CN116463404A - 一种基于单点降噪结合微滴式数字pcr的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法。该方法包括以下步骤:使生物样本中的DNA单链化,然后使单链化的DNA与探针组结合,控制温度使探针组中的各探针与单链化DNA的对应序列形成双链结构;向含双链结构的溶液中加入双链特异性酶;富集得到的DNA;利用微液滴生成装置将富集的DNA溶液进行微滴化,从而形成多个微液滴,利用温控装置对所述多个微液滴进行核酸扩增,并利用检测装置检测多个微液滴的信号变化。本发明的检测方法适配性好,且无需新的适配的流程开发。同时本发明的方法在10ng的起始量的情况下依然可以稳定的对突变型DNA有10‑60倍的富集,从而对cfDNA样本进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域,具体地涉及一种基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法。
背景技术
在癌症液体活检的临床样本中,DNA的改变为疾病的诊断和治疗提供了重要线索。如何灵敏的、准确的检出这些突变型DNA序列,在生物学、生物技术和医学的几个领域构成了持续的技术挑战。
目前存在下述问题:
1.发生改变的突变型DNA序列,通常存在于正常野生型DNA中,且突变型DNA丰度普遍较低,尤其是在血液循环肿瘤DNA中,95%以上的cfDNA来源于正常的白细胞,从几千条序列中,寻找几十个突变的序列,灵敏度是难以保证的。
2.在实验过程中,需要进行多轮的PCR,PCR聚合酶的错误合成,会引入低频的、假的突变型DNA序列,与真实的低频突变难以区分。
3.现有方法有的是使用序列特异性的酶去进行野生型片段的去除,但由于这种酶只特异性的识别某些序列特征,导致它们的应用范围是受限的。
在癌症ctDNA的液体活检样品基因检测中存在的低频突变,包含了诊断或者治疗的线索,如何避免背景噪音频率会影响这些重要标志物的有效检出,并开发一种有效的实验方法将这些低频突变更加灵敏的、准确的检测出来,是现在液体活检基因检测越来越迫切的需求。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题,发明人进行了深入研究,提出一种基因目标位点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法。具体地,本发明包括以下内容。
本发明提供一种基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其包括以下步骤:
(1)使生物样本中的DNA单链化,然后使单链化的DNA与降噪探针组结合,控制温度使降噪探针组中的各探针与单链化DNA的对应序列形成双链结构;其中,所述探针组中各探针设计为能够与目标区域完全互补,且所述探针组中的各探针具有第一温度的Tm值;
(2)向含双链结构的溶液中加入双链特异性酶并保持在第二温度进行反应,其中所述第二温度不高于所述第一温度;
(3)富集步骤(2)得到的DNA;
(4)利用微液滴生成装置将富集的DNA溶液进行微滴化,从而形成多个微液滴,利用温控装置对所述多个微液滴进行核酸扩增,并利用检测装置检测所述多个微液滴的信号变化。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其中,所述探针组中各探针长度为10-25个碱基。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其中,所述第一温度为56℃-60℃,优选56℃±2℃。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其中,所述探针组中各探针GC含量为60-80%。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其中,所述富集包括:在同一PCR反应体系中加入两对以上的不同引物,扩增DNA的核酸片段,其中所述引物Tm值为57-62℃。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其中,扩增循环数为18-24个循环。