vitro metody predykcyjnej oraz zestaw testowy do wykrywania in vitro raka płuca. Sygnatura markerów białkowych o podwyższonym stężeniu w stosunku do określonego zakresu normy lub górnego poziomu odcięcia badana we krwi obwodowej, która spośród osób z grupy wysokiego ryzyka zachorowania na raka płuca ma znaczące prawdopodobieństwo występowania tej choroby i równocześnie wykluczenie obecności nowotworu u osób z prawidłowym stężeniem wybranych do sygnatury markerów białkowych.

Podstawy wynalazku

Leczenie nowotworów złośliwych jest największym wyzwaniem publicznej służby zdrowia w uprzemysłowionych krajach świata. Rak płuca jest najczęstszą przyczyną zgonu z powodu nowotworu stanowiąc 18,2% zgonów na nowotwór złośliwy w 2008 roku. Wpływa na to późne rozpoznanie i ograniczone możliwości terapeutyczne u 75% chorych, u których choroba wykrywana jest w postaci bardzo zaawansowanej. Powoduje to, że w krajach wysoko rozwiniętych przeżycie 5-letnie dotyczy niecałych 15% populacji chorych na ten nowotwór. Według Krajowego Rejestru Nowotworów w 2006 roku stwierdzono w Polsce 20,232 nowych zachorowań na raka płuca, w tym 15,157 u mężczyzn i 5,075 u kobiet (odpowiednio, 23,6% i 8,2% ogółu nowotworów). Standaryzowany współczynnik zachorowalności na 100 000 osób wyniósł w 2003 roku 58,5 dla mężczyzn i 15,1 dla kobiet. Rak płuca jest przyczyną największej liczby zgonów z powodu nowotworów złośliwych. W 2006 roku zarejestrowano 21,731 zgonów, w tym 16,623 u mężczyzn i 5108 u kobiet (odpowiednio, wskaźnik struktury - 32,1% i 12,8% ogółu nowotworów). Standaryzowany współczynnik umieralności na 100 000 osób wyniósł w 2006 roku 63,6 u mężczyzn i 14,5 u kobiet.

Stale wzrastająca liczba zachorowań oraz niezadowalające wyniki leczenia są istotnym problemem społecznym. Zasadnicze znaczenie w zmniejszeniu umieralności w tej chorobie ma pierwotna profilaktyka, która polega na całkowitej eliminacji narażenia na działanie składników dymu tytoniowego. Próby stosowania różnych form profilaktyki pierwotnej dają niestety bardzo ograniczone wyniki. Drugim co do skuteczności narzędziem walki z rakiem płuca jest wtórna profilaktyka nowotworu czyli wprowadzenie badań przesiewowych identyfikujących osoby chore we wczesnym stadium choroby. Jak dotychczas nie udało się wprowadzić metody, która spełniałaby wszystkie wymagania kwalifikujące ją jako powszechnie stosowane narzędzie w badaniu przesiewowym.

W 2012 roku opublikowano wyniki badania National Lung Screening Trial przeprowadzonych w grupie ponad 53 000 ochotników, w którym wykazano ponad 20% zmniejszenie umieralności w grupie osób wysokiego ryzyka zachorowania na raka płuca wśród uczestników, którzy mieli wykonane badanie przesiewowe przy zastosowaniu niskodawkowej tomografii komputerowej (NDTK) w porównaniu do uczestników monitorowanych przy zastosowaniu klasycznego zdjęcia radiologicznego. Analiza tego badania wykazała, że wykrywalność raka płuca przy zastosowaniu NDTK wynosi 2,4% w okresie 3 lat po przeprowadzeniu u wszystkich uczestników trzech badań. W badaniu tym stwierdzono, że wartość predykcyjna pozytywnego testu (PPV) wynosi 1,2% przy 100% wartości predykcyjnej negatywnego testu (NPV). Badania zostały przeprowadzone w grupie osób wybranych na podstawie określenia ryzyka zachorowania jako wiek 55-79 rok życia i wypalenie powyżej 30 paczkolat. Stosunkowo wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich powoduje, że wprowadzenie tej metody jako rutynowego narzędzia populacyjnego badania przesiewowego jest kwestionowane zarówno z punktu widzenia wysokich kosztów wykrycia nowotworu, jak również zagrożeń związanych z wykonywaniem inwazyjnych badań diagnostycznych w grupie osób z wykrytym guzem płuca. Nie pozwala to zastosować narzędzia jakim jest NDTK, jako powszechnego badania przesiewowego w chwili obecnej.

Dlatego istnieje potrzeba opracowania skutecznego, małoinwazyjnego molekularnego testu pozwalającego na rozpoznanie wczesnej postaci przedklinicznej raka płuca. Możliwość oznaczenia biomarkera w surowicy krwi spełnia te kryteria i może w znaczący sposób przyczynić się do poprawy wyników leczenia raka płuca poprzez zastosowanie jako testu przesiewowego w grupie osób wysokiego ryzyka określonej powyżej. Wśród najintensywniej badanych biomarkerów pod kątem zastosowania jako test diagnostyczny dotyczący wykrywania raka płuca we wczesnej postaci znajdują się krążące przeciwciała białkowe, mikro RNA (miRNA), profil proteomiczny jako samodzielny (oddzielne) lub wieloskładnikowy panel peptydów.

