CN108169490B - 一组用于评估胶质母细胞瘤预后的联合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学生物检测技术领域，提供了WDR1、NMI以及LIN28蛋白的新用途，具体是在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用，本发明进一步提供了一种采用免疫组化方法针对WDR1、NMI以及LIN28蛋白的定量检测来进行脑胶质母细胞瘤预后评估的试剂盒和检测方法。本发明利用免疫组化技术、系统评分测定脑胶质母细胞瘤组织中WDR1、NMI和LIN28蛋白的表达水平，并结合术后随访信息，确定WDR1、NMI、LIN28蛋白表达水平与手术后脑胶质母细胞瘤患者预后存在相关性，WDR1、NMI和LIN28蛋白联合能用于制备判断脑胶质母细胞瘤患者预后的蛋白分子标记，对于脑胶质母细胞瘤的分子分型、病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

Description

一组用于评估胶质母细胞瘤预后的联合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，涉及WDR1、NMI和LIN28三种蛋白的新的用途，具体为WDR1、NMI和LIN28蛋白联合在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用。

背景技术

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤，按病理及临床特点可分为I至IV级，其中胶质母细胞瘤(GBM)是脑胶质瘤中恶性程度最高的亚型。由于胶质母细胞瘤侵袭性生长，近年来尽管在以标准化治疗为基础的多重治疗方面取得了一些进展，但胶质母细胞瘤患者的总体预后仍未有明显改善，其中位生存期只有14-16个月。

胶质母细胞瘤患者预后取决于某些临床因素，如发病年龄、KPS评分、手术切除程度、病理类型等。当前，胶质母细胞瘤诊断仅以形态学为基础，难以客观全面地反应肿瘤的生物学行为特征，不能准确判断患者预后和指导术后临床治疗。因此，寻找能够更加有效区分胶质母细胞瘤分子亚型及准确判断预后的相关基因/蛋白，筛选出高位患者，指导临床治疗，是本发明的基础出发点。

前期发明人基因芯片对14例不同级别胶质瘤组织进行表达谱检测，根据患者预后好和差(以60个月为界限)分为两组，筛选出72个差异表达基因(表达值相差2倍以上，p<0.001)，其中包括WDR1、NMI、LIN28、EMP3、CDK2等。进一步，通过对TCGA数据库的分析发现WDR1、NMI、LIN28的mRNA表达水平与胶质母细胞瘤患者预后相关。

WDR1是一高度保守的蛋白，广泛表达与真核细胞，参与肌动蛋白丝分解，在有丝分裂及细胞迁移中发挥重要作用，而此类功能也是恶性肿瘤增殖侵袭的重要生物学基础。已有文献报道WDR1在多种肿瘤如乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌等中表达明显上调，参与肿瘤恶性进程。

NMI作为致癌基因NMYC和CMYC的互作因子，已被发现参与多种细胞信号通路如JAK/STAT等，而该通路可促进肿瘤增殖侵袭，调节肿瘤免疫和微环境等。但NMI本身在肿瘤中的表达及作用机制研究较少。

LIN28被发现是一RNA结合蛋白，可与miRNA let-7前体结合阻止其成熟过程，而RAS，CMYC等多种致癌基因均受let-7负性调控，抑制let-7被证明与多种肿瘤如肺癌、宫颈癌、肝癌等有关，研究证实LIN28在此类肿瘤中表达明显升高，并与患者较差预后密切相关。

在此基础上，本发明前期研究通过组织芯片对WDR1、NMI、LIN28在胶质母细胞瘤中蛋白表达水平进行验证，发现WDR1、NMI、LIN28均在胶质母细胞瘤中高表达，并与患者不良预后密切相关。

虽然上述每种蛋白均具有预测胶质母细胞瘤预后的潜力，但把三种蛋白联合起来预测胶质母细胞瘤患者的预后则具有更强的判断效能。

目前尚无WDR1、NMI、LIN28蛋白应用于脑胶质母细胞瘤的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脑胶质母细胞瘤的预后评估标志物，本发明的目的也在于提供WDR1、NMI以及LIN28蛋白的新用途，即在脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用。

发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测WDR1、NMI、LIN28三种蛋白在脑胶质母细胞瘤组织中的相对表达量，能够判断脑胶质母细胞瘤患者的生存预后。基于WDR1、NMI以及LIN28蛋白的相对表达量与脑胶质母细胞瘤的这种相关性，以该蛋白作为分子标记物对其表达量进行检测，可以用于指导脑胶质母细胞瘤患者的预后判断。

