JP2017522856A - 定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法のための組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は定量的及び／又は半定量的な検出法、特にデジタルPCR又は次世代シークエンシングアッセイに対照及び／又は参照として使用することができる組成物に関する。本発明は上記組成物中に存在する合成核酸構築物、特にプラスミド、キット、それらの使用、及び本発明による組成物の使用を伴う方法も記載する。さらに、本発明による組成物を提供する方法が本明細書に記載される。【選択図】図1

Description

本発明は定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法、特にデジタルPCR又は次世代シークエンシング法に対照及び／又は参照として使用することができる組成物に関する。本発明は上記組成物中に存在する合成核酸構築物、特にプラスミド、該組成物を含むキット、それらの使用、及び本発明による組成物の使用を伴う方法も記載する。さらに、本発明による組成物を提供する方法が本明細書に記載される。

核酸シークエンシングの使用は、現代医学の多くの診断領域において不可欠なツールとなりつつある。特に、次世代シークエンシング（NGS）ベースの遺伝子検査は臨床診断において急速に受け入れられている。かかる領域の一例は腫瘍学であり、例えば催腫瘍性突然変異が遺伝子内に存在するか、又は発癌性の及び／又は指標となる転座がゲノム内に存在するかを同定するために核酸シークエンシングが用いられる。さらに、核酸シークエンシングは、病原性微生物（例えば細菌又はウイルス等）がヒト患者に由来する臨床サンプル、例えば組織サンプル又は血液サンプル中に存在するかを検出するために用いられる。後者の方法では、ヒト対象に見られず、微生物にのみ見られる核酸配列を検出する。したがってNGS法は、催腫瘍性突然変異の有無又は病原体由来の核酸の有無を示し得る標的配列の同定及び配列決定をもたらすことができる。

このため、NGS法及び他の定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法に基づく診断キット及び／又は方法が現在診断目的で開発されている。しかしながら、多くの国では規制条項のために、実際の商品の市販が承認される前に（例えば或る特定の感度閾値を満たすことによって）かかる診断キット及び方法の精度及び有用性を示す必要がある。

これに関連して、用いる方法が希少突然変異又は希少核酸、例えば5 %以下の頻度で臨床サンプル中に生じる突然変異又は核酸の検出に好適であることを示す必要があることが多い。さらに、診断法が適切に行われたことを保証し、それにより任意の偽陰性結果を回避するために、臨床サンプルにおいて通常見られるのと同様に低い頻度で検出される突然変異（複数の場合もあり）又は核酸を保有する陽性対照を提供することも必要である。

しかしながら、幾つかのタイプの癌で生じる突然変異のような希少突然変異又はサンプルにおいて低いパーセンテージで生じる核酸（例えば病原体に由来する核酸）については、検査材料として使用され得る所要の頻度で検出される突然変異及び／又は核酸を保有する臨床サンプルを得ることは極めて困難である。したがって、所要の頻度で検出される希少突然変異及び／又は核酸を含む参照組成物及び／又は対照組成物が必要とされる。

したがって、本発明の目的はかかる参照組成物及び／又は対照組成物を提供することである。

本発明において今回驚くべきことに、（i）少なくとも1つの挿入野生型核酸配列を含む合成核酸構築物、特にプラスミド、又は（ii）ゲノムDNAと、（iii）少なくとも1つの挿入標的核酸配列を含む合成核酸構築物、特にプラスミドとを規定のモル比で含む組成物を、かかる参照組成物及び／又は対照組成物としてNGS又はデジタルPCR等の半定量的及び／又は定量的な方法に使用することができることが見出された。

本発明の組成物を使用することで、得るのが困難である場合があり、検出対象の突然変異又は核酸が生じる頻度が変動し得る臨床サンプルを使用する必要がなくなる。さらに、本発明の組成物は検出対象の任意の所望の突然変異若しくは核酸、又は検出対象の突然変異若しくは核酸の組合せ、及び任意の所望のパーセンテージの検出対象の突然変異又は核酸を備え得るという利点をもたらす。

以下の記載においては、本発明による組成物中に存在するプラスミド（i）及び（iii）に言及する。しかしながら、病原体に由来する配列等の野生型標的配列又はその突然変異又は任意の他の配列を含むことが可能な任意の他の合成核酸構築物も、当然ながら本発明において使用することができることを理解されたい。

したがって、一態様では本発明は、
（i）少なくとも1つの挿入野生型核酸配列を含むプラスミド、又は、
（ii）野生型ゲノムDNA配列を、
（iii）少なくとも1つの挿入標的核酸配列を含むプラスミドとの規定のモル比で含む組成物に関する。

一実施の形態は、プラスミド（iii）が1〜50の挿入標的核酸配列を含む組成物に関する。別の実施の形態では、プラスミド（iii）は1〜30の挿入標的核酸配列を含む。

更なる一実施の形態では、プラスミド（iii）が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30の挿入標的核酸配列を含む。

また別の実施の形態では、上記規定のモル比（iii）対（i）又は（ii）が1：10〜1：30の範囲であり、任意に該規定のモル比（iii）対（i）又は（ii）が1：15〜1：25、例えば1：20、1：18、任意に1：19である。

別の実施の形態では、上記組成物が定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法のための陽性対照組成物又は参照組成物である。

一実施の形態では、上記定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法がデジタルPCR及び／又は次世代シークエンシング（NGS）である。

本発明の別の態様は、定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法における対照組成物及び／又は参照組成物としての本明細書に記載の組成物の使用に関する。一実施の形態では、組成物を陽性対照組成物として使用する。

別の態様において、上記組成物は、定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法の感度を試験するために使用される。

