CN116445621A - 同时检测肺癌和结直肠癌的dna和rna流程引物组和试剂盒 - Google Patents

同时检测肺癌和结直肠癌的dna和rna流程引物组和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN116445621A
CN116445621A CN202310633153.9A CN202310633153A CN116445621A CN 116445621 A CN116445621 A CN 116445621A CN 202310633153 A CN202310633153 A CN 202310633153A CN 116445621 A CN116445621 A CN 116445621A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
primer
seq
primer set
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310633153.9A
Other languages
English (en)
Inventor
方婷
金瑛
王勇斯
李莉
郑立宇
潘兆东
温韵洁
张少华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Huayin Medical Examination Lab Co ltd
Guangzhou Huayin Medical Laboratory Center Co Ltd
Original Assignee
Nanjing Huayin Medical Examination Lab Co ltd
Guangzhou Huayin Medical Laboratory Center Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Huayin Medical Examination Lab Co ltd, Guangzhou Huayin Medical Laboratory Center Co Ltd filed Critical Nanjing Huayin Medical Examination Lab Co ltd
Priority to CN202310633153.9A priority Critical patent/CN116445621A/zh
Publication of CN116445621A publication Critical patent/CN116445621A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请提供了一种同时检测肺癌和结直肠癌的DNA和RNA流程引物组和试剂盒，包括314条DNA引物和110条RNA引物。所述引物组能够覆盖从CSCO指南及NCCN指南中筛选的肺癌和结直肠癌相关的24个必检基因和42个MSI基因位点，同时降低了检测的成本。

Description

同时检测肺癌和结直肠癌的DNA和RNA流程引物组和试剂盒
技术领域
本申请涉及基因检测领域，具体地，涉及一种同时检测肺癌和结直肠癌的引物组，还涉及一种同时检测肺癌和结直肠癌的试剂盒和检测方法。
背景技术
肺癌和结直肠癌均是世界范围内常见的恶性肿瘤。世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)的数据显示：2020年全球肺癌和结直肠癌的新发病例分别占总癌症新发病例数的11.4％和10％，位居第二和第三；死亡病例分别占总癌症死亡病例的18％和9.4％，位居第一和第二。在我国，肺癌和结直肠癌发病率分别位居第一(17.9％)和第二(12.2％)，死亡率分别为第一(23.8％)和第五(9.5％)。这两种恶性肿瘤已严重威胁人类的健康和生命，是人类死亡的主要病因之一。因此，对于肺癌和结直肠癌进行治疗，以提高患者的生存率和生活质量非常重要。
目前，传统的针对肺癌和结直肠癌的治疗方法，主要有手术、放疗与全身化疗。随着分子诊断技术不断发展，针对肺癌和结直肠癌的诊疗已进入靶向治疗和免疫治疗时代，并且在临床上已取得良好的效果。以肺癌为例，肺癌按组织学类型可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)，分别占85％和15％左右。在我国，大部分肺癌患者确诊时已处于中晚期，肿瘤已发生局部扩散或远处转移，丧失手术机会，5年生存率很低。目前，肺癌的一线治疗方案仍是以铂类药物为基础的联合化疗，但携带一些基因变异的部分患者对化疗药物的敏感性和耐受性不同，导致不同患者使用化疗药物的效果不一或使用超过耐受剂量的药物会造成较大的毒副作用。
高通量测序技术也称为下一代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)，可实现一次对多至上百个肿瘤相关基因、全外显子以及全基因组进行测序，获得基因变异信息。利用NGS技术对化疗相关位点进行检测，可为患者提供个体化化疗药物有效性及毒副作用预测信息。随着靶向药物的开发，近10年来，利用NGS技术对靶向基因位点进行检测，进而指导靶向治疗的诊疗模式已在临床应用上获得良好效果；对于驱动基因阴性患者，可以选择化疗或免疫治疗等；对于驱动基因阳性患者，则可选择靶向用药治疗。常见的NSCLC驱动基因如表皮生长因子受体(EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)等已有相应的分子靶向药物，它们均可延长患者疾病控制时间及总生存时间，使部分患者获益。此外，随着肿瘤免疫学的迅速发展，免疫治疗也逐渐引起重视，被认为是最有希望治愈恶性肿瘤的治疗手段；利用NGS技术对免疫治疗靶点进行检测，再利用该免疫靶点对应的免疫检查点抑制剂(如PD-1单抗或PD-L1单抗等)对患者进行免疫治疗，已被证实可改善肺癌患者的生存率。同样，结直肠癌的专家共识也推荐结直肠癌患者可采用NGS技术进行基因检测，获得化疗位点，靶向位点和免疫靶点的相关基因信息，从而获得用药指导和预后评估信息，以提高患者的5年生存率及生活质量。因此，开发一款覆盖多种用药信息，成本低，效率高的肺癌和结直肠癌基因NGS检测产品是必要的，能够为临床医生及患者提供实时、有效的靶向、免疫或化疗用药指导、预后评估等信息，使患者受益。