本发明的第一方面，提供了WDR1、NMI以及LIN28蛋白作为脑胶质母细胞瘤预后评估标志物的应用。

本发明的第二方面，提供了一组联合蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂或预后评估试剂盒中的应用，该联合蛋白为WDR1、NMI和LIN28蛋白的联合。

在本发明所提供的一组联合蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂或预后评估试剂盒中的应用中，所述的预后评估试剂为检测生物样品中WDR1、NMI以及LIN28蛋白相对表达量的试剂的组合。

所述的预后评估试剂盒包含了检测生物样品中WDR1、NMI以及LIN28蛋白相对表达量的试剂的组合。

所述的检测生物样品中WDR1、NMI以及LIN28蛋白相对表达量的试剂包括WDR1、NMI、LIN28蛋白抗体以及与以及与三种蛋白的定量检测相配套的试剂。也就是，将WDR1、NMI以及LIN28蛋白同时作为分子标记，利用WDR1、NMI和LIN28单克隆或多克隆抗体，以及WDR1、NMI、LIN28蛋白的定量检测，分析WDR1、NMI和LIN28蛋白在脑胶质母细胞瘤组织中的相对表达量。

优选的，WDR1、NMI、LIN28蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。WDR1、NMI、LIN28蛋白抗体可通过抗体的常规制备方法进行制备或购买商品化抗体。

WDR1、NMI、LIN28蛋白的定量检测为免疫组化检测，免疫组化检测试剂包括二甲苯、乙醇、H2O2体积分数为3％的H2O2-甲醇液，1％BSA封闭液，柠檬酸盐缓冲液、DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶。通过免疫组化实验，能够通过染色强度和染色阳性细胞的个数对每个检测样本中的WDR1、NMI和LIN28蛋白的表达量进行直观分析。

所述的生物样品选自：脑胶质母细胞瘤患者手术切除的肿瘤标本切片。

本发明的第三方面，提供了一种脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒，该试剂盒包含了检测生物样品中WDR1、NMI以及LIN28蛋白相对表达量的试剂。

所述的预后评估试剂盒包含了WDR1、NMI和LIN28蛋白抗体系统以及与WDR1、NMI、LIN28蛋白的定量检测相配套的试剂系统。

本发明的第四方面，提供了一种利用上述预后评估试剂盒进行脑胶质母细胞瘤预后评估方法，所述的检测方法如图1所示，具体包括以下步骤：

(a)利用试剂盒中的免疫组化实验试剂标记羊抗兔IgG，将脑胶质母细胞瘤组织切片进行免疫组化染色；

(b)光镜下观察脑胶质母细胞瘤组织染色情况，分别对WDR1、NMI、LIN28蛋白抗体染色细胞的阳性率及肿瘤细胞胞浆中WDR1、NMI、LIN28蛋白抗体染色的强度进行判读评分，并将每种蛋白的阳性率得分和强度得分进行乘积，然后根据乘积值得到每种蛋白的表达状态值1或2，1代表低表达组，2代表高表达组；

具体为，显微镜下观察阳性染色，每个标本随即选择五个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞所占百分率：以肿瘤细胞浆内出现棕褐色颗粒为阳性，按照染色的深浅，每种蛋白的染色强度被分为四个等级：0分，阴性；1分，弱染色；2分，中度染色；3分，强染色。

WDR1阳性细胞百分数分为四级：0分，≤10％；1分，11-45％；2分，46-80％；3分，＞80％；NMI阳性细胞百分数分为四级：0分，未染色；1分，＜25％；2分，25-75％；3分，＞75％。LIN28阳性细胞百分数分为五级：0分，未染色；1分，≤20％；2分，20-50％；3分，50-90％；4分，≥90％。

每个标本的总分数是由肿瘤细胞染色强度和阳性百分数两部分得分的乘积得出，范围是WDR1，0-9；NMI，0-9；LIN28，0-12。为了方便统计，将所有病例分为表达高低两组，1代表低表达组，2代表高表达组，其cut-off值根据X-tile软件确定。WDR1：0-2为低表达组，3-9为高表达组；NMI：0-2为低表达组，3-9为高表达组；LIN28：0-8为低表达组，9-12为高表达组。

(c)根据Y＝α×A+β×B+γ×C计算每个样本的Risk值，再将每例样本Y值与通过X-tile软件确定的最佳cut-off值进行比较，将低于该值的病例判定为低危组，高于该值的病例判定为高危组，其中A、B、C分别为每例标本中WDR1、NMI和LIN28蛋白的表达状态值；α、β、γ为系数，可通过Cox回归计算得出，分别为1.587、1.557、1.177。