別の実施の形態では、サンプル中に平均して10 %、9 %、8 %、7 %、6 %、5 %、4 %又は3 %生じる1つ又は複数の標的配列に対する感度が確認される。

更なる実施の形態では、上記突然変異検出法がデジタルPCR及び／又は次世代シークエンシング（NGS）である。

別の実施の形態では、上記定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法が、病原体又は癌遺伝子に由来する配列の有無の検出のためのものである。

本発明の更なる態様は、1つ又は複数の標的配列に対する半定量的な及び／又は定量的な検出法の感度を確認する方法であって、
（i）本明細書に記載の組成物を準備する工程と、
（ii）上記組成物を使用して上記半定量的な及び／又は定量的な検出法を行う工程と、
（iii）上記検出法の感度を評定する工程と、
を含む、方法に関する。

本発明のまた別の態様は、
（i）野生型配列をプラスミドへと導入するか、又は野生型ゲノムDNA（gDNA）を準備する工程と、
（ii）少なくとも1つの標的配列を別個のプラスミドへと導入する工程と、
（iii）上記プラスミド及び／又は上記gDNAの絶対的定量化を行う工程と、
（iv）規定のモル比での（i）及び（ii）の組成物を調製する工程と、
を含む、本明細書に記載の組成物を作製する方法に関する。

本明細書に記載の組成物を作製する方法の一態様では、上記プラスミド又は上記gDNAの絶対的定量化をデジタルPCR（dPCR）、任意にデジタルドロップレットPCR（ddPCR）によって行う。

本発明の別の態様は、本明細書に記載の組成物を含むキットに関する。

下記の実施例のように用いられるNGSアッセイの検査材料として調製されるプラスミド組成物のリストを示す図である。図面中英語： Plasmid Pool # (withMutation 突然変異を有するプラスミドプール番号、No. of Mutations 突然変異の数

定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形（the singular forms of "a" and "an"）は文脈により特に明確に指定のない限り、対応する複数形も包含する。逆に、名詞の複数形が使用される場合、これは文脈上明らかに他の指定がない限り単数形も指す。例えば、突然変異（mutations）に言及する場合、単一の突然変異に関連するとも理解される。

「含む（comprising）」という用語は限定するものではないことを理解する必要がある。本発明の目的上、「からなる（consisting of）」という用語は「含む」という用語の好ましい実施の形態であるとみなされる。以下で或る群が少なくとも或る特定数の実施の形態を含むと規定されている場合、これは好ましくはこれらの実施の形態のみからなる群も包含することを意味する。

さらに、本明細書及び特許請求の範囲における第1、第2、第3又は（i）、（ii）、（iii）等の用語は、必ずしも逐次的又は時間的順序について記載するわけではなく、同様の要素を区別するために使用される。そのように使用されるこれらの用語が適切な状況下で置き換え可能であり、本明細書に記載される本発明の実施形態が本明細書で記載又は説明される以外の他の順番で機能することが可能であることを理解されたい。しかしながら、本発明の特定の実施形態では、任意に本明細書で規定される任意の中間工程を含む方法の工程（i）、（ii）及び（iii）はその時間的順序で行われる。

本発明においては、指定の任意の数値は通例、依然として問題の特徴の技術的効果を保証すると当業者に理解される精度の区間と関連する。本明細書で使用される場合、指定の数値からの偏差は±10 %、好ましくは±5 %の範囲内である。上述の±10 %、好ましくは±5 %の指定の数値区間からの偏差は、数値に関して本明細書で使用される「約」及び「およそ」という用語によっても示される。

本発明に関連して、「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態の自然発生的なデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指す。核酸は特に、二本鎖DNA及び一本鎖RNAとすることができる。

「配列」という用語は、本明細書で使用される場合、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーにおける塩基の連続発生（sequential occurrence）を指し、デオキシリボヌクレオチドポリマーに見られる塩基は、A、T、G及びCからなる群から選択され、リボヌクレオチドポリマーに見られる塩基は、A、U、G及びCからなる群から選択される。そのため、デオキシリボヌクレオチドポリマーにおける塩基配列は例えば、GGAAGCAAGCCTであり得る一方、リボヌクレオチドポリマーにおける塩基配列は例えば、GGAAUCGAUであり得る。

本明細書で使用される場合、「野生型配列」又は「野生型核酸配列」は集団、例えばヒトにおいて通常生じる核酸配列に関する。本発明において「野生型配列」は、用いられる診断法によって検出される障害（例えば或る特定のタイプの癌）又は病原生物の指標とならない上記配列を表す。本明細書で使用される「野生型ゲノムDNA」についても同じことが当てはまり、これは集団（例えばヒト）において通常生じる上記DNA配列、すなわち本発明に使用される場合、用いられる診断法によって検出される障害又は病原生物の指標とならない上記DNA配列に関する。

本明細書で言及される「標的配列」又は「標的核酸配列」は核酸配列であり、その有無が本発明による方法において検出され、用いられる診断法によって検出される障害又は病原生物の指標となる。1つ又は複数の標的配列の存在は癌（例えば癌遺伝子）の存在、又は任意の他の疾患、例えば代謝疾患、遺伝病、自己免疫疾患等の発症、重症度、回復等に関係した微生物、特に病原微生物、若しくは核酸配列の存在の指標となり得る。

