CN116656797A - 一种基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法。该方法包括以下步骤:使生物样本中的DNA解链,然后使解链后的DNA在适于在杂交的条件下与探针组杂交,使探针组中的各探针与解链后的DNA形成双链结构;向含双链结构的溶液中加入双链特异性酶并保持于特定温度下进行反应;富集得到的DNA;将扩增后的产物进行末端修复、连接测序接头,进一步构建测序文库后进行高通量测序。本发明的检测方法对突变型DNA不产生影响,同时不仅可以更加准确的检出低频突变,也可以大大降低测序数据量。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域,具体地涉及一种基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法。
背景技术
在癌症液体活检的临床样本中,DNA的改变为疾病的诊断和治疗提供了重要线索。如何灵敏的、准确的检出这些突变型DNA序列,在生物学、生物技术和医学的几个领域构成了持续的技术挑战。
目前存在下述问题:
1.发生改变的突变型DNA序列,通常存在于正常野生型DNA中,且突变型DNA丰度普遍较低,尤其是在血液循环肿瘤DNA中,95%以上的cfDNA来源于正常的白细胞,从几千条序列中,寻找几十个突变的序列,灵敏度是难以保证的。
2.在实验过程、高通量测序过程中,需要进行多轮的PCR,PCR聚合酶的错误合成,会引入低频的、假的突变型DNA序列,与真实的低频突变难以区分。虽然可以通过分子标签技术来解决,但是这需要对目标区域进行大量的、过量的测序,同时大量的测序数据都是测到的野生型DNA,影响了低频突变的检出率,同时也浪费了测序通量。
3.现有方法有的是使用序列特异性的酶去进行野生型片段的去除,但由于这种酶只特异性的识别某些序列特征,导致它们的应用范围是受限的。
4.虽然现在的一些技术可以较好的检测低频突变,比如数字微滴PCR,但是检测的通量以及样本量是受限的,无法高通量的进行大量目标基因和突变的同时检测。
在液体活检样品的基因检测中,野生型DNA对于突变型DNA来说,会影响突变检出灵敏度和准确性,真实的信号会淹没在大量背景噪音中,为了检测到低频突变型DNA,需要大量的深度测序数据,即使这些数据大部分都检测到了野生型DNA。开发一种有效的实验方法结合生信分析优化,将这些低频突变更加灵敏的、准确的检测出来,是现在液体活检基因检测越来越迫切的需求。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题,发明人进行了深入研究,提出一种基因目标位点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,该方法对突变型DNA不产生影响,同时不仅可以更加准确的检出低频突变,也可以大大降低测序数据量。具体地,本发明包括以下内容。
本发明提供一种基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其包括以下步骤:
(1)使生物样本中的DNA解链,然后使解链后的DNA在适于在杂交的条件下与探针组杂交,使探针组中的各探针与解链后的DNA形成双链结构,其中,所述探针组中各探针设计为在低于探针组中各探针Tm平均值5℃内的温度下能够与目标区域完全互补,但不会使解链后的DNA退火;
(2)向含双链结构的溶液中加入双链特异性酶并保持于所述温度进行反应;
(3)富集步骤(2)得到的DNA;
(4)将步骤(3)扩增后的产物进行末端修复、连接测序接头,进一步构建测序文库后进行高通量测序。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其中,所述探针组中各探针长度为10-25个碱基。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其中,所述探针Tm平均值为56℃-60℃。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其中,所述探针组中各探针GC含量为60-80%。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其中,所述富集包括:在同一PCR反应体系中加入两对以上的不同引物,扩增DNA的核酸片段,其中所述引物Tm值为57-62℃。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其中,扩增循环数为18-24个循环。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其中,所述单点降噪中目标区域包括下述基因中的至少一种:AKT1、DHFR、IDH2、PDGFRA、ESR1、ALK、DPYD、KIT、PIK3CA、NTRK1、BRAF、EGFR、KRAS、ROS1、NTRK3、CDA、ERBB2、MAP2K1、RRM1、TERT、CYP19A1、ERCC1、MDR1(ABCB1)、SMAD4、UGT1A1*28、CYP2C19、ERCC2、MET、SMO、SLC19A1、CYP2C8、GSTP1、MTHFR、TP53、GGH、CYP2C9、HER2、NOTCH1、TSC1、CYP2D6、HRAS、NQO1、UGT1A1、CYP3A4、IDH1、NRAS和XRCC1。