在计算出每例样本Y值后，再通过X-tile软件确定最佳cut-off值即4.321，那么低于该值的病例为低危组(中位生存期为22月)，高于该值的病例为高危组(中位生存期为10月)，这样分为两组后再进行单因素及多因素统计分析。

统计分析的处理软件采用SPSS18.0。各蛋白的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、侵润边界、囊性变、坏死等之间的关系使用Chi-Square检验；各蛋白的表达与患者的生存时间的关系使用Kaplan-Meier生存分析；预测影响患者预后的独立危险因素使用Cox比例风险回归模型；每种蛋白预测胶质母细胞瘤患者预后的效能使用Hazard Ratio(HR)比较；p<0.05被认为有统计学显著性。

WDR1、NMI、LIN28三种蛋白联合后的Risk值是2.290，高于他们单独评价胶质母细胞瘤患者预后时相应的Risk值(分别为1.810、1.908、1.824)，同时三个指标的联合还是独立评价胶质母细胞瘤患者预后的危险因素(p＝0.001)。

三个指标联合后得出的Kaplan-Meier生存曲线比每个指标单独评价得出的Kaplan-Meier曲线差别更明显，且χ2是最大的(χ2＝11.671)，而p值是最小的(p＝0.001)。

因此，可以认为WDR1、NMI、LIN28三种蛋白联合后评价胶质母细胞瘤患者的预后具有更高的预测价值，在指导临床治疗中具有更好的操作性和适用性。

本发明的有益保障及效果如下：

本发明的WDR1、NMI以及LIN28蛋白与脑胶质母细胞瘤相关性的发现为预测脑胶质母细胞瘤复发风险及患者术后的生存时间提供了一条全新的途径，对判断脑胶质母细胞瘤患者预后具有重要作用，能够评估患者胶质母细胞瘤术后肿瘤进展或死亡的风险级别，有助于提高胶质母细胞瘤患者术后的生存率，对于脑胶质母细胞瘤患者术后监控及序贯治疗也具有重要的指导意义。

就技术而言，本发明利用高通量组织芯片检测WDR1、NMI和LIN28蛋白在胶质母细胞瘤中的表达，该方法使得检测蛋白表达的灵敏度大大提高，能够保证在极少的样本中获得足够的信息。

本发明利用免疫组化技术、系统评分测定脑胶质母细胞瘤组织中WDR1、NMI和LIN28蛋白的表达水平，并结合术后随访信息，确定WDR1、NMI和LIN28蛋白表达水平与手术后脑胶质母细胞瘤患者预后存在相关性，WDR1、NMI和LIN28蛋白能用于制备判断脑胶质母细胞瘤患者预后的蛋白分子标记，对于脑胶质母细胞瘤的分子分型、病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

附图说明

图1是WDR1蛋白在不同表达胶质母细胞瘤患者队列的Kaplan-Meier生存曲线(χ2＝7.732，p＝0.005)。

图2是NMI蛋白在不同表达胶质母细胞瘤患者队列的Kaplan-Meier生存曲线(χ2＝5.886，p＝0.015)。

图3是LIN28蛋白在不同表达胶质母细胞瘤患者队列的Kaplan-Meier生存曲线(χ2＝5.268，p＝0.022)。

图4是WDR1、NMI及LIN28三种蛋白联合在不同表达胶质母细胞瘤患者队列的Kaplan-Meier生存曲线(χ2＝11.671，p＝0.001)。

具体实施方式

下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

在以下实施例中，脑胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织样本均来自于上海长征医院，由2名病理科医生明确诊断为胶质母细胞瘤。

发明人收集了2003-2012年期间101例的原发胶质母细胞瘤患者及16例颅脑外伤内减压患者的手术标本。全部患者来自上海长征医院神经外科，标本术后经病理证实，随访截止为2012年12月31日。下面结合附图实施作进一步详细描述。