標的核酸としては、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、cDNA等（これらに限定されない）のDNA、及びmRNA、miRNA等（これらに限定されない）のRNAが挙げられるが、これらに限定されない。標的核酸は自然発生供給源又は合成供給源を含む任意の供給源に由来し得る。核酸はPCR産物、コスミド、プラスミド、自然発生若しくは合成ライブラリーの成員、又は種等であり得る。本発明はこの点で限定されることを意図するものではない。核酸はヒト等の哺乳動物、並びに細菌、ウイルス、真菌、寄生生物及びマイコバクテリウム等の微生物を含むが、これらに限定されない動物又は病原体供給源に由来し得る。幾つかの実施の形態では、核酸はウイルス核酸ではない。標的核酸は血液、唾液、脳脊髄液（「CSF」）、皮膚、毛髪、尿、糞便及び粘液を含むが、これらに限定されない任意の体液又は組織から得ることができる。標的核酸は限定するものではないが、環境サンプル（水サンプル等）、食品サンプル又は法医学サンプルに由来するものであってもよく、サンプルは新鮮サンプル（例えば核酸抽出に直接供される生検材料）、又は保管を可能にするために処理したサンプル、例えばホルマリン固定及び／又はパラフィン包埋したサンプル（FFPEサンプル）であってもよい。

特に、標的配列は本明細書に記載の診断法を用いて検出すべき、先にプラスミド（i）又は野生型ゲノムDNA（ii）に挿入された野生型配列の突然変異（すなわち標的突然変異）を保有する配列であり得る。標的突然変異（複数の場合もあり）を保有するこれらの標的配列は、癌（すなわち、いわゆる癌遺伝子）等の病原性状態の指標となり得る。さらに、標的配列は病原微生物の存在等の病原体（pathogen）の存在の指標となる配列であり得る。

本明細書で使用される「希少突然変異」又は「希少核酸配列」は、平均して10 %未満、特に平均して5 %未満の患者から得られる臨床サンプル中に存在する任意の突然変異又は核酸の配列を表す。「平均してx %のサンプル中に存在する標的配列」は、サンプル中に存在する野生型配列の量に対して標的配列がサンプル中に存在するパーセンテージxを表す。したがって、本明細書で使用される標的配列のパーセンテージは常に、組成物及び／又はサンプル中に存在する野生型配列の量と標的配列の量との比率に関する。

本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、標的配列を含む核酸の存在について試験することができる任意のヒト又は動物（veterinary）対象由来の任意の生物学的サンプルを指す。サンプルとしては、例えば肺組織等の任意の器官から得られる組織、並びに例えば血液、血漿、血清、リンパ液、滑液、脳脊髄液、羊水、羊膜帯血、涙液、唾液及び鼻咽頭洗浄液等の任意の器官から得られる体液が挙げられ得る。上記で挙げられたように、サンプルは身体の特定の領域、例えば気道由来のものであってもよく、気道由来のサンプルとしては、咽頭ぬぐい液、咽頭洗浄液、鼻腔ぬぐい液及び下気道由来の検体が挙げられる。本明細書で使用されるサンプルには、腫瘍組織を含む固形組織サンプルも含まれる。これらのサンプルは腫瘍組織及び周辺組織又は腫瘍組織のみを含み得る。

サンプルは、ヒト又は動物対象由来のものとすることができる。したがって、「患者」はヒト又は動物対象とすることができる。「臨床サンプル」に言及する場合、サンプルが標的配列を含む核酸を保有することが疑われる患者に由来することを示す。

「癌遺伝子」という用語は、本明細書では分子生物学及び腫瘍学のそれぞれにおいて一般的な意味で使用される。このため、例えば「正常又は野生型」遺伝子を催腫瘍性、すなわち発癌性に変える遺伝子において既知の突然変異が存在する。この点での例は、特定のシグナル（例えば成長誘導シグナル）が常に出され、対応するプロセスが開始されるようにキナーゼを構造上活性なものに変える突然変異である。本明細書で使用される「癌遺伝子」は、同様に発癌状況を生じる染色体内又は染色体間転座に関する場合もある。

本明細書で使用される「微生物」という用語は、その最も広い意味で使用される。このため、微生物は任意のタイプの細菌、古細菌、原生動物（protozoum）、真菌及びウイルスであり得る。ウイルスが本明細書で使用される「微生物」の定義に含まれることが明示的に述べられる。本明細書で使用される「病原体」又は「病原微生物」という用語は、患者において疾患を引き起こす能力を有する任意のタイプの微生物に関する。

本明細書で使用される「存在を検出する」という用語は、「有無を検出する」という意味で理解される。

本明細書で使用される「診断法」は診断目的、例えば患者から得られるサンプル中に存在する標的配列の検出のために用いることができる任意の定量的又は半定量的な突然変異検出法を表す。特に、診断法は次世代シークエンシング法及びドロップレットPCR（dPCR）、任意にデジタルドロップレットPCR（ddPCR）を表す。

「定量的な検出法」又は「定量的な突然変異検出法」は、次世代シークエンシング、qPCR又はデジタルPCR等の標的配列の量を決定するために用いることができる任意の検出法を表す。本明細書で用いられる「半定量的な検出法」又は「半定量的な突然変異検出法」は、PCR又はRT-PCR等の標的配列の量の概算を可能にする任意の方法に関する。

本明細書で使用される「デジタルPCR」は、サンプルを多数の小さなサブサンプルに分配し、続いて各々をPCR増幅反応に供する任意のPCR法に関する。PCR増幅後に、ポアソン分布を考慮に入れて、PCR最終産物を含有するサブサンプル（陽性反応）及びPCR最終産物を含有しないサブサンプル（陰性反応）を計数することによって核酸を定量化することができる。デジタルPCR（dPCR）は従来のPCRとは対照的に、初期サンプル量の決定を可能にするために行われる増幅サイクル数に依存せず、それにより標的核酸を定量化するための不確定な指数関数データへの依存をなくし、絶対的定量化をもたらす。本明細書で使用される「デジタルドロップレットPCR」は、初期サンプルがサブサンプルを構成する幾つかの小滴に更に分けられるデジタルPCR法に関する。