PL 230 661 B1

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy test pozwalający na określenie kto z grupy wysokiego ryzyka zachorowania na raka płuca ma największe prawdopodobieństwo występowania raka płuca. Zaproponowany test ma zastosowanie jako samodzielna metoda stosowana przed rozpoczęciem badania przesiewowego przy zastosowaniu NDTK. Sposób ten polega na skojarzonym pomiarze poziomów wybranych markerów białkowych, zastosowanych jako wieloskładnikowy profil. Dzięki wysokiej negatywnej wartości predykcyjnej pozwala on z 96% dokładnością na wykluczenie obecności nowotworu płuca u osoby posiadającej wynik ujemny. Z drugiej strony dzięki stosunkowo wysokiej wartości PPV pozwala z 32% dokładnością określić czy badana osoba choruje na raka płuca.

Profil ten ma również zastosowanie u osoby z grupy wysokiego ryzyka jako czynnik predykcyjny, u kogo należy przeprowadzić badania obrazowe w celu podjęcia decyzji o dalszym postępowaniu diagnostyczno-leczniczym.

Obecnie jedynym badaniem przesiewowym w raku płuca, o udowodnionej przydatności klinicznej jest NDTK. Badanie to charakteryzuje bardzo wysokim, 100% NPV pozwalającym na wykluczenie występowania nowotworu u osoby z negatywnym badaniem oraz bardzo niskim parametrem PPV (około 1%). Oznacza to, że nowotwór wykryjemy jedynie u 1 osoby na 100 badanych tą metodą. Powoduje to bardzo duże koszty wykrycia jednego nowotworu, istotny problem psychologiczny dla osoby z wykrytym guzem, który nie jest nowotworem (wynikiem fałszywie dodatnim) oraz konieczność zastosowania dalszej obserwacji lub inwazyjnej diagnostyki u osób z dodatnim wynikiem badania. Powyższe ograniczenia są poważną przeszkodą do powszechnego zastosowania NDTK. Wykryta przez nas metoda pozwala na znaczące zawężenie grupy osób, u których potencjalnie występuje rak płuca.

Wykrycie biomarkera identyfikującego osobę chorą na raka płuca było i jest nadal kluczowym zadaniem różnych dziedzin medycyny laboratoryjnej. Proteomiczne markery mogą być oceniane bezpośrednio z surowicy lub osocza krwi. We współczesnej diagnostyce laboratoryjnej znane jest kilkadziesiąt testów laboratoryjnych, wykazujących zróżnicowaną pod względem siły i specyficzności asocjację z rakami płuc. Są one łatwe do oznaczania i nie wymagają drogiej aparatury. Również ich koszt jest niski w porównaniu z kosztami badań obrazowych lub endoskopowych. Ich wadą jako samodzielnych markerów jest jednak mała czułość i specyficzność. Powoduje to, że przy oznaczaniu pojedynczego markera zawsze istnieje duży margines niepewności diagnostycznej, co znajduje odzwierciedlenie w wartościach współczynnika skuteczności diagnostycznej nie przekraczających 0,70-0,75 i to dla zaawansowanych stadiów choroby.

Oznaczanie niemal wszystkich markerów jest obecnie możliwe przy użyciu gotowych zestawów opartych o różne metody immunochemiczne. Zawierają one specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe mono i/lub poliklonalne przeważnie związane z faza stałą (ściany probówki, mikrosfery szklane) oraz przeciwciała detekcyjne znakowane enzymami, reagującymi z substratami dającymi produkty reakcji, które można oznaczać metodami kolorymetrycznymi, fluorometrycznymi lub luminometrycznymi. Zestawy do oznaczeń są dostępne w różnych formatach przeznaczonych do oznaczeń na automatycznych i manualnych platformach pomiarowych (w tym ELISA). Pozwala to na dostosowanie tych metod do pomiarów szerokiego zakresu stężeń tych analitów, w osoczu/surowicy, wahających się od 10^-8 do 10-10¹⁸ moli/L.

Na podstawie danych literaturowych wyselekcjonowano i zbadano 16 markerów białkowych, których poziom, poprzez różne/niezależne od siebie mechanizmy, mógłby wzrastać u możliwie dużej frakcji osób z rakami płuc. Na podstawie przebadanych 100 osób z rakiem płuca oraz 300 osób zdrowych wyodrębniono sygnaturę złożoną z 3 markerów do stosowania w wykrywaniu raka płuca, ze szczególnym uwzględnieniem wczesnych jego form. Spośród różnych grup markerów nowotworowych potencjalnie użytecznych w tworzeniu algorytmu diagnostycznego wybrano:

Antygeny „glikoproteidowe”: Antygen rakowo-płodowy (CEA), lub/i CA 125, lub/i CA 199.

Antygeny „cytokeratynowe” i wydzielnicze: Cyfra 21-1 albo tkankowy antygen polipeptydowi (TPA). Oba markery są równo cennymi wskaźnikami szybkości proliferacji. Natomiast białkiem wydzielniczym o istotnej korelacji z nowotworami płuc jest Dickkopf-1 (DKK1).

Antygeny „neuronalne”: Enolazaneurono-specyficzna (NSE), lub/i Antygen płaskonabłonkowego raka płuca (SCC), Białko S100 B- antygen specyficzny dla płasko i wielkokomórkowych raków płuca, lecz nie dla gruczolakoraków i drobnokomórkowego raka płuca.

Antygeny specyficzne: Peptyd uwalniający progastrynę (ProGRP), Białko specyficzne dla drobnokomórkowego raka płuca.