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其中,单个探针的浓度为20-180nM,所述探针组的总浓度为0.5-2μM。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其中,双链特异性酶浓度为0.2U-1U。
在某些实施方案中,根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其中,所述探针的序列包括SEQ ID No.:1-8所示的序列,所述引物序列包括SEQ IDNo.:9-20所示的序列。
本发明采用了双链特异性酶(DSN酶)处理原始DNA样本,这种酶会特异性的切割完全互补的短双链DNA,而对有变异无法完全配对的序列没有或很低的切割活性。根据这种特性,本发明针对特异的位点设计了和野生型DNA序列完全互补的探针,探针长度在25bp左右,在进行变性退火后,DSN酶会优先的去切割与探针完全互补的野生型DNA序列,而突变型DNA序列由于与探针不完全互补,同时丰度较低复性速度较慢,而不被DSN酶切割,进而被相对完整的保留了下来。根据实际实验结果,本发明对不同的设计目标基因位点检测,结果表明突变型都得到了不同程度的富集。
此外,本发明对探针的设计以及投入量进行摸索,最终发现在10ng DNA起始量的情况下,设计了探针的突变位点突变频率比富集前提高了10-60倍,相比之下,未设计探针的突变位点突变频率没有明显变化。因此,本发明的方法尤其适合于肿瘤cfDNA中低频ctDNA突变的检测,根据本发明的方法,可以针对明确的监控位点设计探针后,进行目标位点的降噪后再靶向富集后进行测序。
本发明的技术效果包括:
(1)适配性好:由于是对原始样本的DNA进行探针杂交+双链特异性酶处理,所以不影响后续的成熟的实验流程,无需新的适配的流程开发;
(2)样本起始量低:本发明对起始的样本量进行了摸索,发现该方法在10ng的起始量的情况下依然可以稳定的对突变型DNA有10-60倍的富集,从而对cfDNA样本进行检测;
(3)探针设计:考虑到双链特异性酶的特性是对于完全互补的、较短的双链DNA是切割效率比较高的,因此本发明设计的探针较短(25nt左右)。同时为了防止探针的3’端进行延伸,本发明在3’端进行了磷酸化,可以阻止碱基的结合,进而阻止延伸;
(4)探针的投入量:探针的投入量过少野生型DNA去除效果差,探针投入量过多不仅野生型会大量被切割,突变型DNA也会被少量的切割,所以合适的探针投入量是本发明需要确定的,在低样本起始量,如10ngDNA投入的情况下,单条探针的工作浓度在20-180nM之间,总探针的工作浓度在0.5-2μM之间,是优选的探针投入量。
(5)PCR扩增循环数:在样本的野生型DNA去除后,后续的多重PCR扩增循环数也是重要的实验参数,扩增循环数过少,会导致进行降噪的位点,覆盖深度会比较差(<50X),扩增循环数过多,由于扩增的偏好性,更倾向于扩增丰度相对较高的野生型DNA,导致测序结果中的富集效果偏差。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
本说明书中提供了相应引物和探针的具体序列,同时根据相关规定,本申请还提供了计算机可读形式的序列表。需要说明的是,计算机可读形式的序列表中的序列仅供参考,在本说明书中的序列与计算机可读形式的序列表中的序列不一致的情况下,以本说明书中的序列内容为准。
本发明提供一种基因目标位点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其包括步骤(1)-(4),下面进行详细说明。
本发明的步骤(1)中,DNA可以通过已知方法进行提取,此类方式在本领域是已知的。提取方法可参考已知的教科书,例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物等。
本发明中,DNA包括单链、双链或多链DNA。其实例包括基因或基因片段、cfDNA、全基因组DNA、基因组DNA、基因组DNA片段、任意序列的分离DNA或上述任意的扩增拷贝。
“循环核酸”、“游离DNA”、“循环无细胞DNA”、“无细胞DNA”或cfDNA可互换使用,是指不封闭于细胞内并且在血流或其它体液中自由循环的DNA片段。cfDNA可以具有不同的来源,在一些情况下,其来自肿瘤细胞或肿瘤影响的细胞。在另外的情况下,其来自母体血液中循环的胎儿DNA。其它非限制性实例包括来源于相同生物体天然的组织或器官的cfDNA,例如肾脏、肺、脑和心脏。