本明細書で使用される場合、「次世代シークエンシング」又は「次世代シークエンシング法」という用語は、例えば数十万の比較的小さな配列読取りを一度に生成する能力を有する、慣行的なサンガー法及びキャピラリー電気泳動に基づくアプローチと比較してスループットが増大した任意のシークエンシング技術を指す。次世代シークエンシング法の幾つかの例としては、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング及びハイブリダイゼーションによるシークエンシングが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「増幅」という用語は核酸標的のコピーを数十億生成することが可能な酵素媒介性の手法を指す。当該技術分野において既知の酵素媒介性の標的増幅手法の例としてはPCRが挙げられる。

「核酸を抽出する」とは、バイアル内に存在する任意の核酸を任意の細胞バックグラウンドから単離する、特に無傷の細胞又は組織から単離することを意味する。核酸をプロセス中に洗浄し、任意に濃縮することも好ましい。抽出の後、核酸と関連しない全ての細胞残屑又は組織残屑は除去されている。典型的な抽出法としては低張溶解バッファー、熱及び／又は洗浄剤の使用を挙げることができ、当業者に既知である。

本明細書の「シークエンシング」という用語は、分子生物学において一般的な意味で使用される。これにより、核酸配列における正確な塩基の連続発生が決定される。

発明の詳細な説明
上記で論考されるように、半定量的又は定量的な核酸突然変異検出法において検出対象の希少突然変異又は希少核酸を含む対照組成物又は参照組成物として使用することができる組成物が必要とされる。

本発明において今回、少なくとも1つの挿入標的配列を含むプラスミドとの規定のモル比で挿入野生型核酸配列又は野生型ゲノムDNAを含むプラスミドを含む組成物を、かかる目的で使用することができることが見出された。

したがって、本発明の一態様は、（i）少なくとも1つの挿入野生型核酸配列を含むプラスミド、又は、
（ii）野生型ゲノムDNA配列を、
（iii）少なくとも1つの挿入標的核酸配列を含むプラスミドとの規定のモル比で含む組成物に関する。

挿入標的核酸配列は、本明細書に記載の診断法によって検出される野生型配列の突然変異又は病原体の存在の指標となる配列を保有する任意の配列であり得る。本明細書に記載の診断法によって検出される突然変異は、癌等の疾患又は障害の指標となる任意の突然変異（複数の場合もあり）であり得る。

一実施形態では、プラスミド（iii）は癌の指標となる任意の標的配列又は標的配列の組合せを含み得る。例えば、標的配列又は標的配列の組合せは肺癌、乳癌、甲状腺癌、白血病、黒色腫、大腸癌、前立腺癌、肝癌、リンパ腫又は卵巣癌の指標となり得る。一実施形態では、標的配列又は標的配列の組合せは黒色腫、非小細胞肺癌、大腸癌、甲状腺癌及び／又は白血病の指標となる。一実施形態では、標的配列又は標的配列の組合せは黒色腫の指標となる。一実施形態では、標的配列又は標的配列の組合せは非小細胞肺癌の指標となる。一実施形態では、標的配列又は標的配列の組合せは大腸癌の指標となる。一実施形態では、標的配列又は標的配列の組合せは甲状腺癌の指標となる。一実施形態では、標的配列又は標的配列の組合せは白血病の指標となる。

一実施形態では、標的配列又は標的配列の組合せは癌遺伝子、任意にヒト癌遺伝子の指標となる。検出対象のヒト癌遺伝子はBRAF、NRAS、CDKN2A、MAP2K1、MAP2K2、FGFR3、FGFR4、AKT3、KIT、PIK3CA、GNA11及びGNAQからなる群から選択される遺伝子内の突然変異であり得る。一実施形態では、検出対象の標的配列又は標的配列の組合せは、下記表1に示される群から選択される1つ又は複数の突然変異である。

しかしながら別の実施形態では、標的配列又は標的配列の組合せは微生物の存在、特に病原微生物の存在の指標となる可能性もある。このため、標的配列又は標的配列の組合せはウイルス、例えばC型肝炎ウイルス（HCV）又はヒト免疫不全ウイルス（HIV）の存在の指標となる可能性もある。

別の実施形態では、癌遺伝子及び微生物の存在の指標となる標的配列又は標的配列の組合せがプラスミド（iii）上に存在する。

本発明の一実施形態では、個々のプラスミド（iii）は2つ以上の挿入標的配列、例えば1〜50の標的配列を含む。別の実施形態では、プラスミド（iii）は1〜40の標的配列を含む。また別の実施形態では、プラスミド（iii）は1〜30の標的配列を含む。更なる実施形態では、プラスミド（iii）は1〜20の標的配列を含む。別の実施形態では、プラスミド（iii）は1〜10の標的配列を含む。更なる実施形態では、プラスミド（iii）は1〜5の標的配列を含む。

本発明のまた更なる実施形態では、プラスミド（iii）は図1に示される標的配列の組合せのいずれかを含み得る。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号1の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号2の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号3の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号4の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号5の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号6の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号7の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号8の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号9の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号10の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号11の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号12の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号13の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号14の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号15の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号16の標的配列の組合せを含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号17の標的配列を含む。一実施形態では、プラスミド（iii）は図1のプラスミドプール番号18の標的配列を含む。当然ながら、上記で言及されるプールの1つ又は複数を必要に応じて組み合わせることも可能である。