目前，中华医学会肺癌临床诊疗指南(即CSCO指南，2022版)推荐了NSCLC检测的必检基因，包括EGFR、ALK、ROS1、RET、BRAF V600E和MET 14外显子跳跃突变，扩展基因包括MET、HER-2、KRAS、NTRK等。此外，NCCN指南推荐转移性结直肠癌患者进行MSI检测、KRAS和BRAF等基因突变检测，RET、NTRK等融合基因检测。其中，ALK、ROS1、RET和NTRK等基因主要表现为基因重排/融合。然而，目前的大部分的NGS技术仅对以上的部分基因进行DNA层面的突变的检测，但是没有对于融合基因进行检测。RNA测序能够有效避免这些融合的漏检，包括METExon 14跳跃突变。一般市售基因检测产品针对肺癌和结直肠癌只能分开两种试剂盒和流程进行检测，但实际上肺癌和结直肠癌存着很多共同的基因需要检测，例如KRAS、BRAF、TP53等，使用两种不同的试剂流程进行建库，操作的时间长，人力成本和材料成本高。
发明内容
为了解决上述问题，有必要开发一种基于多重PCR技术，同时进行DNA和RNA建库和靶向测序的肺癌、结直肠癌基因变异的引物组、试剂盒及方法，以快速简单、低成本的完成肺癌、结直肠多基因突变的检测。
本申请提供一种引物组，包括检测EGFR、BRAF、MET、ERBB2、AKT1、APC、KRAS、MAP2K1、NRAS、PIK3CA、PTEN、POLE、RB1、TP53、DPYD、UGT1A1、PDGFRA、KIT基因突变的DNA引物组，和检测ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3基因融合及MET外显子跳跃的RNA引物组。
本申请所述的DNA引物，或称DNA流程引物，指其扩增模板是DNA；本申请所述的RNA引物，或称RNA流程引物，指其扩增模板是由RNA逆转录得到的cDNA。
作为优选，所述DNA引物组由具有SEQ ID No：1-314所示序列的引物组成。
作为进一步的优选，具有SEQ ID No：1-314所示序列的引物在所述DNA引物中的占比分别为：
(1)第一DNA引物分组，包括SEQ ID No：49、50、57、58、119、120、137、138、145、146、151、152、153、154、159、160、305、306所示的引物，每条引物占比为0.138％；
(2)第二DNA引物分组，包括SEQ ID No：39、40、43、44、111、112、113、114、117、118、121、122、133、134、139、140、141、142、155、156、173、174、181、182、183、184、187、188、189、190、195、196、301、302、303、304所示的引物，每条引物占比为0.207％；
(3)第三DNA引物分组，包括SEQ ID No：19、20、21、22、23、24、25、26、31、32、35、36、41、42、47、48、51、52、53、54、55、56、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、89、90、91、92、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、125、126、143、144、147、148、149、150、157、158、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、175、176、177、178、191、192、199、200、203、204、235、236、239、240、243、244、283、284、285、286、307、308、309、310、311、312、313、314所示的引物，每条引物占比为0.276％；
(4)第四DNA引物分组，包括SEQ ID No：3、4、7、8、13、14、15、16、17、18、27、28、33、34、37、38、45、46、61、62、63、64、81、82、83、84、87、88、95、96、97、98、99、100、115、116、123、124、127、128、129、130、131、132、135、136、171、172、179、180、185、186、197、198、201、202、207、208、209、210、211、212、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、241、242、247、248、263、264、265、266、267、268、269、270、273、274、277、278、281、282、287、288、289、290、291、292、295、296、299、300所示的引物，每条引物占比为0.345％；
(5)第五DNA引物分组，包括SEQ ID No：1、2、5、6、29、30、67、68、193、194、231、232、233、234、237、238、251、252、255、256、257、258、297、298所示的引物，其中每对引物占比为0.414％；
(6)第六DNA引物分组，包括SEQ ID No：9、10、11、12、59、60、65、66、85、86、93、94、205、206、213、214、215、216、217、218、245、246、249、250、253、254、259、260、261、262、271、272、275、276、279、280、293、294所示的引物，每条引物占比为0.483％。