PL 230 661 B1

Antygeny towarzyszące: Białko C reaktywne (CRP), Alfa-1 antytrypsyna, Białko wiążące retinol (RBP4).

W przestawionym wynalazku przedstawiamy sygnaturę złożoną z 9 markerów białkowych, które wykazują podwyższone stężenie w surowicy krwi osób chorych na raka płuca względem określonej normy. Sygnatura gwarantuje mierzoną metodami klasycznymi średnią wartość wskaźnika NPV w populacji nie mniejszą od 95%. Surowica do badania pochodziła od osób uczestniczących w Pomorskim Pilotażowym Programie Badań Przesiewowych Raka Płuca. Próbka była pobrana według ściśle określonego protokołu pobierania, przygotowania i przechowywania próbek. Analizy dokonano na podstawie badania poziomów markerów białkowych w surowicy pochodzącym od 100 osób z wykrytym wczesnym rakiem płuca i 300 osób zdrowych, które stanowiły grupę kontrolną. Oznaczeń dokonano metodą kanapkową ELISA. Grupa kontrolna była dobrana ze względu na płeć i wiek do grupy badanej spośród 3500 osób zdrowych w momencie wykonania badania.

Przedmiotem wynalazku jest metoda predykcyjna in vitro do przewidywania i/lub wykluczenia obecności raka płuca, która polega na pomiarze stężenia markerów białkowych w surowicy krwi, gdzie następuje pomiar stężenia w surowicy krwi następujących markerów białkowych: cyfra21-1, hsCRP, NSE, CEA, CA125, SCCA1, h_tPA, S-100, CA19-9.

Metoda gdzie następuje pomiar stężenia w surowicy krwi następujących markerów białkowych: S-100, SCCA1, hsCRP.

Metoda, gdzie rak płuca jest wczesnym rakiem płuca.

Metoda, gdzie biologiczne próbki są pobrane z krwi obwodowej.

Metoda, gdzie metodę tę stosuje się przed badaniem NDTK.

Metoda, gdzie metodę tę stosuje się po badaniu NDTK.

Zastosowanie in vitro metody jak zdefiniowano powyżej, ma zastosowanie do wykrywania raka płuca u osób z grupy wysokiego ryzyka zachorowania na raka płuca.

Zestaw testowy do wykrywania in vitro raka płuca opisany powyżej, metodą ELISA, znamienny tym, że zawiera:

- płytkę testową z dołkami pokrytymi specyficznym przeciwciałem monoklonalnym: anty-cyfra, anty-CEA, anty-hsCRP, anty S-100, anty NSE, anty CA125, anty SCCA1, anty CA19.9 lub anty-h_tPA,

- standardy,

- próby kontrolne „niska” i „wysoka”,

- rozcieńczalnik do próbek,

- roztwór buforowy,

- przeciwciało znacznikowe sprzężone z peroksydazą chrzanową,

- substrat barwny, który zmienia barwę pod wpływem peroksydazy,

- roztwór zatrzymujący reakcję (kwas siarkowy 0,5M),

- płyn przemywający, gdzie wartości referencyjne podane jako wartości górnego poziomu wartości progowych threshold dla danego markera białkowego, do których odnoszone są zmierzone stężenia w surowicy osoby badanej następujących markerów białkowych: cyfra21-1, hsCRP, NSE, CEA, CA125, SCCA1, h_tPA, S-100, CA19-9.

Zestaw gdzie następuje pomiar stężenia następujących markerów białkowych: S-100, SCCA1, hsCRP.

Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:

Osoba z grupy wysokiego zachorowania na raka płuca - osoby w wieku 50-79 lat, które wypaliły co najmniej 20 paczkolat tytoniu.

Paczkolata (paczkorok) - umowne określenie zagrożenia rozwoju chorób zależnych od dym tytoniowego, stosowane w medycynie.

Paczkolata oblicza się poprzez pomnożenie liczby wypalanych paczek papierosów na dobę przez lata nałogu, np.: 1 paczkorok oznacza wypalanie 1 paczki papierosów (20 sztuk) na dobę przez jeden rok.

Niskodawkowa tomografia komputerowa (NDTK) klatki piersiowej - metoda badania TK bez dożylnego podawania środka kontrastowego z użyciem niskich parametrów ekspozycji (napięcie 120 kVp, natężenie 40-80 mA), w celu maksymalnej ochrony radiologicznej i zminimalizowania pochłoniętej dawki promieniowania przy zachowaniu diagnostycznej wartości i czułości.

PL 230 661 Β1 test ELISA (ang. enzyme-linkedimmunosorbentassay), czyli immuno-enzymatyczny test-stosowany w badaniach biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych. Służy on do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych skoniugowanych z odpowiednim enzymem markerowym.

Wartość predykcyjna dodatnia (PPV, ang. Positive Predictive Value) - prawdopodobieństwo, że osobnik miał chorobę mając pozytywny wynik testu. Jeśli więc badana osoba otrzymała pozytywny wynik testu, to PPV daje jej informację na ile może być pewna, że cierpi na daną chorobę.

PPV =

TP

TP+FP (1)

Przedział ufności budowany jest w oparciu o metodę Cloppera-Pearsona dla pojedynczej proporcji. Wartość predykcyjna ujemna (NPV, ang. Negative Predictive Value) - prawdopodobieństwo, że osobnik nie miał choroby mając negatywny wynik testu. Jeśli więc badana osoba otrzymała negatywny wynik testu, to NPV daje jej informację na ile może być pewna, że nie cierpi na daną chorobę.