プラスミド（i）がプラスミド（iii）の標的配列に対応する野生型配列、その結果としてプラスミド（iii）中に挿入される標的配列と同量の野生型配列を含み得ることを理解されたい。例えば、プラスミド（iii）がBRAF遺伝子に突然変異を有する5つの標的配列を含む場合、プラスミド（i）も対応するBRAF遺伝子の5つの野生型配列を含み得る。概して、プラスミド（i）及び（iii）は1つ又は複数の異なる個々のプラスミド又はサブプール上に全ての所望の配列（野生型配列又は突然変異配列）を保有し得る。例えば、約30の挿入配列を含むプラスミドプールは、プラスミドプールを構成する単一のプラスミド上にそれらの全てを保有し得る。代替的には、プラスミドプールが幾つかの、例えば3つ、4つ、5つ又はそれ以上の挿入配列を保有する2つ以上のタイプのプラスミド、例えば2つ、3つ、4つ、5つ又はそれ以上のプラスミドを含むことも企図される。これらの個々のプラスミドは、ともにプラスミドのプールを形成し得るサブグループを形成する。プラスミドプール（i）及び（iii）の全体を再設計することなく、プラスミドのサブグループを種々のアッセイの検証に使用することができること、例えば標的遺伝子を異なるアッセイ、例えば癌アッセイ1及び癌アッセイ2に使用することができることが本発明の利点である。

2つ以上の標的配列又は2つ以上の野生型配列をプラスミド（i）又は（iii）に挿入する場合、野生型配列又は標的配列はプラスミド中に或る特定の距離で導入することができる。野生型配列と標的配列との間の距離は、当業者に好適とみなされる任意の距離であり得る。プラスミド（iii）上に存在する異なる野生型配列又は標的配列の間の距離は、野生型配列若しくは標的配列の各々の間で同じであり得るか、又は異なる野生型配列若しくは標的配列の間で変動し得ることを理解されたい。プラスミド（iii）上に存在する上記野生型配列又は標的配列の間の距離は少なくとも10 bp、少なくとも30 bp、少なくとも50 bp、少なくとも100 bp、少なくとも150 bp、少なくとも200 bp、少なくとも250 bp、少なくとも300 bp、少なくとも350 bp又は少なくとも400 bpであり得る。

組成物中に存在するプラスミドは、かかる目的で当業者に好適とみなされる任意のプラスミドであり得る。かかる目的で好適なプラスミドは当業者に既知であり、pBR322、pBR327、pUC-8、pUC-19、pUC-57、pGEM3Z、M13mp1、M13mp2及びM13mp7を含み得る。

本発明の組成物が（i）少なくとも1つの挿入野生型配列を含むプラスミドと、（iii）少なくとも1つの挿入標的配列を含むプラスミドとを含む場合、プラスミド（i）及び（iii）は同じタイプのプラスミドをベースとするものであっても、又は異なるタイプのプラスミドをベースとするものであってもよい。一実施形態では、プラスミド（i）及び（iii）は同じタイプのプラスミドをベースとする。別の実施形態では、プラスミド（i）及び（iii）はどちらもpUC-57をベースとする。

プラスミド（i）又はgDNA（ii）は、診断法の所望の感度を達成及び／又は確認するのに好適であると当業者にみなされる、プラスミド（iii）との任意のモル比で存在し得る。所望の感度は、例えば販売許可目的のために診断法が達成する必要がある任意の感度であり得る。本明細書で使用される「感度」は、実際に診断法によってそのように正確に同定される標的配列の割合を表し、すなわち標的配列を正確に同定する診断法の能力に関する。

モル比（iii）対（i）又は（ii）は、診断試験によって検出すべき標的配列がサンプル、特に臨床サンプルにおいて通常生じる平均パーセンテージの達成を可能にする任意のモル比であり得る。モル比（iii）対（i）又は（ii）は、本発明による組成物中に標的配列が約10 %、9 %、8 %、7 %、6 %、5 %、4 %、3 %、2 %又は1 %で存在する任意のモル比であり得る。一実施形態では、モル比（iii）対（i）又は（ii）は本発明による組成物中に標的配列が約5 %で存在するモル比である。

したがって、モル比（iii）対（i）又は（ii）は1：10〜1：30の範囲であり得る。一実施形態では、モル比（iii）対（i）又は（ii）は1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19、1：20、1：21、1：22、1：23、1：24、1：25、1：26、1：27、1：28、1：29及び1：30からなる群から選択される。本発明の一実施形態では、モル比（iii）対（i）又は（ii）は1：19である。本発明においては、モル比（iii）対（i）又は（ii）が1：19であり、組成物における標的核酸のパーセンテージが約5 %であることが見出された。

本明細書に記載の組成物は細胞又は細胞系列中に導入してもよく、これを例えば続いてホルマリン固定及びパラフィン包埋する。したがって、ホルマリン固定及びパラフィン包埋（FFPE）参照組成物及び／又は対照組成物を提供することができる。FFPE参照組成物及び／又は対照組成物がヒト又は動物対象から得られるサンプル中に存在するバックグラウンドをより良好に反映することができるため、かかるFFPE組成物は診断法によって試験されるサンプルが通例FFPEサンプルである場合に特に好適であり得る。したがって、本発明の別の態様は、後にホルマリン固定及びパラフィン包埋される細胞中に導入された本明細書に記載の組成物に関する。

本明細書に記載の組成物は、任意の定量的又は半定量的な方法の参照組成物又は対照組成物として使用することができる。しかしながら本発明の一態様では、本明細書に記載の組成物はNGS法又はデジタルPCRにおいて参照組成物又は対照組成物として使用される。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物を参照組成物又は対照組成物として使用する検出法はNGS法である。また別の実施形態では、本明細書に記載の組成物を参照組成物又は対照組成物として使用する検出法はデジタルPCR、任意にデジタルドロップレットPCRである。