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其中,所述单点降噪中目标区域包括下述基因中的至少一种:AKT1、DHFR、IDH2、PDGFRA、ESR1、ALK、DPYD、KIT、PIK3CA、NTRK1、BRAF、EGFR、KRAS、ROS1、NTRK3、CDA、ERBB2、MAP2K1、RRM1、TERT、CYP19A1、ERCC1、MDR1(ABCB1)、SMAD4、UGT1A1*28、CYP2C19、ERCC2、MET、SMO、SLC19A1、CYP2C8、GSTP1、MTHFR、TP53、GGH、CYP2C9、HER2、NOTCH1、TSC1、CYP2D6、HRAS、NQO1、UGT1A1、CYP3A4、IDH1、NRAS和XRCC1。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其中,单个探针的浓度为20-180nM,所述探针组的总浓度为0.5-2μM。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其中,步骤(4)包括:
a.根据待检测的突变构建数字微滴PCR体系;
b.生成包含a中所述体系的微滴并进行扩增;
c.统计拷贝数并计算突变频率。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其中,所述探针的序列包括SEQ ID No.:1-6所示的序列,所述引物序列包括SEQ IDNo.:7-12所示的序列。
本发明因此还提供一种探针组合,其包括SEQ ID No.:1-6所示序列的探针。
本发明进一步提供一种用于突变检测或分型的试剂盒,其包括本发明SEQ IDNo.:1-6所示的探针组合和/或SEQ ID No.:7-12所示的引物,以及双链特异性酶。
在液体活检样品的基因检测中,野生型DNA对于突变型DNA来说,会影突变响检出灵敏度和准确性,真实的信号会淹没在大量背景噪音中。本发明采用了双链特异性酶(DSN酶)去处理原始DNA样本,这种酶会特异性的切割完全互补的短双链DNA,而对有变异无法完全配对的序列没有或很低的切割活性。根据这种特性,本发明针对特异的位点设计了和野生型DNA序列完全互补的探针,探针长度在25bp左右,在进行变性退火后,DSN酶会优先的去切割与探针完全互补的野生型DNA序列,而突变型DNA序列由于与探针不完全互补,同时丰度较低复性速度较慢,而不被DSN酶切割,进而被相对完整的保留了下来。根据实际实验结果,本发明对不同的设计目标基因位点检测,结果表明突变型都得到了不同程度的富集。
此外,本发明对探针的设计以及投入量进行摸索,最终发现在10ng DNA起始量的情况下,设计了探针的突变位点突变频率比富集前提高了10-60倍,相比未设计探针的突变位点突变频率没有明显变化。因此,本发明的方法尤其适合于肿瘤cfDNA中低频ctDNA突变的检测。
本发明的技术效果包括:
(1)适配性好:由于是对原始样本的DNA进行探针杂交+双链特异性酶处理,所以不影响后续的成熟的实验流程,无需新的适配的流程开发;
(2)样本起始量低:本发明对起始的样本量进行了摸索,发现该方法在10ng的起始量的情况下依然可以稳定的对突变型DNA有10-60倍的富集,从而对cfDNA样本进行检测;
(3)降噪探针设计:考虑到双链特异性酶的特性是对于完全互补的、较短的双链DNA是切割效率比较高的,因此本发明设计的探针较短(25nt左右)。同时为了防止探针的3’端进行延伸,本发明在3’端进行了磷酸化,可以阻止碱基的结合,进而阻止延伸;
(4)探针的投入量:探针的投入量过少野生型DNA去除效果差,探针投入量过多不仅野生型会大量被切割,突变型DNA也会被少量的切割,所以合适的探针投入量是本发明需要确定的,在低样本起始量,如10ng DNA投入的情况下,单条探针的工作浓度在20-180nM之间,总探针的工作浓度在0.5-2μM之间,是优选的探针投入量。
(5)降噪处理后的预扩增:本发明对比了不进行预扩增直接用DSN处理后产物进行ddPCR,和预扩增后再ddPCR的结果,发现不进行预扩增直接进行ddPCR,检测到的拷贝数非常少,会出现假阴性,结果不可信。经过预扩增后,拷贝数达到千位数,突变结果可信。所以需要进行预扩增得到足够的拷贝数后再进行ddPCR检测。
(6)本发明对预扩增的引物和ddPCR的引物进行了特殊的设计-巢式设计,预扩增引物在ddPCR检测引物的外围,使ddPCR的引物探针能够成功在预扩增产物上进行检测。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