实施例1：组织芯片制作

1、主要仪器设备

主要仪器设备包括全自动组织脱水机(莱卡ASP300)、全自动石蜡包埋机(莱卡

EG1160)、全自动石蜡切片机(莱卡RM2165)、组织芯片微阵列点样仪(上海博南生物)、全自动染色机(美康HMS740)。

2、具体步骤：

(1)选取代表性组织标本，10％中性福尔马林固定，分割标本5mm×15mm×15mm大小；

(2)使用全自动组织脱水机对组织标本脱水处理；

(3)使用石蜡包埋机将标本包埋成石蜡块；

(4)使用全自动石蜡切片机将石蜡块切片成4微米后病理组织切片；

(5)使用全自动染色剂对病理组织切片常规HE染色；

(6)芯片微陈列设计，在一个常规的载玻片上放置60个样本；

(7)根据HE切片对石蜡标本中具有代表性的点进行标记，包括典型的肿瘤和正常脑组织；

(8)TMA受体蜡块制备，利用混合莱卡石蜡及蜂蜡混合，制成空白蜡块，按10×6点组织陈列，用组织仪打孔制成TMA蜡块；

(9)在组织芯片制作机上用细针对受体蜡块打孔，孔径1～1.5mm。

(10)同样在供体蜡块上标记的相应部位打孔采集组织芯，孔径同样为1～1.5mm；

(11)将组织芯转移到受体模块的孔中，每个组织芯之间的间距以0.2mm；

(12)将构建好的TMA芯片蜡块严密固定，55℃温箱加热后室温冷却，使组织芯与受体蜡块紧密结合；

(13)修正蜡块，暴露组织，全自动组织切片机快速连续切片。4微米切片裱附在经防脱片处理的载玻片上；

(14)阵列切片置于60℃温箱烤片16小时；

(15)随机抽取芯片HE染色并复诊质检，合格后组织芯片4℃保存。

实施例2：免疫组化染色

主要试剂包括乙醇、二甲苯、H2O2、甲醇、PBS(磷酸盐缓冲液)、柠檬酸盐缓冲液、1％BSA封闭液、DAB显色剂、苏木素、辣根过氧化物酶；WDR1抗体、NMI抗体和LIN28抗体。步骤如下。

1、组织芯片使用前的准备

1)封闭在石蜡中的组织芯片在使用前置于60℃烘烤3小时，融化表面封蜡；

2)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，重复4次；

3)组织芯片置于无水乙醇中浸泡5分钟，重复2次；95％乙醇浸泡5分钟；85乙醇浸泡5分钟；70％乙醇浸泡5分钟；蒸馏水中浸泡5分钟；

2、抗原热修复

将0.01M柠檬酸盐缓冲液加热煮沸，组织芯片置于沸腾的缓冲液中，继续加热并加压5分钟，冷却至室温取出，用蒸馏水洗2次，PBS洗5分钟；

3、SP法染色

1)滴加山羊血清封闭液，室温放置10分钟；

2)甩去多余液体后滴加一抗(根据测定基因的蛋白不同，选择加不同的一抗)，在37℃持续1小时或4℃过夜(4℃过夜后需37℃复温45分钟)；

3)PBS洗5分钟，重复2次；

4)滴加生物素化二抗(根据测定基因的蛋白不同，选择不同的二抗)，孵育条件参加各自的使用说明书；

5)PBS洗5分钟，重复2次；

6)滴加HRP标记的链球菌亲和素，其孵育条件参见使用说明书；

7)PBS洗5分钟，重复2次；

8)DAB显色5-10分钟后在显微镜下掌握染色程度；

9)蒸馏水洗终止染色，苏木素染色，盐酸酒精分化；

10)脱水透明封片，镜检；

11)两位病理专家采用盲法独立读片评分；

4、免疫组化染色评分

显微镜下观察阳性染色，每个标本随即选择五个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞所占百分率：以肿瘤细胞浆内出现棕褐色颗粒为阳性，按照染色的深浅，每种蛋白的染色强度被分为四个等级：0分，阴性；1分，弱染色；2分，中度染色；3分，强染色。

WDR1阳性细胞百分数分为四级：0分，≤10％；1分，11-45％；2分，46-80％；3分，＞80％；NMI阳性细胞百分数分为四级：0分，未染色；1分，＜25％；2分，25-75％；3分，＞75％。LIN28阳性细胞百分数分为五级：0分，未染色；1分，≤20％；2分，20-50％；3分，50-90％；4分，≥90％。

每个标本的总分数是由肿瘤细胞染色强度和阳性百分数两部分得分的乘积得出，范围是WDR1，0-9；NMI，0-9；LIN28，0-12。为了方便统计，将所有病例分为表达高低两组，1代表低表达组，2代表高表达组，其cut-off值根据X-tile软件确定。WDR1：0-2为低表达组，3-9为高表达组；NMI：0-2为低表达组，3-9为高表达组；LIN28：0-8为低表达组，9-12为高表达组。