参照組成物は通例、診断法（例えば定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法）の感度を確認及び／又は試験するために使用され、対照組成物は診断法（例えば定量的及び／又は半定量的な方法）が正確に行われたことを保証するために使用される。本明細書に記載の組成物は両方の目的で使用され得る。

本発明における「参照組成物」（又は「標準」）は、1つ又は複数の標的配列（希少突然変異を含む配列又は或る特定の病原体に特異的な配列等）を所定の量で含む組成物であり、診断法により標的配列を検出及び／又は定量化することが可能であるかを試験するために使用することができる。本発明において使用される「対照組成物」は、診断法が適切に行われたことを保証するために対照、特に陽性対照として使用される任意の組成物を表す。通例、対照組成物は診断法によって検出すべき1つ又は複数の標的配列を所定の量で含む。したがって、本発明の一実施形態では、対照組成物は陽性対照組成物である。標的配列が参照組成物又は対照組成物中に存在する所定の量は通例、標的配列（複数の場合もあり）が標的配列の有無を試験するサンプル中に存在する平均パーセンテージを反映する。しかしながら、特に参照組成物に関して、所定の量は例えば販売許可目的のために診断法により検出することが可能であるべきサンプル中に存在する標的核酸の任意のパーセンテージであってもよい。標的配列の種々のパーセンテージ及び対応するモル比は上に記載している。このため、参照組成物は一実施形態では約5 %の標的配列（複数の場合もあり）を含む。

本発明の別の態様では、本明細書に記載の組成物は診断法（例えば定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法）の感度を確認するために使用することができる。

特に、本明細書に記載の組成物は、ヒト又は動物対象に由来するサンプル中に平均して約10 %、9 %、8 %、7 %、6 %、5 %、4 %、3 %、2 %又は1 %存在する1つ又は複数の標的配列に対する診断法の感度を確認するために使用することができる。本発明の一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ヒト又は動物対象に由来するサンプル中に平均して10 %存在する1つ又は複数の標的配列に対する診断法の感度を確認するために使用される。本発明のまた別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ヒト又は動物対象に由来するサンプル中に平均して約5 %存在する1つ又は複数の標的配列に対する診断法の感度を確認するために使用される。

本発明の一実施形態では、本明細書に記載の組成物はデジタルPCR及び／又は次世代シークエンシング法の感度を確認するために使用することができる。一実施形態では、組成物はデジタルPCR、特にデジタルドロップレットPCRの感度を確認するために使用される。また別の実施形態では、組成物は次世代シークエンシング法の感度を確認するために使用される。

更なる実施形態では、感度が確認される診断法は、本明細書に記載の癌遺伝子又は病原生物の指標となる標的配列等の標的配列の有無の検出のための定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法である。

本発明の別の態様は、半定量的な及び／又は定量的な検出法等の診断法の感度を確認する方法であって、
（i）本明細書に記載の組成物を準備する工程と、
（ii）上記組成物を使用して上記検出法を行う工程と、
（iii）上記方法の感度を評定する工程と、
を含む、方法に関する。

上記方法の工程（i）は本明細書に記載の組成物を作製する方法の任意の工程を含み得る。組成物を該組成物が用いられることを意図する目的に適合させることができることを理解されたい。例えば、サンプル中に平均して5 %存在する1つ又は複数の標的配列に対する診断法の感度を確認すべき場合、標的配列を5 %含む参照組成物を使用する必要がある。このため、一実施形態では、プラスミド（iii）及びプラスミド（i）又はgDNA（ii）を1：19のモル比で含む組成物が診断法の感度を確認する方法に使用される。

工程（ii）では、感度を確認すべき検出法（例えば半定量的及び／又は定量的な検出法）は、本明細書に記載の組成物を参照組成物として使用することによって行うことができる。例えば工程（ii）では、次世代シークエンシング法又はデジタルPCRは本明細書に記載の組成物を参照組成物として用いて行われる。本方法の一実施形態では、工程（ii）において次世代シークエンシング法を行う。本方法の別の実施形態では、工程（ii）においてデジタルPCR、特にデジタルドロップレットPCRを行う。

本明細書に記載の診断法の感度を確認する方法の工程（iii）では、標的配列を検出するための診断法の感度を評定する。使用される参照組成物中に存在する標的配列のパーセンテージは既知であるため、これは行われる検出法によって達成される結果と、参照組成物中に存在する標的配列の既知のパーセンテージとを比較することによって行うことができる。

工程（i）及び（ii）を幾つかの並行ランで行うことができ、続いて工程（iii）において、ランで得られる値の平均パーセンテージを参照組成物中に存在する標的核酸の既知のパーセンテージと比較することを理解されたい。

したがって、一実施形態では、工程（i）及び（ii）は少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、少なくとも20回、少なくとも25回、少なくとも30回、少なくとも50回又は少なくとも100回の並行ランで行うことができ、上記ラン中に検出される標的核酸の平均パーセンテージを続いて参照組成物中に存在する標的核酸の既知のパーセンテージと比較する。別の実施形態では、工程（i）及び（ii）は2回〜100回の並行ラン、任意に10回〜50回の並行ランで行われ、上記ラン中に検出される標的核酸の平均パーセンテージを続いて参照組成物中に存在する標的核酸の既知のパーセンテージと比較する。別の実施形態では、工程（i）及び（ii）は2回、3回、5回、10回、15回、20回、25回、30回、50回又は100回の並行ランで行われ、上記ラン中に検出される標的核酸の平均パーセンテージを続いて参照組成物中に存在する標的核酸の既知のパーセンテージと比較する。