作为优选，所述RNA引物组由具有SEQ ID No：315-424所示序列的引物组成。
作为进一步的优选，SEQ ID No：315-424所示的每种引物在所述RNA引物组中的占比为0.909％。
作为另一种优选的实施方式，所述SEQ ID No编号为奇数的DNA引物，和SEQ ID No为315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、356、358、360、362、363、364、366、368、369、370、371、373、375、376、378、380、381、383、384、386、387、389、391、392、395、396、397、398、399、401、402、403、404、406、407、408、410、411、413、415、416、421、422、423的RNA引物，还具有SEQ ID No：425所示的接头；SEQ ID No编号为偶数的DNA引物，和SEQ ID No为316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、357、359、361、365、367、372、374、377、379、382、385、388、390、393、394、400、405、409、412、414、417、418、419、420、424的RNA引物，还具有SEQ ID No：426所示的接头。
本领域技术人员容易理解的是，SEQ ID No编号为奇数的DNA引物，即编号为1、3、5、7、9……313的157条DNA引物，SEQ ID No编号为偶数的则是编号为2、4、6、8、10……314的157条DNA引物。
本申请还提供一种试剂盒，包括权利要求1-6任一项所述的引物组。
作为一种变形的实施方式，所述试剂盒中，还包括逆转录试剂、扩增试剂和纯化试剂。由于逆转录试剂、扩增试剂和纯化试剂是本领域的现有技术，已有多种市售试剂，选择何种试剂对实施本申请的技术方案没有实质性影响，本申请中不再详细限定其组成和含量。
本申请还提供一种检测肺癌和/或结肠癌基因突变的方法，利用本申请所述的引物组或试剂盒，对待测样本通过NGS法测序。
作为优选的一种检测肺癌和/或结肠癌基因突变的方法，针对所述待测样本，同时提取DNA和RNA，分离所提取的DNA和RNA后，对分离得到的DNA和RNA分别建库和测序。
本申请中的HER2基因，也称为ERBB2基因，二者具有相同的含义。
本申请中的试剂，如无特别说明，均采用市售试剂。
本申请克服了多重PCR法建库中存在的均一性低、产生较多非特异性扩增等缺陷，可在提取同一样本的DNA和RNA的基础上，使用统一试剂盒和流程分别进行DNA和RNA水平的建库，并一同上机测序，同时获得肺癌和结直肠癌的基因突变和基因融合的测序信息及用药指导信息。
具体实施方式
为了更好地理解本申请，将对本申请的技术方案做出更详细的说明。应理解，这些详细说明只是对本申请的示例性实施方式的描述，而非旨在以任何方式限制本申请的范围。在说明书全文中，表述“和/或”包括相关联的所列项目中的一个或多个项目的任何组合或全部组合。
应注意，在本说明书中，“第一”“第二”“第三”等表述仅用于将一个特征与另一个特征区分开来，而不表示对特征的任何限制。因此，在不背离本申请的教导的情况下，下文中讨论的第一DNA引物分组也可被称作第二DNA引物分组。反之亦然。
如在本文中使用的，用语“大致”“大约”以及类似的用语用作表近似的用语，而不用作表程度的用语，并且旨在说明将由本领域普通技术人员认识到的测量值或计算值中的固有偏差。
还应理解的是，诸如“包括”“包括有”“具有”“包含”和/或“包含有”等表述在本说明书中是开放性而非封闭性的表述，其表示存在所陈述的特征、元件和/或部件，但不排除一个或多个其它特征、元件、部件和/或它们的组合的存在。此外，当诸如“...中的至少一个”的表述出现在所列特征的列表之后时，其修饰整列特征，而非仅仅修饰列表中的单个特征。此外，当描述本申请的实施方式时，使用“可”表示“本申请的一个或多个实施方式”。并且，措辞“示例性的”旨在指代示例或举例说明。
除非另外限定，否则本文中使用的所有措辞(包括工程术语和科技术语)均具有与本申请所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。还应理解的是，除非本申请中有明确的说明，否则在常用词典中定义的词语应被解释为具有与它们在相关技术的上下文中的含义一致的含义，而不应以理想化或过于形式化的意义解释。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施方式及实施例中的特征可以相互组合。另外，除非明确限定或与上下文相矛盾，否则本申请所记载的方法中包含的具体步骤不必限于所记载的顺序，而可以任意顺序执行或并行地执行。下面将结合实施方式来详细说明本申请。
实施例1，引物设计。
根据《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南(2021版)》《结直肠癌分子检测高通量测序中国专家共识(2021年)》等指南和专家共识，本申请包含了肺癌和结直肠癌必检基因和扩展基因24个：EGFR、ALK、ROS1、RET、BRAF、MET、HER-2(ERBB2)、NTRK1、NTRK2、NTRK3、AKT1、APC、KRAS、MAP2K1、NRAS、PIK3CA、PTEN、POLE、RB1、TP53、DPYD、UGT1A1、PDGFRA、KIT。其中，除DPYD和UGT1A1基因检测主要用于化疗用药指导外，其余基因检测主要用于靶向用药及预后指导。此外，Panel还包括结直肠癌必检生物标志物MSI的42个位点，用于免疫治疗指导。根据以上推荐基因和生物标志物，自设引物，根据扩增效果确定引物，并确定每对引物在panel中相应的占比。