cfDNA通常是片段化的,并且仅包括基因组的一小部分,其可能与cfDNA所获自的个体的基因组不同。cfDNA生物发生的确切机制是未知的。通常认为cfDNA来自凋亡性或坏死性细胞死亡,不过也有证据表明cfDNA从活细胞中主动释放。通常,cfDNA来源于不同的细胞类型,并且根据细胞来源和健康状态、个体的全基因组cfDNA而变化。
本发明中,生物样品不限定,一般而言,其实例包括但不限于组织样品或流体样品。组织样品包括体细胞样品,例如癌组织等病变组织或正常的组织。流体样品包括血液或其成分例如血浆、血清等。生物样品可以是任何哺乳动物来源的样品,优选来源于人的样品。
在某些实施方案中,DNA为核酸混合物,并且含有多个突变位点。其含量为5ng-500ng,优选10-100ng,还优选为10-50ng,进一步优选10-20ng。本发明中,DNA可通过打断方式得到DNA片段。此类打断方式在本领域是已知的。优选地,用于本发明的方法中的DNA片段长度为100-350bp,还优选为150-200bp。
使生物样本中的DNA单链化是指在高温,优选95-98℃下解链成正义链和负义链,然后与探针组进行混合杂交。本发明通过研究,发现DNA投入量与探针的比能够影响检测效果。如果探针的投入量过少,野生型DNA去除效果差,而探针投入量过多不仅野生型会大量被切割,突变型DNA也会被少量的切割。本发明的结果表明,DNA投入量与探针组的探针在一定比例时能够提高突变位点的富集,进而保证更加准确的检出低频突变。优选地,当DNA投入量为10ng情况下,探针组中的单个探针的浓度为20-180nM,探针组的总浓度为0.5-2μM。还优选地,探针组中的单个探针的浓度为20-150nM,例如,20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、120nM、130nM、140nM、150nM,探针组的总浓度为0.6-1.8μM,例如,0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM、1.6μM、1.8μM。
本发明的探针能够与特定位点的野生型DNA序列完全互补,并且其长度为10-25bp,优选15-25bp,例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25bp。在进行变性退火后,探针与完全互补的野生型DNA序列形成短的双链结合体,该结合体在特定的双链特异性酶(本文有时简称为DSN酶)优先切割,而突变型DNA序列由于与探针不完全互补,同时丰度较低复性速度较慢,而不被DSN酶切割,进而被相对完整的保留了下来。
在具体实施方案中,本发明的探针针对特定的位点进行设计,可以理解,这些突变位点仅是示例性的,本领域技术人员可以根据本发明的方法以及需要进行设计。优选地,包含所述突变的基因选自下述基因中的至少一种或其组合:AKT1、DHFR、IDH2、PDGFRA、ESR1、ALK、DPYD、KIT、PIK3CA、NTRK1、BRAF、EGFR、KRAS、ROS1、NTRK3、CDA、ERBB2、MAP2K1、RRM1、TERT、CYP19A1、ERCC1、MDR1(ABCB1)、SMAD4、UGT1A1*28、CYP2C19、ERCC2、MET、SMO、SLC19A1、CYP2C8、GSTP1、MTHFR、TP53、GGH、CYP2C9、HER2、NOTCH1、TSC1、CYP2D6、HRAS、NQO1、UGT1A1、CYP3A4、IDH1、NRAS和XRCC1。
本发明的步骤(2)中,向含双链结构的溶液中加入双链特异性酶并保持于所述温度进行反应,其中该温度不高于探针Tm值,优选其范围为低于探针Tm值的5℃之内。考虑到DSN酶切割双链结构的切割活性,本发明在探针设计上进行了优化,在设计较短探针的同时,通过增加GC含量,从而在DSN酶最佳切割反应温度内,保证探针Tm值处于56℃-60℃。其中,DSN酶最佳切割反应温度为50-60℃,特别是55-60℃,如55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃。同时本发明还发现,设置保证探针Tm值处于56℃-60℃具有优异的降噪效果。因此,优选地,探针组中各探针GC含量为40-80%,还优选为45-80%,最优选为61-80%,例如65%、70%、75%、80%,或期间任意的GC含量值。一般而言,长度较短的探针,当GC含量在50%上下时,Tm值一般为40-55℃之间。
本发明进一步对双链特异性酶的浓度进行了优化。优选地,双链特异性酶的浓度为0.1-2U,还优选为0.1-1U,进一步优选为0.1-0.8U,最优选为0.1-0.5U。
在DSN酶最佳切割反应温度进行消化后,完全互补DNA被切割,而突变型DNA保留,随后在高温下(如95-98℃)进行解链以及接下来的富集过程。
本发明的步骤(3)为富集突变型DNA步骤,扩增可以采用已知的方法进行扩增,包括但不限于例如多重PCR扩增。通过将DSN酶处理的样本与引物组合在适于反应的条件下进行扩增。本发明用于多重PCR扩增的反应体系为优化后的反应体系,本发明通过上述优化提高了扩增效率,从而能够在目标区域剩余的拷贝数少的情况下实现高效的扩增。反应体系中包含多重PCR扩增引物和5xVAHTS MμLti-PCR Mix。优选地,多重PCR扩增引物具有SEQ IDNo.:9-20所示的序列。还优选地,引物长度为20±2个碱基,Tm值为57-62℃之间。