本说明书中提供了相应引物和探针的具体序列,同时根据相关规定,本申请还提供了计算机可读形式的序列表。需要说明的是,计算机可读形式的序列表中的序列仅供参考,在本说明书中的序列与计算机可读形式的序列表中的序列不一致的情况下,以本说明书中的序列内容为准。
本发明提供一种基因目标位点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其包括步骤(1)-(4),下面进行详细说明。
本发明的步骤(1)中,DNA可以通过已知方法进行提取,此类方式在本领域是已知的。提取方法可参考已知的教科书,例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物等。
本发明中,DNA包括单链、双链或多链DNA。其实例包括基因或基因片段、cfDNA、全基因组DNA、基因组DNA、基因组DNA片段、任意序列的分离DNA或上述任意的扩增拷贝。
“循环核酸”、“游离DNA”、“循环无细胞DNA”、“无细胞DNA”或cfDNA可互换使用,是指不封闭于细胞内并且在血流或其它体液中自由循环的DNA片段。cfDNA可以具有不同的来源,在一些情况下,其来自肿瘤细胞或肿瘤影响的细胞。在另外的情况下,其来自母体血液中循环的胎儿DNA。其它非限制性实例包括来源于相同生物体天然的组织或器官的cfDNA,例如肾脏、肺、脑和心脏。
cfDNA通常是片段化的,并且仅包括基因组的一小部分,其可能与cfDNA所获自的个体的基因组不同。cfDNA生物发生的确切机制是未知的。通常认为cfDNA来自凋亡性或坏死性细胞死亡,不过也有证据表明cfDNA从活细胞中主动释放。通常,cfDNA来源于不同的细胞类型,并且根据细胞来源和健康状态、个体的全基因组cfDNA而变化。
本发明中,生物样品不限定,一般而言,其实例包括但不限于组织样品或流体样品。组织样品包括体细胞样品,例如癌组织等病变组织或正常的组织。流体样品包括血液或其成分例如血浆、血清等。生物样品可以是任何哺乳动物来源的样品,优选来源于人的样品。
在某些实施方案中,DNA为核酸混合物,并且含有多个突变位点。其含量为5ng-500ng,优选10-100ng,还优选为10-50ng,进一步优选10-20ng。本发明中,DNA可通过打断方式得到DNA片段。此类打断方式在本领域是已知的。优选地,用于本发明的方法中的DNA片段长度为100-350bp,还优选为150-200bp。
使生物样本中的DNA单链化是指在高温,优选95-98℃下解链成正义链和负义链,然后与探针组进行混合杂交。本发明通过研究,发现DNA投入量与探针的比能够影响检测效果。如果探针的投入量过少,野生型DNA去除效果差,而探针投入量过多不仅野生型会大量被切割,突变型DNA也会被少量的切割。发现DNA投入量与探针组的探针在一定比例时能够提高突变位点的富集,进而保证更加准确的检出低频突变。优选地,当DNA投入量为10ng情况下,探针组中的单个探针的浓度为20-180nM,探针组的总浓度为0.5-2μM。还优选地,探针组中的单个探针的浓度为20-150nM,例如,20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、120nM、130nM、140nM、150nM,探针组的总浓度为0.6-1.8μM,例如,0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM、1.6μM、1.8μM。
本发明的探针能够与特定位点的野生型DNA序列完全互补,并且其长度为10-25bp,优选15-25bp,例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25bp。在进行变性退火后,探针与完全互补的野生型DNA序列形成短的双链结合体,该结合体在特定的双链特异性酶(以下简称为DSN酶)优先切割,而突变型DNA序列由于与探针不完全互补,同时丰度较低复性速度较慢,而不被DSN酶切割,进而被相对完整的保留了下来。
在具体实施方案中,本发明的探针针对特定的位点进行设计,可以理解,这些突变位点仅是示例性的,本领域技术人员可以根据本发明的方法以及需要进行设计。优选地,包含所述突变的基因选自下述基因中的至少一种或其组合:AKT1、DHFR、IDH2、PDGFRA、ESR1、ALK、DPYD、KIT、PIK3CA、NTRK1、BRAF、EGFR、KRAS、ROS1、NTRK3、CDA、ERBB2、MAP2K1、RRM1、TERT、CYP19A1、ERCC1、MDR1(ABCB1)、SMAD4、UGT1A1*28、CYP2C19、ERCC2、MET、SMO、SLC19A1、CYP2C8、GSTP1、MTHFR、TP53、GGH、CYP2C9、HER2、NOTCH1、TSC1、CYP2D6、HRAS、NQO1、UGT1A1、CYP3A4、IDH1、NRAS和XRCC1。