本专利的引物panel分为DNA panel和RNA panel。其中，DNA panel包含引物314条，主要用于基因突变和MSI位点的检测；RNA panel包含引物110条，主要用于基因重排/融合突变的检测。并且，根据自设引物的扩增效果，对部分扩增效率不佳或过强的引物，调整引物对在引物panel中的比例，保证每个位点的检测效果。
本申请各引物比例及序列如下，引物位点相同的正向和反向引物称为一对引物，例如SEQ ID NO：1和2的引物即为一对引物。
表1DNA panel引物组合(序号对应SEQ ID No)
表2RNA panel引物组合(序号对应SEQ ID No)
所述SEQ ID No编号为奇数的DNA引物，和SEQ ID No为315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、356、358、360、362、363、364、366、368、369、370、371、373、375、376、378、380、381、383、384、386、387、389、391、392、395、396、397、398、399、401、402、403、404、406、407、408、410、411、413、415、416、421、422、423的RNA引物，还具有SEQ ID No：425所示的接头；SEQ ID No编号为偶数的DNA引物，和SEQ ID No为316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、357、359、361、365、367、372、374、377、379、382、385、388、390、393、394、400、405、409、412、414、417、418、419、420、424的RNA引物，还具有SEQ ID No：426所示的接头。
实施例2，制备试剂盒。
制备试剂盒，包括实施例1所述的DNA引物组，实施例1所述的RNA引物组；包括逆转录试剂、扩增试剂和纯化试剂。
其中逆转录试剂包括：逆转录酶、10×逆转录缓冲液、随机引物、无核酸酶水。扩增试剂包括：5×多重PCR反应酶混合液、引物Panel(Rpool#8)、引物Panel(Xpool#29)、无核酸酶水，高保真通用扩增酶反应液、PCR接头引物；纯化试剂包括：纯化磁珠、80％乙醇、无核酸酶水。
实施例3，使用实施例1的引物组测序。
本实施例的实验材料来自某医院收治并经病理验证的3名肺癌和5名结直肠癌患者的FFPE样本，这些样本已通过NGS检测获得了检出结果。对同一患者的材料同时提取DNA和RNA，分别使用本申请的DNA panel和RNA panel，即实施例1所述的DNA引物和RNA引物，完成文库构建及上机测序。
1.核酸提取
1.1按照送检要求将石蜡包埋组织样本切成厚度为3-8μm切片，用干净干燥的镊子将切好的蜡卷转移至1.5mL离心管中。若是切片样本，则使用专用刀片刮取组织，并转移至1.5mL离心管中。标记对应的样本编号，并将装有样本的1.5mL离心管瞬时离心。
1.2加入1mL脱蜡液，涡旋混匀，瞬时离心，确定样本浸泡到脱蜡液中。
1.3将离心管涡旋混匀5s，置于干式恒温器中，56℃孵育5min，待石蜡溶解。
1.4孵育完成后取出离心管，12000×g离心1min。小心吸弃上清液，注意不要吸到沉淀，可使用小量程移液器吸弃残液。
1.5重复1.2-1.4脱蜡步骤一次。
1.6加入1mL无水乙醇，涡旋混匀，12000×g离心1min。小心彻底吸弃上清液，不要吸到沉淀，可使用小量程移液器吸弃残液。
1.7将样本置于干式恒温器中56℃孵育，打开离心管盖。使用小量程移液器吸弃残液，并用枪头将组织移至离心管侧壁上方，距离管口1/3位置，直至组织样本呈干燥状态。
1.8加入550μL消化缓冲液和50μL蛋白酶K至样本管中，涡旋10s重悬样本。
1.9将重悬样本置于恒温混匀仪上，设置程序56℃，1200rpm，振荡孵育1h后，查看组织消化程度，若发现组织有成团状未消化完全，则延长消化时间0.5h。然后将恒温混匀仪升至90℃，再将样本放置在样本孔中，静置孵育1h。注：90℃孵育温度较高，不可延长，否则会损伤核酸。
1.10孵育完成后的样本常温放置，降至室温后，12000×g离心1min。
1.11将DNA吸附柱置于2mL离心管中，转移上清液至DNA吸附柱中，12000×g离心30s，获得滤液。
1.12将DNA吸附柱转移至新的收集管中，用于后续DNA提取。
DNA提取：在1.12步骤后进行以下步骤：
1.13向步骤1.12的DNA吸附柱中加入600μL75％乙醇，15000×g离心30s。
1.14倒弃含滤液收集管，向DNA吸附柱中加入600μL75％乙醇，15000×g离心30s。
1.15倒弃含滤液收集管，将柱子装回新收集管中，15000×g离心2min。
1.16取出柱子，装在对应的干净的1.5mL离心管中，室温晾干5min。
1.17加入38μL NF水至柱子的膜中央，室温静置5min，15000×g离心2min。
1.18将洗脱下来的液体转至吸附柱的膜中央进行二次洗脱，室温静置5min，15000×g离心2min。
1.19核对样本编号后丢弃吸附柱，获得DNA样本。将DNA保存于-20℃或-80℃。
RNA提取：在1.12步骤后进行以下步骤：
1.20向步骤1.11的滤液中加入1.5倍体积(900μL)无水乙醇，涡旋混匀15s。
1.21转移一半体积的混合液至RNA吸附柱中，12000×g离心30s。重复该操作，直至将混合液过完柱为止。
1.22倒弃收集管中得滤液，向RNA吸附柱中加入600μL75％乙醇，15000×g离心30s。
1.23重复步骤1.22。
1.24倒弃收集管中得滤液，将RNA吸附柱装到新收集管中，15000×g离心2min。