5、数据统计处理

三个指标联合判断胶质母细胞瘤患者预后的方程式如下Y＝α×A+β×B+γ×C，其中ABC分别为该例标本中WDR1、NMI和LIN28蛋白的表达状态，1代表低，2代表高；αβγ为系数，可通过Cox回归计算得出，即1.587、1.557、1.177。

在计算出每例样本Y值后再通过X-tile软件确定最佳cut-off值即4.321，那么低于该值的病例为低危组，高于该值的病例为高危组，这样分为两组后再进行单因素及多因素统计分析。

统计分析的处理软件采用SPSS18.0。各蛋白的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、侵润边界、囊性变、坏死等之间的关系使用Chi-Square检验；各蛋白的表达与患者的生存时间的关系使用Kaplan-Meier生存分析；预测影响患者预后的独立危险因素使用Cox比例风险回归模型；每种蛋白预测胶质母细胞瘤患者预后的效能使用Hazard Ratio(HR)比较；p<0.05被认为有统计学显著性。

6、结果显示

Cox风险回归模型检测各蛋白单独或联合表达后的Risk值及是否是患者预后的独立危险因素如下:

WDR1的表达状态与患者的生存时间密切相关，并且是独立的预后因子(HR＝1.810，95％CI＝1.154-2.840，p＝0.010)。

NMI的表达状态与患者的生存时间密切相关，并且是独立的预后因子(HR＝1.908，95％CI＝1.163-3.130，p＝0.011)。

LIN28的表达状态与患者的生存时间密切相关，并且是独立的预后因子(HR＝1.824，95％CI＝1.151-2.889，p＝0.010)。

但三个蛋白联合具有更强的胶质母细胞瘤患者预后预测能力，同时也是独立的预后因子(HR＝2.290，95％CI＝1.392-3.767，p＝0.001)。

综上所述，WDR1、NMI、LIN28三种蛋白联合后的Risk值是2.290，高于他们单独评价胶质母细胞瘤患者预后时相应的Risk值(分别为1.810、1.908、1.824)，同时三个指标的联合还是独立评价胶质母细胞瘤患者预后的危险因素(p＝0.001)。

三个指标联合后得出的Kaplan-Meier生存曲线比每个指标单独评价得出的Kaplan-Meier曲线差别更明显，且χ2是最大的(χ2＝11.671)，而p值是最小的(p＝0.001)。

因此，可以认为WDR1、NMI、LIN28三种蛋白联合后评价胶质母细胞瘤患者的预后具有更高的预测价值，在指导临床治疗中具有更好的操作性和适用性。

评价临床上个体胶质母细胞瘤患者的预后信息时，只需要把所得到的该患者三个蛋白表达的免疫组化分数对应的表达状态数值(1代表低表达，2代表高表达)套入公式Y＝α×A+β×B+γ×C+δ中，就可以得出Y值，然后与我们确定的cut-off值4.321比较，小于该值的患者属于低危组(中位生存期为22月)，大于该值的患者属于高危组(中位生存期为10月)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.一组联合蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述的联合蛋白为来源于脑胶质母细胞瘤的WDR1、NMI和LIN28蛋白的联合。

2.根据权利要求1所述的一组联合蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述的预后评估试剂为检测生物样品中WDR1、NMI和LIN28蛋白相对表达量的试剂的组合。

3.根据权利要求1所述的一组联合蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述的预后评估试剂盒包含了检测生物样品中WDR1、NMI和LIN28蛋白相对表达量的试剂的组合。

4.根据权利要求2或3所述的一组联合蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测生物样品中WDR1、NMI和LIN28蛋白相对表达量的试剂的组合包括与WDR1、NMI和LIN28蛋白的定量检测相配套的试剂。

5.根据权利要求4所述的一组联合蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述定量检测为免疫组化检测，免疫组化检测试剂包括二甲苯、乙醇、H₂O₂体积分数为3%的H₂O₂-甲醇液、1% BSA封闭液、柠檬酸盐缓冲液、DAB显色试剂、苏木素和辣根过氧化物酶。

6.根据权利要求2所述的一组联合蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物样品为脑胶质母细胞瘤患者手术切除的肿瘤标本切片。

7.一种脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒，该试剂盒包含了检测生物样品中WDR1、NMI和LIN28蛋白相对表达量的试剂的组合，仅能够检测WDR1、NMI和LIN28蛋白相对表达量。

8.根据权利要求7所述的脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒，其特征在于，所述的预后评估试剂盒包含了与WDR1、NMI和LIN28蛋白的定量检测相配套的试剂系统。

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