NPV =

TN

FN+TN (2)

Przedział ufności budowany jest w oparciu o metodę Cloppera-Pearsona dla pojedynczej proporcji. Wartości predykcyjne dodatnie i ujemne są zależne od rozpowszechnienia choroby (od współczynnika chorobowości).

MRV (ang. Multiple Random Validatiori) - kroswalidacja Monte Carlo, metoda oceny jakości predykcji oraz stabilności sygnatury polegająca na wielokrotnej konstrukcji funkcji dyskryminacyjnej klasyfikatora na bazie losowo tworzonych dwóch podzbiorów danych: zbioru uczącego i zbioru testującego. W każdym kroku dokonuje się oceny wybranych wskaźników jakości klasyfikacji (w tym przypadku wskaźników NPV oraz PPV) a powstały w ten sposób zbiór stanowi podstawę do oszacowania przedziałowej estymaty wskaźnika dla populacji. Kolejne losowania zbiorów uczącego i testującego są niezależne od poprzednich losowań, a ich struktura (udział osobników chorych i zdrowych) odpowiada strukturze podstawowego zbioru danych. Wskaźnik proporcji p charakteryzuje stosunek liczebności zbioru uczącego do liczebności zbioru testującego w każdej iteracji.

Krzywa ROC (ang. Receiver Operating Characteristic) jest narzędziem do oceny jakości klasyfikatora, zapewnia ona łączny opis jego czułości i specyficzności. Ten sposób wspomagania systemu decyzyjnego jest szeroko wykorzystywany w różnych zastosowaniach, również w diagnostyce medycznej.

Czułość Sens (ang. Sensitivity, True Positive Ratę) - wskaźnik jakości klasyfikacji określający proporcję wyników prawdziwie dodatnich testu w grupie osób chorych.

Sens =

TP

TP+FN (3)

Specyficzność SPC (ang. SpeciUcity, True Negative Ratę) - wskaźnik jakości klasyfikacji określający proporcję wyników negatywnych testu w grupie osób zdrowych.

SPC =

TN

TN+FP (4)

Wskaźnik AUC (ang. Area Under Curve) - reprezentuje wartość pola powierzchni pod krzywą ROC. Pole powierzchni pod krzywą ROC to prawdopodobieństwo, że klasyfikator nada wyższą rangę losowo wybranemu przypadkowi z odpowiedniej grupy, a nie losowo wybranemu przypadkowi z grupy, w której wiadomo że szukane dane nie występują. W AUC zawarty jest opis precyzji detekcji w całym zakresie pracy systemu. Wartość AUC równą 0,5 można opisać jako działanie losowe, a wartość równa 1,0 to wskaźnik idealny. Oznacza to, że krzywa przechodząca bliżej górnego lewego rogu obrazuje większą dokładność diagnostyczną.

Metoda predykcyjna - metoda pozwalająca na racjonalne, naukowe przewidywanie występowania danego zdarzenia. Jest to również przewidywanie aktualnego stanu układu, czyli sposób określania ryzyka obecności i/lub wykluczenia danego zjawiska.

PL 230 661 Β1

Badania przesiewowe - rodzaj strategicznego badania, które przeprowadza się wśród osób nie posiadających objawów choroby, w celu jej wykrycia i wczesnego leczenia, dla zapobieżenia poważnym następstwom choroby w przyszłości. Badania przesiewowe wykonuje się w całej populacji lub tylko w tzw. grupach wysokiego ryzyka. Zamierzeniem badań przesiewowych jest wykrycie choroby we wczesnej fazie i dzięki temu umożliwienie wczesnej interwencji

Wczesny rak płuca - bezobjawowy rak płuca

Sygnatura markerów białkowych - wyjątkowy zestaw markerów białkowych o podwyższonym stężeniu charakteryzujący raka płuca.

Opis figur:

Fig. 1. Wartości średnie PPV i NPV dla 9-składnikowej sygnatury uzyskanej z zastosowaniem metody regresji logistycznej połączonej z techniką kroswalidacji MRV w zależności od wartości progowej threshold (thr). Kolorem czerwonym oznaczono punkt z sugerowaną wartością progową thr = 0,101.

Fig. 2. Krzywa ROC dla 9-składnikowej sygnatury białek, stworzona na bazie oszacowań czułości i swoistości klasyfikatora wyznaczonych techniką kroswalidacji MRV. Kolorem czerwonym oznaczono punkt z sugerowaną wartością progową thr = 0,101.

Fig. 3. Wartości średnie PPV i NPV dla 3-składnikowej sygnatury uzyskanej z zastosowaniem metody regresji logistycznej połączonej z algorytmem selekcji cech w przód w zależności od wartości progowej thr. Kolorem czerwonym oznaczono punkt z sugerowaną wartością progową thr = 0,102.

Fig. 4. Krzywa ROC dla 3-składnikowej sygnatury białek, stworzona na bazie oszacowań czułości i swoistości klasyfikatora wyznaczonych techniką kroswalidacji MRV. Kolorem czerwonym oznaczono punkt z sugerowaną wartością progową thr = 0,102.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia:

Przykład 1

Pobranie krwi od osoby z grupy wysokiego ryzyka zachorowania na raka płuca w ilości 10 mL krwi obwodowej do probówek „na skrzep”. Inkubacja przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odwirowanie krwi z prędkością 1000 x g w temperaturze 18-20 stopni C, przez 10 minut. Pobranie 6 x 500 μΙ surowicy do krioprobówek i zamrożenie w temperaturze 80 stopni C.