1.25取出RNA吸附柱，装在对应的干净的1.5mL离心管中，室温晾干5min。
1.26加入38μL无核酸酶水至柱子的膜中央，室温静置5min，15000×g离心2min。
1.27将洗脱下来的液体转至吸附柱的膜中央进行二次洗脱，室温静置5min，15000×g离心2min。
1.28核对样本编号后丢弃吸附柱，获得RNA样本。将RNA短期保存于-20℃，长期保存于-80℃。
2.DNA为模板的文库制备
2.1以DNA为模板的一轮PCR扩增反应
2.1.1在灭菌的PCR管中配置DNA模板第一轮PCR扩增反应体系：
表3DNA模板第一轮PCR扩增反应体系
2.1.2将配好的反应体系涡旋混匀，短暂离心，去除体系内气泡，进行以下PCR反应程序(热盖温度：105℃)：
表4cDNA第一轮PCR扩增的PCR程序
2.1.3在PCR程序结束后，将反应产物取出，短暂离心2s，并进行下一步纯化。
2.2DNA第一轮PCR产物纯化
2.2.1在新离心管中，每管中分装60μL(1.2X)VAHTS DNA Clean Beads(磁珠)和25μL ddH2O。
2.2.2将第一轮PCR产物转移至2.2.1步骤中的离心管中，涡旋混匀后，室温静置5min。
2.2.3将离心管短暂离心后，置于磁力架上，溶液完全澄清后，用移液器小心吸取上清并且丢弃。
2.2.4每管加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s后，在磁力架上小心移除上清液。
2.2.5重复步骤2.2.4步骤一次。
2.2.6将离心管短暂离心后，置于磁力架上，用10μL枪头吸弃残余乙醇，室温下开盖将磁珠晾干，勿过度干燥。
2.2.7将离心管从磁力架中取出，每管加入22μL无核酸酶水，涡旋混匀。
2.2.8短暂离心后，将离心管置于磁力架上，室温静置至液体澄清，用移液器将20μL上清液小心转移到新的0.2mL PCR管中。
2.3第二轮PCR扩增
2.3.1在2.3.8步骤中的PCR管中配置以下反应体系：
表5第二轮PCR扩增反应体系
2.3.2将配好的反应体系涡旋混匀，短暂离心，去除体系中的气泡，进行以下PCR反应程序(热盖温度：105℃)：
表6第二轮PCR扩增的PCR程序
2.3.3在PCR程序结束后，将PCR管取出，短暂离心，并进行下一步纯化。
2.4第二轮PCR产物纯化
2.4.1在新离心管中，每管加入45μL(0.9X)VAHTS DNA Clean Beads(磁珠)和第二轮PCR产物，涡旋混匀后，室温静置5min。
2.4.2将短暂离心后的离心管，置于磁力架上至溶液完全澄清，用移液器小心移除上清液。
2.4.3每管加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温孵育30s后，在磁力架上小心移除上清液。
2.4.4重复步骤2.4.3步骤一次。
2.4.5将离心管短暂离心后，置于磁力架上，用10μL枪头移除残余乙醇，室温下开盖将磁珠晾干，勿过度干燥。
2.4.6将PCR管从磁力架中取出，每管加入30μL无核酸酶水，涡旋混匀。
2.4.7短暂离心后，将离心管置于磁力架上，室温静置至液体澄清，用移液器将28μL上清液转移到新EP管中，为终文库。
2.5NGS上机测序
2.5.1将用DNA panel构建的5例终文库进行NGS测序，分析突变检出结果。
2.5.2检测结果：
表7 3名肺癌患者基因突变检出结果
样本编号 突变位点 预期突变频率 实际突变频率 符合率
DXP-0325-1 EGFR p.L858R 14.58％ 17.49％ 100％
DXP-0325-2 KRAS p.G12A 21.28％ 21.25％ 100％
DXP-0325-3 / / / 100％
表8 5名结直肠癌患者基因突变及MSI检出结果
3.RNA为模板的文库制备
3.1cDNA的制备
3.1.1在灭菌的PCR管中配置RNA预变性反应体系：
表9RNA预变性反应体系
3.1.2将配好的反应体系涡旋混匀，去除体系内的气泡，短暂离心，然后进行以下预变性程序(热盖温度：80℃)：
表10RNA预变性的PCR程序
3.1.365℃反应5分钟后，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。
3.1.4在灭菌的PCR管中配置cDNA第一链的合成反应体系：
表11cDNA第一链合成反应体系
3.1.5将配好的反应体系涡旋混匀，去除体系内的气泡，短暂离心，然后进行以下逆转录程序(热盖温度：105℃)：
表12逆转录合成cDNA第一链的PCR程序
3.2以cDNA为模板的一轮PCR扩增反应
3.2.1在灭菌的PCR管中配置cDNA模板第一轮PCR扩增反应体系：
表13cDNA模板第一轮PCR扩增反应体系
3.2.2将配好的反应体系涡旋混匀，短暂离心，去除体系内气泡，进行以下PCR反应程序(热盖温度：105℃)：
表14cDNA第一轮PCR扩增的PCR程序
3.2.3在PCR程序结束后，将反应产物取出，短暂离心2s，并进行下一步纯化。
3.3cDNA第一轮PCR产物纯化
3.3.1在新离心管中，每管中分装60μL(1.2X)VAHTS DNA Clean Beads(磁珠)和20μL ddH2O。
3.3.2将第一轮PCR产物转移至3.3.1步骤中的离心管中，涡旋混匀后，室温静置5min。
3.3.3将离心管短暂离心后，放置在磁力架上，至溶液完全澄清后，用移液器小心吸取上清并且丢弃。
3.3.4每管加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温孵育30s后，在磁力架上小心移除上清液。
3.3.5重复步骤3.3.4步骤一次。
3.3.6将离心管短暂离心后，置于磁力架上，用10μL枪头小心吸尽残余乙醇，室温下开盖将磁珠晾干，勿过度干燥。
3.3.7将PCR管从磁力架中取出，每管加入22μL无核酸酶水，涡旋振荡混匀。