本发明中,用于上述扩增的反应程序为:95-100℃反应1-4分钟,进行1-3个循环,优选96-99℃反应1-3分钟,进行1-2个循环;95-100℃反应5-20s,60-70℃反应5-12分钟,进行8-12个循环,且每个循环下降1℃,优选98-100℃反应10-15s,65-70℃反应6-10分钟,进行9-11个循环;95-100℃反应5-20s,55-60℃反应5-12分钟,进行8-12个循环,优选98-100℃反应10-15s,55-58℃反应6-8分钟,进行9-11个循环;60-75℃反应5-15分钟,进行1-3个循环,优选70-75℃反应8-12分钟,进行1-2个循环。本发明还发现,多重PCR中扩增循环在18-24个循环时具有显著提高的扩增效率以及降噪效果,如果扩增循环数过少,则会导致进行降噪的位点覆盖深度较差(<50X),而扩增循环数过多,由于扩增的偏好性,更倾向于扩增丰度相对较高的野生型DNA,导致测序结果中的富集效果偏差。
本发明进一步包括多重PCR产物纯化,纯化可以采用已知方法进行,例如使用包括但不限于AMPure XP磁珠进行纯化步骤。
本发明的步骤(4)为将步骤(3)扩增后的产物进行末端修复、连接测序接头,进一步构建测序文库后进行高通量测序。末端修复、连接测序接头,进一步构建测序文库可以采用本领域已知的试剂盒和步骤进行,对此不特别限定。进行测序的高通量测序平台不特别限定,包括但不限于,例如Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq、NextSeq和LifeTechnologies/SOLID system、PGM、Proton等。
本领域技术人员应理解,只要能够实现本发明的目的,在上述步骤(1)-(4)前后,或步骤之间还可包含其他步骤或操作,例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。
实施例1
本实施例示例性示出了基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法。
1、材料
1.1选用Horizon公司的gDNA MμLtiplex Custom Blends,货号#28017Blend 1,此gDNA标准品所包含的具体信息见表1。
表1:标准品信息
1.2模拟真实临床样本制作
将gDNA标准品与人源背景DNA进行混合,得到gDNA标准品与人源背景DNA比例为200ng:800ng,体积为40μL的混合液。
1.3根据标准品内所含有的基因位点设计探针,以及对应的多重PCR引物序列见表2。
表2:部分检测位点探针及多重PCR引物序列
1.4探针Mix的制备
将上述探针干粉用无核酸酶水复溶并稀释成10μM的工作液,分别吸取2μL共计12μL于洁净1.5ml离心管中,用枪头吹打混匀,静置2min,然后将混合液稀释10倍,得到终浓度为1μM的探针Mix。
1.5多重PCR反应的可检测基因范围
表3:可检测基因范围
AKT1 | DHFR | IDH2 | PDGFRA | ESR1 |
ALK | DPYD | KIT | PIK3CA | NTRK1 |
BRAF | EGFR | KRAS | ROS1 | NTRK3 |
CDA | ERBB2 | MAP2K1 | RRM1 | TERT |
CYP19A1 | ERCC1 | MDR1(ABCB1) | SMAD4 | UGT1A1*28 |
CYP2C19 | ERCC2 | MET | SMO | SLC19A1 |
CYP2C8 | GSTP1 | MTHFR | TP53 | GGH |
CYP2C9 | HER2 | NOTCH1 | TSC1 | |
CYP2D6 | HRAS | NQO1 | UGT1A1 | |
CYP3A4 | IDH1 | NRAS | XRCC1 |
以上合成的引物序列干粉,用无核酸酶水复溶至100μM,每条引物等比例混合,混合后的引物Pool用无核酸酶水稀释,稀释后的引物Pool中的每条引物的浓度为0.04μM。
2、模拟样本处理及预扩增
2.1模拟真实临床样本预处理
将gDNA标准品和人源背景DNA按照200ng:800ng的比例进行混合得到ExpectedFractional Abundance为1%,体积40μL的模拟样本,另取800ng人源背景DNA补充体积至40μL做对照组进行实验。使用Covaris M220超声波打断仪,将两组样本打断到150-200bp,模拟cfDNA。
2.1.1使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen)对样本进行定量,使用Agilent 2100生物分析仪对打断后的样本进行片段大小的检测。