工程（iii）において試験対象の診断法によって決定される標的配列のパーセンテージが、参照組成物中に存在する標的核酸の既知のパーセンテージに一致することが見出される場合、参照組成物に対する試験の感度が確認される。本発明において使用される「参照組成物中に存在する標的核酸の既知のパーセンテージに一致する」は、必ずしも試験対象の診断法によって決定される標的配列のパーセンテージと、参照組成物中に存在する標的核酸のパーセンテージとが正確に同じ値を有する必要があることを意味するわけではないことを理解されたい。特に行われた並行ランの平均値を決定する場合に、これらの値間の幾らかの偏差が許容され得ることが当業者には理解される。異なる値間の偏差の量は所要の試験の感度に応じて異なり得る。しかしながら一実施形態では、試験対象の診断法によって決定される標的配列の値と参照組成物中に存在する標的配列の既知の値との偏差は0.1 %〜10 %、任意に0.1 %〜5 %で許容可能とみなされ得る。一実施形態では、試験対象の診断法によって決定される標的配列の値と参照組成物中に存在する標的配列の既知の値との偏差は0.1 %、0.2 %、0.3 %、0.4 %、0.5 %、0.7 %、0.8 %、0.9 %、1.0 %、1.5 %、2.0 %、2.5 %、3.0 %、3.5 %、4.0 %、4.5 %又は5 %で診断法の感度を確認するために許容可能とみなされ得る。

本発明は、その態様のうちの別の態様では、
（i）野生型配列をプラスミドへと導入するか、又は野生型ゲノムDNA（gDNA）を準備する工程と、
（ii）標的配列を別個のプラスミドへと導入する工程と、
（iii）上記プラスミド及び／又は上記gDNAの絶対的定量化を行う工程と、
（iv）規定のモル比での（i）及び（ii）の組成物を調製する工程と、
を含む、本明細書に記載の組成物を作製する方法に関する。

上記方法の工程（i）及び（ii）は、配列をプラスミドに導入する又はゲノムDNAを提供するための当業者に既知の任意の方法によって行うことができる。

工程（iii）は少なくとも1つの野生型配列を含むプラスミド、gDNA及び／又は標的配列（複数の場合もあり）を保有するプラスミドの絶対的定量化を含む。一実施形態では、工程（iii）は少なくとも1つの野生型配列を含むプラスミド及び標的配列（複数の場合もあり）を保有するプラスミドの絶対的定量化を含む。別の実施形態では、工程（iii）はgDNA及び標的配列（複数の場合もあり）を保有するプラスミドの絶対的定量化を含む。

工程（iii）で行われる絶対的定量化はqPCR、dPCR又はNGS等の当該技術分野で既知の任意の定量的な検出法を用いて行うことができる。本発明の一実施形態では、絶対的定量化はdPCR、特にddPCRによって行われる。

工程（iii）において得られる結果に基づいて、本明細書に記載の方法の更なる工程（iv）において所望のモル比（ii）対（i）が達成されるように（i）及び（ii）の組成物を混合することができる。本発明の一実施形態では、（i）及び（ii）の組成物は、標的配列を含むプラスミドと少なくとも1つの野生型配列を含むプラスミド又はgDNAとの1：19のモル比が得られるように混合される。

上記の方法によって得られる組成物は本明細書に記載の任意の組成物であることができ、したがって本明細書に記載の任意の目的に使用することができる。

本発明の更なる態様では、本明細書に記載の組成物を含むキットが提供される。これらのキットは本明細書に記載の組成物を参照組成物として含むキットであってもよい。代替的には、これらのキットは本明細書に記載の組成物を陽性対照として含むキットであり得る。

一実施形態では、キットは診断法、例えば半定量的及び／又は定量的な突然変異検出法を行うための付加的な試薬を更に含む。一実施形態では、キットは次世代シークエンシング法及び／又はデジタルPCRのための付加的な試薬を更に含む。付加的な試薬には化学試薬が含まれ得る。さらに、本発明によるキットは使用説明書等を含んでいてもよい。

本明細書で規定及び使用される全ての定義は辞書の定義、引用することにより本明細書の一部をなす文献における定義、及び／又は規定の用語の通常の意味より優先されると理解されるものとする。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

本明細書に記載の実施形態と併せて本発明を説明したが、上述の記載及び以下の実施例は説明を意図し、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の他の態様、利点及び変更は本発明に関連する技術分野の当業者に明らかである。

以下の実施例は、当業者に本発明の組成物を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を与えるために提示される。実施例は本発明の非限定的な例を意図するものである。量、温度等の変量に関して精度を保証するために尽力したが、実験誤差及び偏差を考慮するものとする。他に指定のない限り、部は重量部であり、温度はセルシウス度であり、圧力は大気圧又はそれに近い圧力である。全ての成分は他に指定のない限り、市販のものとした。