3.3.8短暂离心后，将离心管置于磁力架上，室温静置至液体澄清，用移液器将20μL上清液小心转移到新的0.2mL PCR管中。
3.4第二轮PCR扩增
3.4.1在3.3.8步骤中的PCR管中配置以下反应体系：
表15第二轮PCR扩增反应体系
3.4.2将配好的反应体系涡旋混匀，短暂离心，去除体系中的气泡，进行以下PCR反应程序(热盖温度：105℃)：
表16第二轮PCR扩增的PCR程序
3.4.3在PCR程序结束后，将PCR管取出，短暂离心，并进行下一步纯化。
3.5第二轮PCR产物纯化
3.5.1在新离心管中，每管加入45μL(0.9X)VAHTS DNA Clean Beads(磁珠)和3.4.3步骤中的PCR产物，涡旋混匀后，室温静置5min。
3.3.3将离心管短暂离心后，放置在磁力架上，至溶液完全澄清后，用移液器小心吸取上清并且丢弃。
3.3.4每管加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温孵育30s后，在磁力架上小心移除上清液。
3.3.5重复步骤3.3.4步骤一次。
3.3.6将离心管短暂离心后，置于磁力架上，用10μL枪头小心吸尽残余乙醇，室温下开盖将磁珠晾干，勿过度干燥。
3.3.7将PCR管从磁力架中取出，每管加入30μL无核酸酶水，涡旋振荡混匀。
3.3.8短暂离心后，将离心管置于磁力架上，室温静置至液体澄清，用移液器将28μL上清液转移到新EP管中，为终文库。
3.4NGS上机测序
3.4.1将用RNA panel构建的3例终文库进行NGS测序，分析融合检出结果。
3.4.2检测结果：
表17RNA panel测试结果
本申请相比现有技术具有显著的进步，部分优选的技术方案具有更好的技术效果，所述技术效果和实验数据展示如下。
1.本申请可适用于多种样本类型的检测，包括人的外周血、FFPE样本的DNA和RNA建库，从而适用于不能获取实体瘤而只能获取外周血的患者；
表18不同样本类型建库测试结果
2.自设引物，并根据自设引物的扩增效果及自连反应，更换扩增效率不好或者有自连的引物。并且调整DNA panel引物比例前后的测序均一性测试结果：引物比例调整后panel中引物分为6个pool，其中pool#1中的每对引物在panel中的占比为0.28％，pool#2中的每对引物在panel中占比为0.41％，pool#3中的每对引物在panel中的占比为0.55％，pool#4中的每对引物在panel中的占比为0.69％，pool#5中的每对引物在panel中的占比为0.83％，pool#6中的每对引物在panel中的占比为0.97％；表19为使用引物比例调整后的panel进行建库的测序质控数据，表20，表21为引物比例调整前后，部分生信质控的对比结果。
表19最终确认的引物panel的建库结果
表20引物比例调整前后测序均一性结果
样本编号 调整前文库均一性 调整后文库均一性
T0414-1 39.88％ 83.17％
T0414-2 61.27％ 87.13％
T0414-3 43.93％ 82.18％
T0414-4 42.20％ 85.15％
T0414-5 44.51％ 77.23％
表21部分引物对调整前后测试结果
3.针对同一样本，本试剂盒使用DNA和RNA共提取的方法，节省样本使用量，适用于双流程建库。
以FFPE样本为例，对比市面上产品与本产品的所需样本量、提取时间和成本。
表22检测成本对比表。
4.对比分开提取DNA和RNA的产品，本申请中对同一样本同时提取DNA和RNA的方法，在样本量上，减少了1/2的样本需求量；在提取时间上，缩短了41.7％的提取时间；在成本上，减少了3/4的提取试剂开销。
把肺癌和结直肠癌合成一个检测试剂盒，并且同时进行DNA和RNA双流程的建库方法，使得不仅突变基因能被检出(DNA建库流程)，融合基因也能被检出(RNA建库流程)。
表23对已有病理结果和NGS结果的肺癌和结直肠癌样本的测试结果
注：其中，肺癌结果为DNA和RNA双流程检测，结直肠癌结果为DNA流程检测，覆盖MSI位点。
5.把肺癌和结直肠癌合并，开发出一套统一的试剂盒和流程，同时建库可以节省人力成本。以下表格为分别使用3例肺癌和3例结直肠癌样本进行建库，在人力成本上的对比。
表24人力成本对比表。
在人力成本上，与肺癌和结直肠癌样本分开不同试剂盒流程进行建库对比，本申请中的肺癌和结直肠癌合并流程所耗费的人力成本可减少1/2。
以上描述仅为本申请的实施方式以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的保护范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述技术构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims (10)

1.一种引物组，其特征在于，包括检测EGFR、BRAF、MET、ERBB2、AKT1、APC、KRAS、MAP2K1、NRAS、PIK3CA、PTEN、POLE、RB1、TP53、DPYD、UGT1A1、PDGFRA、KIT基因突变的DNA引物组，和检测ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3基因融合及MET外显子跳跃的RNA引物组。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述DNA引物组由具有SEQ ID No：1-314所示序列的引物组成。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，具有SEQ ID No：1-314所示序列的引物在所述DNA引物中的占比分别为：