Poziom koncentracji 16 białek został zmierzony z wykorzystaniem techniki ELISA. Wartość ekspresji każdego z wymienionych białek stanowi podstawę do wyliczenia wartości funkcji dyskryminacyjnej w modelu przewidywania występowania raka płuca. Wartość funkcji dyskryminacyjnej powyżej wartości progowej thr stanowi podstawę do zakwalifikowania osobnika do grupy osób o wysokim ryzyku występowania raka.

Do utworzenia sygnatury wysokiego ryzyka zachorowania na raka płuca posłużyła następująca analiza statystyczna: Funkcja dyskryminacyjna w modelu przewidywania, uzyskanym z zastosowaniem regresji logistycznej, ma postać:

gdzie p(z) oznacza wartość funkcji dyskryminacyjnej, natomiast wartość argumentu z wyznaczana jest jako kombinacja liniowa wartości względnych poziomów ekspresji n wybranych białek i dana jest wzorem:

(6)

Metoda największej wiarygodności ML (ang. Maximum Likelihood) wykorzystana została do oszacowania wartości współczynników ///natomiast technika kroswalidacji wielokrotnej MRV stanowiła podstawę do selekcji cech oraz estymacji poziomów wskaźników NPV i PPV. Powstała sygnatura składa się z 9 białek o ekspresji różnicującej osoby chore od osób zdrowych. Ich listę wraz z wartościami współczynników udziału ///przedstawia Tab. 1. WTab. 2 zamieszczone zostały wartości średnie wskaźników NPV, PPV, Czułość (Sens), Swoistość (SPC) oraz AUC dla trzech wybranych progów odcięcia thr. Fig. 1 obrazuje zależność wartości średnich NPV oraz PPV od progu odcięcia thr, natomiast na Fig. 2 pokazano przebieg krzywej ROC.

PL 230 661 Β1

Tabela 1

Białka wchodzące w skład sygnatury uzyskanej przy zastosowaniu metody regresji logistycznej z wykorzystaniem kroswalidacji MRV oraz powiązane z nimi wartości współczynników β>

miRNA lub białko	Oszacowanie współczynnika β	miRNA lub białko	Oszacowanie współczynnika β
Składowa stała	-1,41157	NT-CA125	0,01437
DRG-cyfra21-l	0,07609	USCN-SCCA1	-0,25062
IBL-hCRP	0,22677	htPA	0,00043
DRG-NSE	-0,00153	S-100	-1,13229
NT-CEA	0,00335	NT-CA19-9	0,00391

Tabela 2

Oszacowania wartości PPV, NPV, czułości, swoistości oraz AUC dla 9 składnikowej sygnatury białek w zależności od przyjętej wartości progowej thr oraz metody oceny błędu

Metoda klasyczna	Technika MRV
thr	PPV pi]	NPV I%1	Sens [%]	SPC [%]	AUC	thr	PPV [%]	NPV [%]	Sens (%]	SPC [%]	AUC
0,252	41,18	85,00	63,64	69,39	0,759	0,252	39,81	84,38	61,56	68,74	0,732
0,163	36,15	96,24	94,95	43,54	0,163	35,43	90,22	83,45	49,06
0,101	31,56	95,65	95,96	29,93	0,101	31,78	94,09	93,36	32,92

Badanie stężeń wybranych do sygnatury markerów białkowych u osób z grupy wysokiego ryzyka zachorowania na raka płuca. Osoby u których stwierdza się podwyższone stężenie wszystkich markerów są kwalifikowane do kontroli przy zastosowaniu niskodawkowej tomografii komputerowej.

Przykład 2

Pobranie krwi, a następnie wyznaczanie względnych poziomów koncentracji poszczególnych białek odbywa się w sposób określony w Przykładzie 1. Nie ulega również zmianie postać funkcji dyskryminującej określonej równaniami (5) i (6). Modyfikacji w stosunku do Przykładu 1 ulega natomiast metoda selekcji białek, gdyż na etapie konstrukcji klasyfikatora wykorzystano regresję logistyczną w połączeniu z algorytmem krokowym selekcji cech „w przód” (FS, ang. Forward feature Selection) oraz z kryterium informacyjnym BIC (ang. Bayesian Information Criteriori) selekcji modelu. Zastosowanie krokowej selekcji cech „w tył” (BE, ang. Backward feature Elimination) dało takie same wyniki. Ostateczna sygnatura składa się z 3 białek (stanowiących podzbiór pierwotnego zbioru 9 cech przedstawionego w Tab. 6, a uzyskane oszacowania wartości PPV i NPV pozostają nadal w przedziałach spełniających kryteria skuteczności diagnostycznej i predykcyjnej.

Listę białek wchodzących w skład tej sygnatury wraz z wartościami współczynników udziału /?, przedstawia Tab. 3. W Tab. 4 zamieszczone zostały wartości średnie wskaźników NPV, PPV, Czułość (Sens), Swoistość (SPC) oraz AUC dla trzech wybranych progów odcięcia thr. Fig. 3 obrazuje zależność wartości średnich NPV oraz PPV od progu odcięcia thr, natomiast na Fig. 4 pokazano przebieg krzywej ROC.