方法：
簡潔に述べると、野生型遺伝子アンプリコン配列をプラスミドpUC-57に導入した。突然変異遺伝子配列（すなわち特定の標的配列）を別個のプラスミドに導入した。或る特定の距離で離れた幾つかの標的配列を、異なる標的配列の組合せを含む様々なプラスミドプールを記載する図1に示される表から分かるように、同じ遺伝子アンプリコン配列及び1つのプラスミドに導入した。野生型配列を含むプラスミド（WTプラスミド）及び標的配列（複数の場合もあり）を保有するプラスミド（Mutプラスミド）は同じ骨格配列を有するため、各々のプラスミドの絶対コピー数を定量化するために、プライマーを設計し、QX200 EvaGreen ddPCR Supermixを用いたドロップレットデジタルPCR（dd-PCR）を行った。同じddPCR法を適用して、市販の正常ヒトゲノムDNA（gDNA）、例えばPromegaのカタログ番号G1521のコピー数を定量化することができる。プラスミド及び／又は正常ヒトgDNAの絶対コピー数を測定した後、MutプラスミドをWTプラスミド又は正常ヒトgDNAと任意の規定のモル比で混合する。次いで、これらのプラスミド組成物をVela Diagnosticsによる腫瘍学次世代シークエンシング（NGS）アッセイによって試験した。

概要：
上記の方法によって調製されたプラスミド組成物は、デジタルPCR又は次世代シークエンシング（NGS）等の定量的及び半定量的な突然変異検出法の陽性対照又は参照材料として使用し、この技術により、臨床サンプル中では殆ど見られない希少なものを含む任意の種類の標的配列（複数の場合もあり）に対して或る特定の感度（例えば5 %）が達成され得ることを確認することができることが見出された。

結果：
18個のプラスミドプールを上記の方法によって生成した。プラスミドプールは、図1に示される表に記載されるように1〜30の標的配列（複数の場合もあり）という範囲の異なる数の特定の標的配列を含有していた。合計で131の突然変異をこれら18個のプラスミドプールに導入した。18個全てのプラスミドプールをNGSアッセイによって3回〜5回試験し、全ての標的配列の頻度を報告した。結果を下記表2にまとめる。これらの結果から、上記のプロトコルに従って調製されたプラスミド組成物がMutプラスミドをWTプラスミドに対して1：19のモル比で含有する場合、NGSアッセイによって検出される標的配列頻度がプラスミド中の大半の標的配列について平均して5 %であることが示される。1つの遺伝子アンプリコン配列において或る特定の距離離れた複数の突然変異を同じプラスミドに導入することができ、NGSアッセイによって検出される標的配列頻度が非常によく似ていることも結果から示される。例えば1つのBRAF遺伝子アンプリコン配列中に5つの突然変異を保有するプラスミド1を参照されたい。加えて、結果から、野生型及び突然変異型の両方の異なる遺伝子アンプリコン配列を有する様々な数のプラスミド、例えばプール1に示されるように9つの異なる標的配列を保有するプラスミドを同じプールで混合し、異なる遺伝子の突然変異に対する感度を同時に評定することができることが示唆された。

表2． 5 %の規定モル比で混合したプラスミドプールを使用して行われるNGSアッセイによって測定される標的配列頻度
Plasmid Pool:プラスミドプール
Gene:遺伝子
Mutation:突然変異
Run:ラン
Average:平均

Claims (15)

1. （i）少なくとも1つの挿入野生型核酸配列を含む合成核酸構築物若しくはプラスミド、又は、
   （ii）野生型ゲノムDNA配列を、
   （iii）少なくとも1つの挿入標的核酸配列を含む合成核酸構築物若しくはプラスミドとの規定のモル比で含む組成物。
2. 前記合成核酸構築物若しくはプラスミド（iii）が1〜50の挿入標的配列を含み、該合成核酸構築物若しくはプラスミド（iii）が1〜30の挿入標的配列を含む、請求項1に記載の組成物。
3. 前記合成核酸構築物若しくはプラスミド（iii）が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30の挿入標的配列を含む、請求項1又は2に記載の組成物。
4. 前記規定のモル比（iii）対（i）又は（ii）が1：10〜1：30の範囲であり、又は該モル比（iii）対（i）又は（ii）が1：19である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記組成物が定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法のための陽性対照組成物又は参照組成物である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法がデジタルPCR及び／又は次世代シークエンシング（NGS）である、請求項5に記載の組成物。
7. 組成物を陽性対照組成物として任意に使用する、定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法における対照組成物及び／又は参照組成物としての請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物の使用。
8. 定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法の感度を試験するための請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物の使用。
9. サンプル中に平均して10 %、9 %、8 %、7 %、6 %、5 %、4 %又は3 %生じる1つ又は複数の標的配列に対する感度が確認される、請求項8に記載の使用。
10. 前記突然変異検出法がデジタルPCR及び／又は次世代シークエンシング（NGS）である、請求項7〜9のいずれか一項に記載の使用。
11. 前記定量的及び／又は半定量的な突然変異検出法が、病原体又は癌遺伝子に由来する配列の有無の検出のためのものである、請求項7〜9のいずれか一項に記載の使用。
12. 1つ又は複数の標的配列に対する半定量的な及び／又は定量的な検出法の感度を確認する方法であって、
    （i）請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物を準備する工程と、
    （ii）前記組成物を使用して前記半定量的な及び／又は定量的な検出法を行う工程と、
    （iii）前記方法の感度を評定する工程と、
    を含む、方法。
13. （i）野生型配列を合成核酸構築物若しくはプラスミドへと導入するか、又は野生型ゲノムDNA（gDNA）を準備する工程と、
    （ii）少なくとも1つの標的核酸配列を別個の合成核酸構築物若しくはプラスミドへと導入する工程と、
    （iii）前記合成核酸構築物若しくはプラスミド及び／又は前記gDNAの絶対的定量化を行う工程と、
    （iv）規定のモル比での（i）及び（ii）の組成物を調製する工程と、
    を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物を作製する方法。
14. 前記プラスミド又は前記gDNAの絶対的定量化をデジタルPCR（dPCR）若しくはデジタルドロップレットPCRによって行う、請求項13に記載の方法。
15. 請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。

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