(1)第一DNA引物分组，包括SEQ ID No：49、50、57、58、119、120、137、138、145、146、151、152、153、154、159、160、305、306所示的引物，每条引物占比为0.138％；
(2)第二DNA引物分组，包括SEQ ID No：39、40、43、44、111、112、113、114、117、118、121、122、133、134、139、140、141、142、155、156、173、174、181、182、183、184、187、188、189、190、195、196、301、302、303、304所示的引物，每条引物占比为0.207％；
(3)第三DNA引物分组，包括SEQ ID No：19、20、21、22、23、24、25、26、31、32、35、36、41、42、47、48、51、52、53、54、55、56、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、89、90、91、92、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、125、126、143、144、147、148、149、150、157、158、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、175、176、177、178、191、192、199、200、203、204、235、236、239、240、243、244、283、284、285、286、307、308、309、310、311、312、313、314所示的引物，每条引物占比为0.276％；
(4)第四DNA引物分组，包括SEQ ID No：3、4、7、8、13、14、15、16、17、18、27、28、33、34、37、38、45、46、61、62、63、64、81、82、83、84、87、88、95、96、97、98、99、100、115、116、123、124、127、128、129、130、131、132、135、136、171、172、179、180、185、186、197、198、201、202、207、208、209、210、211、212、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、241、242、247、248、263、264、265、266、267、268、269、270、273、274、277、278、281、282、287、288、289、290、291、292、295、296、299、300所示的引物，每条引物占比为0.345％；
(5)第五DNA引物分组，包括SEQ ID No：1、2、5、6、29、30、67、68、193、194、231、232、233、234、237、238、251、252、255、256、257、258、297、298所示的引物，其中每对引物占比为0.414％；
(6)第六DNA引物分组，包括SEQ ID No：9、10、11、12、59、60、65、66、85、86、93、94、205、206、213、214、215、216、217、218、245、246、249、250、253、254、259、260、261、262、271、272、275、276、279、280、293、294所示的引物，每条引物占比为0.483％。
4.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述RNA引物组由具有SEQ ID No：315-424所示序列的引物组成。
5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，SEQ ID No：315-424所示的每种引物在所述RNA引物组中的占比为0.909％。
6.根据权利要求2-5任一项所述的引物组，其特征在于，所述SEQ ID No编号为奇数的DNA引物，和SEQ ID No为315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、356、358、360、362、363、364、366、368、369、370、371、373、375、376、378、380、381、383、384、386、387、389、391、392、395、396、397、398、399、401、402、403、404、406、407、408、410、411、413、415、416、421、422、423的RNA引物，还具有SEQ ID No：425所示的接头；SEQ ID No编号为偶数的DNA引物，和SEQ ID No为316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、357、359、361、365、367、372、374、377、379、382、385、388、390、393、394、400、405、409、412、414、417、418、419、420、424的RNA引物，还具有SEQ ID No：426所示的接头。
7.一种试剂盒，包括权利要求1-6任一项所述的引物组。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括逆转录试剂、扩增试剂和纯化试剂。
9.一种检测肺癌和/或结肠癌基因突变的方法，其特征在于，利用权利要求1-6任一项所述的引物组或权利要求7-8任一项所述的试剂盒，对待测样本通过NGS法测序。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，针对所述待测样本，同时提取DNA和RNA，分离所提取的DNA和RNA后，对分离得到的DNA和RNA分别建库和测序。