本发明的步骤(2)中,向含双链结构的溶液中加入双链特异性酶并保持在第二温度进行反应,其中所述第二温度不高于所述第一温度。考虑到DSN酶切割双链结构的切割活性,本发明在探针设计上进行了优化,在设计较短探针的同时,通过增加GC含量,从而在DSN酶最佳切割反应温度内,保证探针Tm值,即第一温度为56℃-60℃。同时本发明还发现,设置探针Tm值为56℃-60℃具有优异的降噪效果。因此,探针组中各探针GC含量优选为60-80%,还优选为60-70%,最优选为61-65%。
本发明进一步对双链特异性酶的浓度进行了优化。优选地,其浓度为0.1-2U,优选为0.1-1U,还优选为0.1-0.8U,进一步优选为0.1-0.5U。
本发明的步骤(3)为富集突变型DNA步骤,扩增可以采用已知的方法进行扩增,包括但不限于例如多重PCR扩增。通过将DSN酶处理的样本与引物组合在适于反应的条件下进行扩增。本发明用于多重PCR扩增的反应体系为优化后的反应体系,本发明通过上述优化提高了扩增效率,即使目标区域剩余的拷贝数少,也一样可以实现高效的扩增。反应体系中包含多重PCR扩增引物和5xVAHTS MμLti-PCR Mix。优选地,多重PCR扩增引物具有SEQ IDNo.:7-12所示的序列。还优选地,引物长度为20±2个碱基,Tm值为57-62℃之间。
本发明中,用于上述扩增的反应程序为:95-100℃反应1-4分钟,进行1-3个循环,优选96-99℃反应1-3分钟,进行1-2个循环;95-100℃反应5-20s,60-70℃反应5-12分钟,进行8-12个循环,且每个循环下降1℃,优选98-100℃反应10-15s,65-70℃反应6-10分钟,进行9-11个循环;95-100℃反应5-20s,55-60℃反应5-12分钟,进行8-12个循环,优选98-100℃反应10-15s,55-58℃反应6-8分钟,进行9-11个循环;60-75℃反应5-15分钟,进行1-3个循环,优选70-75℃反应8-12分钟,进行1-2个循环。本发明还发现,多重PCR中扩增循环在18-24个循环时具有显著提高的扩增效率以及降噪效果。
本发明进一步包括多重PCR产物纯化,纯化可以采用已知方法进行,例如使用包括但不限于AMPure XP磁珠进行纯化步骤。纯化后的多重PCR产物进行数字微滴PCR检测。
本发明的步骤(3)为使富集后的产物进行数字微滴PCR检测。
在某些实施方案中,用于单点突变检测(T790M、L861Q、S768I、G12C、G12V、G13D)的PCR体系包括:Primer F、Primer R、10μM Mutant Probe、10μM Wild type Probe、2×ddPCRSuperMix for Probe、预扩增样本、ddH2O。
在另外的实施方案中,用于位点合并检测G719X的PCR体系包括:10μMG719 N F、G719 N R、EE2 F、EE2 R、G719 b、G719 CP、EE2 CP、2×ddPCR SuperMix for Probe、预扩增样本、ddH2O。
用于数字微滴PCR的反应仪器不特别限定,其实例包括但不限于例如T-100PCR仪。扩增程序为:90-95℃反应5-15分钟,优选93-95℃反应8-12分钟;90-95℃反应25-35s,50-65℃反应1-5分钟,共进行30-50个循环,优选92-95℃反应28-32s,54-60℃反应1-3分钟,共进行35-45个循环;95-99℃反应5-15分钟,优选95-98℃反应8-12分钟,12℃保温,上述反应过程的变温速度为2.5℃/s。
本领域技术人员应理解,只要能够实现本发明的目的,在上述步骤(1)-(4)前后,或步骤之间还可包含其他步骤或操作,例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。
实施例
本实施例示例性示出了基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法。
1、材料