2.1.2将质检合格的1%标准品和人源背景DNA样本分装至两洁净PCR管中,分别编号为B-1,B-2和G-1,G-2按照下表4配置反应体系,实验设计见表5。
表4
组分 | |
探针mix(1μM) | 7μL |
10×DSN buffer | 1μL |
Sample | 10ng |
水 | 补充体系至10μL |
表5
DSN处理 | 未DSN处理 | 是否含有突变位点 | 是否加入探针 | |
B-1 | √ | √ | √ | |
B-2 | √ | √ | √ | |
G-1 | √ | × | √ | |
G-2 | √ | × | √ |
2.2DSN处理
2.2.1将浓度为1U的DSN酶稀释成0.2U的工作酶液。
将上述按反应体系配置好的样本置于life ProFlex PCR仪上,98℃2min,取出样本,B-1和G-1中加入1μL的DSN工作酶液,B-2和G-2不加DSN工作酶液。然后将B-1,B-2,G-1,G-2置于PCR仪上,60℃20min,95℃2min,4℃∞。
2.2.2使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen)对样本进行定量,使用Agilent 2100生物分析仪对消化后的样本进行片段大小的检测。
2.3多重PCR扩增反应
将引物Pool与上述2.2中处理过的样本进行多重PCR扩增。多重PCR扩增反应体系的配制见下表6。
组分 | |
Sample | 6μL |
多重PCR扩增引物Pool | 10μL |
5xVAHTS MμLti-PCR Mix | 4μL |
多重PCR扩增反应条件,具体如下表7。
2.4多重PCR产物纯化及定量
提前取出AMPure XP磁珠,室温静置至少30分钟,使用前混匀。
向多重PCR产物中加入30μL Nuclease-free H2O补充至50μL,将50μLPCR产物转移到相应编号的1.5ml离心管中,加入150μL(3X)重悬的XP磁珠,涡旋震荡5秒混匀,瞬时离心,但需保持磁珠悬浮,室温孵育5分钟。
将1.5ml离心管置于磁力架上,待溶液澄清后,弃上清。
保持1.5ml离心管置于磁力架上,向其中加入新鲜配置的200μL 80%乙醇,翻转磁力架5次,洗涤磁珠,弃80%乙醇。
重复上述步骤一次。
从磁力架上取下1.5ml离心管,瞬时离心,将1.5ml离心管放回磁力架上,弃掉1.5ml离心管中残留的80%乙醇,同时打开管盖,室温晾干磁珠。
待磁珠颜色变成亚光色,向1.5ml离心管中加入31μL Nuclease-free H2O,从磁力架上取下1.5ml离心管轻微震荡使磁珠重悬,室温孵育5分钟。
将1.5ml离心管置于磁力架上,室温静置5分钟。待上清与磁珠分离后,吸取30μL上清至新的相应编号的1.5ml离心管中。
使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen)对样本进行定量,使用Agilent2100生物分析仪对PCR产物进行片段大小的检测。
2.5将纯化后的PCR产物进行末端修复,将纯化后的多重PCR产物补充体积至规定的总体积,体系配置如下表8。
表8
组分 | |
End Prep Buffer | 5μL |
Damaged DNA Repair Enzymes | 1μL |
End Prep Enzymes | 2.5μL |
纯化后的多重PCR产物 | 40μL |
总体系 | 48.5μL |
反应条件具体见下表9。
表9
2.6末端修复反应混合液连接测序接头。
接头连接的体系配置具体如下。
表10
组分 | 体积 |
末端修复反应混合液 | 48.5μL |
Rapid Ligation buffer2 | 12.5μL |
Rapid DNA Ligase | 2.5μL |
Working adaptor | 1.5μL |
总体系 | 65μL |
接头连接的反应条件具体如下表11。
表11
2.7接头连接产物加52μL的XP磁珠进行纯化。21μL Low EDTA TE Buffer回溶。
2.8纯化后的连接产物使用文库扩增引物进行PCR扩增形成测序文库。PCR扩增反应体系的配置,具体如下表12。
表12
组分 | 体积 |
纯化后的接头连接产物 | 20μL |
VAHTS HiFi Amplification Mix | 25μL |
磷酸化的P5 Primer(10μM) | 2.5μL |
P7 Primer(10μM) | 2.5μL |
总体系 | 50μL |
PCR扩增反应条件,具体如下表13。
表13
2.9文库加45μL的XP磁珠进行纯化,纯化后的文库使用Qubit dsDNA HS AssayKit(Invitrogen)对样本进行定量,使用Agilent 2100生物分析仪进行文库片段大小的检测。
2.10文库上机测序
3、实验结果
本实施例进行了最适反应投入量和多重PCR扩增循环数的测试。投入量分别测试了10ng和100ng,扩增循环数测试了20个循环和25个循环。反应完成后分别进行末端修复和测序接头的连接进行高通量测序。通过高通量测序的数据分析结果显示,根据频率富集提升比率,最适投入量为10ng,多重扩增循环数为20,结果如下表所示。