PL 230 661 Β1

Tabela 3

Białka wchodzące w skład sygnatury uzyskanej przy zastosowaniu metody regresji logistycznej z wykorzystaniem metody selekcji cech w przód (FS) oraz powiązane z nimi wartości współczynników β>

miRNA	Oszacowanie współczynnika β
Składowa stała	-1,105
S-100	-1,211
USCN-SCCA1	-0,253
IBL-hCRP	0,226

Tabela 4

Oszacowania wartości PPV, NPV, czułości, swoistości oraz AUC dla 3 składnikowej sygnatury białek w zależności od przyjętej wartości progowej thr oraz metody oceny błędu

Metoda klasyczna	Technika MRV
thr	PPV [%]	NPV [%]	Sens [%]	SPC [%]	AUC	thr	PPV [%]	NPV [%]	Sens [%1	SPC [%]	AUC
0,252	38,61	83,83	61,62	67,01	0,743	0,252	38,45	84,44	62,79	66,18	0,732
0,118	32,53	96,04	95,96	32,99	0,118	31,37	93,93	93,32	31,73
0,102	31,05	95,40	95,96	28,23	0,102	30,37	94,34	94,47	27,54

Badanie stężeń wybranych do sygnatury 3 markerów białkowych u osób, u których wykryto guzek w badaniu niskodawkowej tomografii komputerowej. Osoby, u których stwierdza się podwyższone stężenie wszystkich markerów są kwalifikowane do inwazyjnej diagnostyki.

Procedury analityczne - opis metody badania ELISA.

1. Poziomy wszystkich potencjalnych markerów predykcyjno-diagnostycznych surowicy oznaczano metodą ELISA w formacie mikropłytkowym (płytki 96-dołkowe) na automatycznej platformie pomiarowej ΕΤΙ-ΜΑΧ 3000 (Dia Sorin, Bellugia, Włochy). Zasada oznaczania w przypadku każdego parametru była podobna.

2. Polegała ona na wiązaniu analitu, znajdującego się w badanej próbce surowicy, ze specyficznym monoklonalnym przeciwciałem pierwszorzędowym zaabsorbowanym na powierzchni dołków mikropłytki. Po zakończeniu wiązania niezwiązane białka były usuwane przemywaniem. Następnie dodawane było drugie przeciwciało (poliklonalne), przeciw białkom surowicy człowieka, znakowane peroksydazą chrzanową. Po związaniu przeciwciała z zaabsorbowanym analitem, próbki przepłukiwano i dodawano roztwór cztero-metylo benzydyny - substratu dla peroksydazy, który po utlenieniu dawał barwny produkt; po 30-60 min inkubację przerywano H2SO4 i odczytywano absorbancje w poszczególnych dołkach. Stężenie Uganda obliczane było automatycznie z wykresu kalibracyjnego wykonywanego na każdej płytce 96-dołkowej. Wielkość absorbancji była proporcjonalna do zawartości analitu w próbce badanej. Wszystkie pomiary wykonywano w duplikatach.

PL 230 661 Β1

Tabela 5

Markery białkowe wykorzystane w badaniu określającym sygnaturę występowania raka płuca

IW	'T-: Nazwa¢---.<	Kod	Producent
1	CRP	IBL-EU5931	IBL International, Hamburg, Germany
2	CRP high sensitive ELISA	IBL-EU5951	IBL International, Hamburg, Germany
3	CEA	NT-DNOV060	NovaTeclmmunodiagnostica, Dietzenbach, Germany
4	CA 125	NT-DNOV061	NovaTeclmmunodiagnostica, Dietzenbach, Germany
5	CA 19-9	NT-DNOV063	NovaTeclmmunodiagnostica, Dietzenbach, Germany
6	human t-PA ELISA	BS-BMS258/2	Bender MedSystems, Vienna, Austria
7	ELISA Kitfor Human Cytokeratin Fragment Antigen 21-1 (CYFRA21-1) 96T	DRG-EIA3943	DRG Instruments, Marburg, Germany
8	DKK-1 ELISA	81-20412	BiomedicaMedizinprodukte, Wien, Austria
9	ELISA Kitfor Human Squamous Celi Carcinoma Antigen 1 (SCCA1) 96T	USCN E1372HU	USCN Life Science Inc., Wuhan, China
10	ELISA Kitfor Human Squamous Celi Carcinoma Antigen 2 (SCCA2) 96T	USCN-E0159HU	USCN Life Science Inc., Wuhan, China
11	NSE	DRG-EIA2353	DRG Instruments, Marburg, Germany
12	ELISA Kit for Human Antitrypsin Alpha 1 (alAT) 96T	USCNE1697HU	USCN Life Science Inc., Wuhan, China
12	ELISA Kitfor Human Antitrypsin Alpha 1 (alAT) 96T	K6752	Immunodiagnostik AG, Bensheim, Germany
13	SAA (Human) ELISA kit	ABN-KA0518	Abnova, Taipei, Taiwan
14	RBP4 (Human) ELISA kit	ABN-KA0499	Abnova, Taipei, Taiwan
15	Sangtec 100 ELISA	IS-364.701	DiaSorin, Minnesota, USA
16	ELISA Kitfor Human Pro Gastrin Releasing Peptide (pro-GRP) 96T	USCN-E1186HU	USCN Life Science Inc., Wuhan, China
17	ELISA Kit for Human Tissue Polypeptide Specific Antigen (TPS) 96T	USCN-E1281HU	USCN Life Science Inc., Wuhan, China

PL 230 661 Β1

D) Analiza statystyczna danych

1. Algorytm k-najbliższych sąsiadów (dla k = 10) wykorzystany został do predykcji wartości poziomów ekspresji dla przypadku braku danych. Brakujące wartości zastępowane były medianą wartości dla najbliższych, w sensie normy euklidesowej, białek (Troyanskaya et al. 2001).