1.1选用Horizon公司的gDNA MμLtiplex Custom Blends,货号#28017Blend 1,此gDNA标准品所包含的具体信息见表1。
表1:标准品信息
1.2模拟真实临床样本制作
将gDNA标准品与人源背景DNA进行混合,得到gDNA标准品与人源背景DNA比例为200ng:800ng,体积为40μL的混合液。
1.3根据标准品内所含有的基因位点设计探针,以及对应的多重PCR引物序列见表2。
表2:部分检测位点探针及预扩增PCR引物序列
1.4探针Mix的制备
将上述探针干粉用无核酸酶水复溶并稀释成10μM的工作液,分别吸取2μL共计12μL于洁净1.5ml离心管中,用枪头吹打混匀,静置2min,然后将混合液稀释10倍,得到终浓度为1μM的探针Mix。
1.5多重PCR反应的可检测基因范围
表3:可检测基因范围
以上合成的引物序列干粉,用无核酸酶水复溶至100μM,每条引物等比例混合,混合后的引物Pool用无核酸酶水稀释,稀释后的引物Pool中的每条引物的浓度为0.04μM。
2、模拟样本处理及预扩增
2.1模拟真实临床样本预处理
将gDNA标准品和人源背景DNA按照200ng:800ng的比例进行混合得到ExpectedFractional Abundance为1%,体积40μL的模拟样本,另取800ng人源背景DNA补充体积至40μL做对照组进行实验。使用Covaris M220超声波打断仪,将两组样本打断到150-200bp,模拟cfDNA。
2.1.1使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen)对样本进行定量,使用Agilent 2100生物分析仪对打断后的样本进行片段大小的检测。
2.1.2将质检合格的1%标准品按照下表4配置反应体系。
表4
组分 | |
探针mix(1μM) | 7μL |
10×DSN buffer | 1μL |
Sample | 10ng |
水 | 补充体系至10μL |
2.2DSN处理
2.2.1将浓度为1U的DSN酶稀释成0.2U的工作酶液。
将上述按反应体系配置好的样本置于life ProFlex PCR仪上,98℃2min,取出样本,B-1和G-1中加入1μL的DSN工作酶液,B-2和G-2不加DSN工作酶液。然后将B-1,B-2,G-1,G-2置于PCR仪上,67℃20min,95℃2min,4℃∞。
2.2.2使用Qubit dsDNAHS Assay Kit(Invitrogen)对样本进行定量,使用Agilent 2100生物分析仪对消化后的样本进行片段大小的检测。
2.3多重PCR扩增反应
将引物Pool与上述2.2中处理过的样本进行多重PCR扩增。多重PCR扩增反应体系的配制见下表5。
组分 | |
Sample | 6μL |
多重PCR扩增引物Pool | 10μL |
5xVAHTS MμLti-PCR Mix | 4μL |
多重PCR扩增反应条件,具体如下表6。
2.4多重PCR产物纯化及定量
提前取出AMPure XP磁珠,室温静置至少30分钟,使用前混匀。
向多重PCR产物中加入30μL Nuclease-free H2O补充至50μL,将50μLPCR产物转移到相应编号的1.5ml离心管中,加入150μL(3X)重悬的XP磁珠,涡旋震荡5秒混匀,瞬时离心,但需保持磁珠悬浮,室温孵育5分钟。
将1.5ml离心管置于磁力架上,待溶液澄清后,弃上清。
保持1.5ml离心管置于磁力架上,向其中加入新鲜配置的200μL 80%乙醇,翻转磁力架5次,洗涤磁珠,弃80%乙醇。
重复上述步骤一次。
从磁力架上取下1.5ml离心管,瞬时离心,将1.5ml离心管放回磁力架上,弃掉1.5ml离心管中残留的80%乙醇,同时打开管盖,室温晾干磁珠。
待磁珠颜色变成亚光色,向1.5ml离心管中加入31μL Nuclease-free H2O,从磁力架上取下1.5ml离心管轻微震荡使磁珠重悬,室温孵育5分钟。
将1.5ml离心管置于磁力架上,室温静置5分钟。待上清与磁珠分离后,吸取30μL上清至新的相应编号的1.5ml离心管中。
使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen)对样本进行定量,使用Agilent2100生物分析仪对PCR产物进行片段大小的检测。
3、数字微滴PCR检测
3.1PCR体系配置
单点突变检测(T790M、L861Q、S768I、G12C、G12V、G13D)的PCR体系配置如下:
表7
Primer F(10μM) | 1.8μL |
Primer R(10μM) | 1.8μL |
Mutant Probe(10μM) | 0.5μL |
Wild type Probe(10μM) | 0.5μL |
2×ddPCR SuperMix for Probe | 10μL |
预扩增样本 | 6μL |
ddH2O | 补体系至21μL |
位点合并检测G719X的PCR体系配置如下:
表8
G719 N F(10μM) | 0.6μL |
G719N R(10μM) | 0.6μL |
EE2 F(10μM) | 0.6μL |
EE2 R(10μM) | 0.6μL |
G719b(20μM) | 0.9μL |
G719CP(10μM) | 0.5μL |
EE2 CP(10μM) | 0.5μL |
2×ddPCR SuperMix for Probe | 10μL |
预扩增样本 | 6μL |
ddH2O | 补体系至21μL |
3.2微滴生成
a、按正确方法将微滴发生卡(DG8 cartridge)卡进微滴发生卡的holder内。取20μL含有待检样品的ddPCR预混液转移至微滴发生卡相应sample孔内,不足8个样品的用稀释一倍的20μL 1×buffer control补足8个样品。
b、将70μL微滴发生油(Droplet generation oil for probe)加入到微滴发生卡相应的oil孔内。液体加入完毕,将胶垫(gasket)放在微滴发生卡上,钩牢微滴发生卡两边的小孔。
c、操作完成,将卡有微滴发生卡的holder置于微滴发生器(QX200TM DropletGenerator)相应位置上,用于微滴生成。
3.3油包水PCR
微滴发生完毕,用移液器将微滴发生卡Droplet孔中的微滴40μL转移至半裙边PCR板相应孔中,用铝膜封闭PCR反应板。将已经封膜的PCR反应板置于T-100PCR仪内进行扩增。
表9
3.4微滴分析
a、微滴分析时,确保微滴分析仪(Droplet Reader)已经预热30min。
b、打开微滴分析仪盖子,将扩增完成的96孔板放置在微滴分析仪适当位置。
c、打开QuantaSoft软件,设置样本相应的名称及关键信息。设置完后运行程序。
3.5结果分析
根据野生型样本和阴性对照划定Ch1和Ch2的临界线,与此同时,会在界面最上面的样本信息表中显示样本Ch1和Ch2检测到的拷贝数,根据拷贝数计算突变频率。
4、结论
经过DSN酶处理的样本,通过富集后进行ddpcr的检测,在设计了降噪探针的突变位点都有10-80倍不等的富集效果。
表10
以下示例性释出了本发明使用的ddPCR引物探针序列:
表11
EE2-F | GCCAAGGCACGACTAACAACC(SEQ ID No:13) |
EE2-F | TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA(SEQ ID No:14) |
EE2-CP | VIC-TCACGCAGTTGGGCAC-MGB-NFQ(SEQ ID No:15) |
A-G719-F | CAACCAAGCTCTCTTGAG(SEQ ID No:16) |
A-G719-R | CCTTATACACCGTGCCGA(SEQ ID No:17) |
A-G719-CP | FAM-CTCTCCTTGAGGATCTT-MGB-NFQ(SEQ ID No:18) |
G719B | PNA:CGGAGCCCAGCAC(SEQ ID No:19) |
DT790M-F | GCATCTGCCTCACCTCCAC(SEQ ID No:20) |
DT790M-R | TCTTTGTGTTCCCGGACATAGTC(SEQ ID No:21) |
DT790M-WP | VIC-ATGAGCTGCGTGATGAG-MGB-NFQ(SEQ ID No:22) |
DT790M-MP | FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQ(SEQ ID No:23) |
G12F | AATTAGATGTATCGTCAAGGCACTCTT(SEQ ID No:24) |
G12R | GCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGG(SEQ ID No:25) |
G12-WP | TACGCCACCAGCTC(SEQ ID No:26) |