以投入量为10ng起始,25个循环数如下表:
以投入量为100ng起始,25个循环数如下表:
在此基础上,进一步对突变频率在0.1%的标准品进行了测试。结果显示在起始量100ng,多重扩增循环数20的条件下,可以对千分位的突变有10倍以上的富集效果。
以投入量为100ng起始,20个循环数如下表所示。
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实施例2
本发明在多重PCR扩增反应中发现部分扩增子存在覆盖深度较差的问题,在对引物设计进行Tm值的调整后,扩增子的覆盖深度有了显著提升。
具体的引物调整前后序列和深度变化见下表。
覆盖深度如下:
优化前扩增子测序深度 | 样本1 | 样本2 |
扩增子-32 | 5 | 9 |
扩增子-9 | 135 | 203 |
扩增子-112 | 4 | 27 |
扩增子-120 | 585 | 153 |
优化后扩增子测序深度 | 样本1 | 样本2 |
扩增子-32 | 10616 | 9869 |
扩增子-9 | 2328 | 1079 |
扩增子-112 | 8964 | 8969 |
扩增子-120 | 2351 | 1753 |
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
Claims (10)
1.一种基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)使生物样本中的DNA解链,然后使解链后的DNA在适于在杂交的条件下与探针组杂交,使探针组中的各探针与解链后的DNA形成双链结构,其中,所述探针组中各探针设计为在低于探针组中各探针Tm平均值5℃内的温度下能够与目标区域完全互补,但不会使解链后的DNA退火;
(2)向含双链结构的溶液中加入双链特异性酶并保持于所述温度进行反应;
(3)富集步骤(2)得到的DNA;和
(4)将步骤(3)扩增后的产物进行末端修复、连接测序接头,进一步构建测序文库后进行高通量测序。
2.根据权利要求1所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其特征在于,所述探针组中各探针长度为10-25个碱基。
3.根据权利要求2所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其特征在于,所述探针组中各探针Tm的平均值为56℃-60℃。
4.根据权利要求3所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其特征在于,所述探针组中各探针GC含量为60-80%。
5.根据权利要求1所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其特征在于,所述富集包括:在同一PCR反应体系中加入两对以上的不同引物,扩增DNA的核酸片段,其中所述引物Tm值为57-62℃。
6.根据权利要求5所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其特征在于,扩增循环数为18-24个循环。
7.根据权利要求1所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其特征在于,所述单点降噪中目标区域包括下述基因中的至少一种:AKT1、DHFR、IDH2、PDGFRA、ESR1、ALK、DPYD、KIT、PIK3CA、NTRK1、BRAF、EGFR、KRAS、ROS1、NTRK3、CDA、ERBB2、MAP2K1、RRM1、TERT、CYP19A1、ERCC1、MDR1(ABCB1)、SMAD4、UGT1A1*28、CYP2C19、ERCC2、MET、SMO、SLC19A1、CYP2C8、GSTP1、MTHFR、TP53、GGH、CYP2C9、HER2、NOTCH1、TSC1、CYP2D6、HRAS、NQO1、UGT1A1、CYP3A4、IDH1、NRAS和XRCC1。
8.根据权利要求1所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其特征在于,单个探针的浓度为20-180nM,所述探针组的总浓度为0.5-2μM。
9.根据权利要求1所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其特征在于,双链特异性酶浓度为0.2U-1U。
10.根据权利要求5所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法,其特征在于,所述探针的序列包括SEQ ID No.:1-8所示的序列,所述引物序列包括SEQ ID No.:9-20所示的序列。
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