2. Do konstrukcji klasyfikatora wykorzystano metodę statystyczną regresji logistycznej.

3. Wstępnego uporządkowania cech w kolejności od najbardziej do najmniej znaczących dokonano z wykorzystaniem rangowej zmodyfikowanej statystyki U Mann-Whitneya.

4. Metodę MRV kroswalidacji Monte Carlo wykorzystano do wyboru sygnatury molekularnej. Przyjęto wskaźnik p podziału zbioru danych na podzbiór uczący i testujący jako równy 0,5. Dla każdego modelu cząstkowego dokonano N = 500 niezależnych losowań i na podstawie wyników klasyfikacji oceniano poziom wskaźników NPV i PPV.

5. Ostateczną sygnaturę stanowi zestaw białek wraz z określeniem poziomu wartości progowej thr logistycznej funkcji dyskryminującej maksymalizujących wartość NPV przy ograniczeniu PPV>30.

E) Uzyskane wyniki

W niniejszym wynalazku przedstawiamy sygnaturę złożoną z 9 białek, które wykazują zmienioną ekspresję w surowicy krwi. Ich listę zawiera Tab. 6. Oszacowaną metodą MRV wartość średnia wskaźnika NPV w populacji dla klasyfikatora logistycznego 5 stworzonego na bazie każdego pojedynczego białka z tej listy wynosi co najmniej 75% (Tab. 6 i Tab. 7). Wykorzystanie wszystkich 9 cech poprawia jakość klasyfikacji do poziomu NPV = 95,65 dla klasycznej metody oceny oraz NPV = 94,09 dla metody wielokrotnej walidacji Monte Carlo.

Tabela 6

Wykaz białek wchodzących w skład sygnatury

L.p,	białko	L.p.	białko
1	DRG-cyfra21-l	6	USCN-SCCA1
2	IBL-hCRP	7	h_tPA
3	DRG-NSE	8	S-100
4	NT-CEA	9	NT-CA19-9
5	NT-CA125

Tabela 7

Uzyskane metodą klasyczną oszacowania wartości średnich wskaźników Sens, SPC, PPV oraz NPV w populacji dla klasyfikatora logistycznego stworzonego na bazie każdego pojedynczego białka z listy zawartej w Tab. 5 wraz z indywidualnie dobranymi dla nich wartościami progowymi thr

Ł.p,	białko	Wartość progowa thr	Metoda klasyczna:
Sens.	'.· SPC	PPV	npv
1	DRG-cyfra21-l	0,255	20,20%	95,24%	58,82%	77,99%
2	IBL-hCRP	0,180	70,71%	50,00%	32,26%	83,52%
3	DRG-NSE	0,254	5,05%	97,96%	45,45%	75,39%
4	NT-CEA	0,258	11,11%	97,62%	61,11%	76,53%
5	NT-CA125	0,257	23,23%	85,37%	34,85%	76,76%
6	USCN-SCCA1	0,101	98,99%	12,93%	27,68%	97,44%
7	h_tPA	0,258	36,36%	71,77%	30,25%	77,01%
8	S-100	0,254	84,85%	33,33%	30,00%	86,73%
9	NT-CA19-9	0,258	19,19%	87,07%	33,33%	76,19%

PL 230 661 Β1

Tabela 8

Uzyskane techniką wielokrotnych kroswalidacji Monte Carlo (MRV) oszacowania wartości średnich wskaźników Sens, SPC, PPV oraz NPV w populacji dla klasyfikatora logistycznego stworzonego na bazie każdego pojedynczego biatkaz listy zawartej w Tab. 5 wraz z indywidualnie dobranymi dla nich wartościami progowymi thr

Lp.	białko	Wartość progowa thr	Technika MRV
Sens	SPC	PPV	NPV
1	DRG-cyfra21-l	0,255	27,33%	92,54%	57,20%	79,38%
2	IBL-hCRP	0,180	72,94%	47,36%	31,77%	84,56%
3	DRG-NSE	0,254	41,56%	58,79%	28,08%	71,72%
4	NT-CEA	0,258	13,08%	94,51%	44,85%	76,55%
5	NT-CA125	0,257	24,52%	81,38%	29,05%	76,42%
6	USCN-SCCA1	0,101	98,65%	14,38%	27,77%	97,40%
7	h_tPA	0,258	33,47%	71,33%	28,55%	76,24%
8	S-100	0,254	83,04%	33,97%	29,26%	86,40%
9	NT-CA19-9	0,258	26,21%	76,35%	28,48%	75,48%

Piśmiennictwo:

1. Aberle D.R., Adams A.M., Berg C.D., i wsp. National lung screening trialresearch team reducedlung-cancermortality with low-dosecomputedtomographic screening. N. Engl. J. Med. 2011,365, 395-409.

2. Krzakowski M., Jassem J., Rzyman W. i wsp. Nowotwory płuca i opłucnej oraz śródpiersia. W: Zalecenia postępowania diagnostyczno-terapeutycznego w nowotworach złośliwych - 2013 r. pod redakcją Krzakowski M. i Warzocha K., Via Medica 2013, Gdańsk.

3. Laprus I., Adamek M., Kozielski J. „Potrzeba badań przesiewowych w kierunku badań wczesnego wykrywania raka płuca-nowe dowody, nowe nadzieje” Pneumol. i Alergol. Pol. 2011,79, 419-427.

4. Adriano M.P., Sandro M.P., Matteo Giaj-Levra, et al. Clinicalimplications and addedcosts of incidental findings in an early detection study of lung cancer by usin glow-dose spiral computed tomography. Clinical Lung Cancer 2012, 14, 139-48.

5. Tufman A., Rudolph M.H. Biological markers in lung cancer: A clinician's perspective. Cancer Biomarkers 1009, 6, 123-135.

6. Kulpa J., Wójcik E., Reinfuss Μ. I wsp. Carcinoembryonic Antigen, Squamous Celi Carcinoma Antigen, CYFRA 21 -1, and Neuron-specific Enolase in Squamous Celi Lung Cancer Patients. Clinical Chemistry 2002, 48,1931-7.

7. Hensing T., Salgia R. Molecular biomarkers for futurę screening of lung cancer. J. Surg. Oncol. 2013, 108, 327-33.

8. Casas Pina T., Zapata T.I., Lopez B.J. i wsp. Tumor markers in lung cancer: does the method of obtaining the cut-off point and reference population influence diagnostic yield? Clinical Biochemistry 1999, 32, 467-72.

9. Zhang H., Zhao Q., Chen Y. i wsp. Selective expression of S100A7 in lung squamous celi carcinoma and large cel carcinomas but not in adenocarcinomas and smali cel carcinomas. Thorax2008, 63, 352-9.

10. Patz E.F., Campa M.J., Gottlin E. i wsp. Panel serum biomarkers forthe diagnosis of lung cancer. JCO 2007, 25, 5578-83.

PL 230 661 B1

11. Diagnostic value of SCC, CEA and CYFRA 21.1 in lung cancer: a Baesian analysis. Eur. Resp. J 1997, 10: 603-9.

12. Buccheri G., Torchio P., Ferrigno D. Clinical equivalence of two cyto keratin markers in non-small cel lung cancer. Chest 2003, 124, 622-32.

13. Vourlekis J.S., Szabo E. Use of markers for the detection and treatment of lung cancer. Disease Markers 2004, 20, 71-85.

14. Keloff G.J., Boone C.W., Crowell J.A. i wsp. Risk biomarkers and current strategies for cancer chemoprevention. J Cell Biochem 1996, 255,1-14.

15. Lung cancer biomarkers. Present status and future developments. Arch. Pathol. Lab. Med. 2013, 137, 1191-8.

16. Troyanskaya O., Cantor M., Sherlock G., Brown P., Hastie T., Tibshirani R., Botstein D., Altman R.B.: Missing value estimation methods for DNA microarrays. Bio informatics 2001, 17, 520-5.

Claims (9)

1. Metoda predykcyjna in vitro do przewidywania i/lub wykluczenia obecności raka płuca polega na pomiarze stężenia markerów białkowych w surowicy krwi, znamienna tym, że gdzie następuje pomiar stężenia w surowicy krwi następujących markerów białkowych: cyfra 21-1, hsCRP, NSE, CEA, CA125, SCCA1, h_tPA, S-100, CA19-9.

2. Metoda według zastrz. 1, znamienna tym, że następuje pomiar stężenia w surowicy krwi następujących markerów białkowych: S-100, SCCA1, hsCRP.

3. Metoda według zastrz. 1, znamienna tym, że rak płuca jest wczesnym rakiem płuca.

4. Metoda według zastrz. 1, znamienna tym, że biologiczne próbki są pobrane z krwi obwodowej.

5. Metoda według zastrz. 1-4, znamienna tym, że metodę tę stosuje się przed badaniem NDTK.

6. Metoda według zastrz. 1-4, znamienna tym, że metodę tę stosuje się po badaniu NDTK.

7. Zastosowanie in vitro metody jak zdefiniowano w zastrz. 1-6, znamienne tym, że ma zastosowanie do wykrywania raka płuca u osób z grupy wysokiego ryzyka zachorowania na raka płuca.

8. Zestaw testowy do wykrywania in vitro raka płuca opisany w zastrzeżeniu 1, metodą ELISA znamienny tym, że zawiera:

- płytkę testową z dołkami pokrytymi specyficznym przeciwciałem monoklonalnym : anty-cyfra, anty-CEA, anty-hsCRP, anty S-100, anty NSE, anty CA125, anty SCCA1, anty CA19.9 lub anty-h_tPA,

- standardy,

- próby kontrolne „niska” i „wysoka”,

- rozcieńczalnik do próbek,

- roztwór buforowy,

- przeciwciało znacznikowe sprzężone z peroksydazą chrzanową,

- substrat barwny, który zmienia barwę pod wpływem peroksydazy,

- roztwór zatrzymujący reakcję (kwas siarkowy 0,5 M),

- płyn przemywający, gdzie, wartości referencyjne podane jako wartości górnego poziomu wartości progowych threshold dla danego markera białkowego, do których odnoszone są zmierzone stężenia w surowicy osoby badanej następujących markerów białkowych: cyfra21-1, hsCRP, NSE, CEA, CA125, SCCA1, h_tPA, S-100, CA19-9.

9. Zestaw według zastrz. 8, znamienny tym, że następuje pomiar stężenia następujących markerów białkowych: S-100, SCCA1, hsCRP.