比较例
本发明采用了(1)DSN酶+降噪探针+DNA去进行野生型DNA切割后,(2)对(1)产物进行预扩增,(3)对预扩增产物(2)通过ddPCR引物探针进行ddPCR检测。本比较例对比了不进行预扩增直接用(1)产物进行ddPCR,和预扩增后再进行ddPCR的结果,对比结果见下表。发现不进行预扩增直接进行dd PCR,检测到的拷贝数非常少,会出现假阴性,结果不可信。经过预扩增后,拷贝数达到千位数,突变结果可信。因此需要进行预扩增得到足够的拷贝数后再进行ddPCR检测。
表12DSN消化后直接ddPCR结果
表13DSN消化+预扩增后进行ddPCR结果
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
Claims (10)
1.一种基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)使生物样本中的DNA单链化,然后使单链化的DNA与降噪探针组结合,控制温度使探针组中的各探针与单链化DNA的对应序列形成双链结构;其中,所述探针组中各探针设计为能够与目标区域完全互补,且所述探针组中的各探针具有第一温度的Tm值;
(2)向含双链结构的溶液中加入双链特异性酶并保持在第二温度进行反应,其中所述第二温度不高于所述第一温度;
(3)富集步骤(2)得到的DNA;
(4)利用微液滴生成装置将富集的DNA溶液进行微滴化,从而形成多个微液滴,利用温控装置对所述多个微液滴进行核酸扩增,并利用检测装置检测所述多个微液滴的信号变化。
2.根据权利要求1所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其特征在于,所述降噪探针组中各探针长度为10-25个碱基。
3.根据权利要求2所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其特征在于,所述第一温度为56℃-60℃。
4.根据权利要求3所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其特征在于,所述探针组中各探针GC含量为60-80%。
5.根据权利要求1所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其特征在于,所述富集包括:在同一PCR反应体系中加入两对以上的不同引物,扩增DNA的核酸片段,其中所述引物Tm值为57-62℃。
6.根据权利要求5所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其特征在于,扩增循环数为18-24个循环。
7.根据权利要求1所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其特征在于,所述单点降噪中目标区域包括下述基因中的至少一种:AKT1、DHFR、IDH2、PDGFRA、ESR1、ALK、DPYD、KIT、PIK3CA、NTRK1、BRAF、EGFR、KRAS、ROS1、NTRK3、CDA、ERBB2、MAP2K1、RRM1、TERT、CYP19A1、ERCC1、MDR1(ABCB1)、SMAD4、UGT1A1*28、CYP2C19、ERCC2、MET、SMO、SLC19A1、CYP2C8、GSTP1、MTHFR、TP53、GGH、CYP2C9、HER2、NOTCH1、TSC1、CYP2D6、HRAS、NQO1、UGT1A1、CYP3A4、IDH1、NRAS和XRCC1。
8.根据权利要求1所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其特征在于,单个探针的浓度为20-180nM,所述降噪探针组的总浓度为0.5-2μM。
9.根据权利要求1所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其特征在于,步骤(4)包括:
a.根据待检测的突变构建数字微滴PCR体系;
b.生成包含a中所述体系的微滴并进行扩增;
c.统计拷贝数并计算突变频率。
10.根据权利要求5所述的基于单点降噪结合微滴式数字PCR的检测方法,其特征在于,所述探针的序列包括SEQ ID No.:1-6所示的序列,所述引物序列包括SEQ ID No.:7-12所示的序列。
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