CN202310633153.9A 2023-05-30 2023-05-30 同时检测肺癌和结直肠癌的dna和rna流程引物组和试剂盒 Pending CN116445621A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310633153.9A CN116445621A (zh) 2023-05-30 2023-05-30 同时检测肺癌和结直肠癌的dna和rna流程引物组和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310633153.9A CN116445621A (zh) 2023-05-30 2023-05-30 同时检测肺癌和结直肠癌的dna和rna流程引物组和试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116445621A true CN116445621A (zh) 2023-07-18

Family

ID=87134032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310633153.9A Pending CN116445621A (zh) 2023-05-30 2023-05-30 同时检测肺癌和结直肠癌的dna和rna流程引物组和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116445621A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117844933A (zh) * 2024-03-07 2024-04-09 上海复迪生生命科学有限公司 一种肺部肿瘤相关基因变异检测用的多重pcr引物组及其用途

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117844933A (zh) * 2024-03-07 2024-04-09 上海复迪生生命科学有限公司 一种肺部肿瘤相关基因变异检测用的多重pcr引物组及其用途
CN117844933B (zh) * 2024-03-07 2024-06-11 上海复迪生生命科学有限公司 一种肺部肿瘤相关基因变异检测用的多重pcr引物组及其用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7189401B2 (ja) インサイチュ増幅により無細胞核酸分子を調製する方法
CN106591438B (zh) 一种用于检测Her2基因的核酸组合、试剂盒及应用
EP3286334A1 (en) Method to increase sensitivity of next generation sequencing
CN108473975A (zh) 检测肿瘤发展的系统和方法
Marczyk et al. The impact of RNA extraction method on accurate RNA sequencing from formalin-fixed paraffin-embedded tissues
CN1420927A (zh) 用于从福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品中分离rna的方法
CN106148498B (zh) Kras基因突变检测试剂盒及其应用
CN106939337B (zh) 激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法
CN106498082B (zh) 卵巢癌易感基因变异文库构建方法
JP2002523061A (ja) 腫瘍マーカーとしての微細なミトコンドリア突然変異
CN111748628B (zh) 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒
CN111424087A (zh) 基于二代测序的用于泛癌种检测或靶向用药的检测Panel、试剂盒及应用
CN116445621A (zh) 同时检测肺癌和结直肠癌的dna和rna流程引物组和试剂盒
CN112251515B (zh) 一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的引物及试剂盒
Marczyk et al. Assessment of stained direct cytology smears of breast cancer for whole transcriptome and targeted messenger RNA sequencing
WO2022100766A1 (zh) 人微卫星不稳定位点的检测方法及其应用
CN112831558B (zh) 克罗恩病易感基因的早筛方法及试剂盒
KR102353064B1 (ko) Her2 복제수 변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트
CN116397027B (zh) 联合检测kras/nras/braf基因分型的复合扩增体系及试剂盒
CN112708664B (zh) 肺癌驱动基因的多基因突变测序文库构建方法与试剂盒
CN116179702A (zh) 一种检测结直肠癌的引物组合物、试剂盒和方法
CN116463404A (zh) 一种基于单点降噪结合微滴式数字pcr的检测方法
CN112553339A (zh) 伊立替康个体化用药基因的指导方法及试剂盒
CN116200461A (zh) 用于同时检测脑肿瘤多种基因变异类型的文库构建方法及其所用组合物与应用
KR101778789B1 (ko) 순환 종양 세포를 이용한 암 환자의 2차 치료용 치료제 반응성 진단 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination