ES2335746T3

ES2335746T3 - Poliformismo de coformacion de hebra unica multitemperatura (msscp).

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Publication number: ES2335746T3
Application number: ES01902877T
Authority: ES
Inventors: Krzysztof Kucharczyk
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-02-07
Filing date: 2001-02-07
Publication date: 2010-04-05
Anticipated expiration: 2021-02-07
Also published as: DE60140272D1; WO2002063043A1; US20030077631A1; ATE446382T1; US20040157236A1; EP1358345A1; JP2004522444A; US7049070B2; EP1358345B1

Abstract

Método para detectar una variación en una molécula de ácido nucleico comprendiendo dicho método los pasos de: (a) prever ácidos nucleicos; (b) transformar los ácidos nucleicos en un confórmero o varios confórmeros espaciales de ácidos nucleicos de una sola hebra; (c) separar el (los) confórmero(s) bajo condiciones nativas; (d) cambiar una condición de separación al menos una vez durante la separación, donde el cambio puede impartir un cambio de conformación en el (los) confórmero(s); (e) detectar el patrón de movilidad del (de los) confórmero(s); y (f) comparar el patrón de movilidad del (de los) confórmero(s) con un patrón de movilidad de un confórmero de ácido nucleico de control para con ello detectar una variación en la molécula de ácido nucleico, donde la condición es la temperatura, y donde se baja la temperatura durante la separación.

Description

Polimorfismo de conformación de hebra única multitemperatura (MSSCP).

Ámbito de la invención

Los métodos de la presente invención se refieren a unos medios para la rápida detección y caracterización de secuencias y variabilidad de secuencias de ácidos nucleicos. La presente invención se refiere a los medios para variar la movilidad de separación de ácidos nucleicos de una sola hebra de manera dependiente de la temperatura. Las variaciones de la movilidad de separación se usan para la detección de cambios de una sola base conocidos y desconocidos en ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

La variabilidad genética que se observa entre los especímenes de cualquier especie es el resultado de polimorfismo desarrollado durante la evolución biológica y de mutaciones espontáneas acumuladas durante la vida de los individuos.

El establecer la correlación entre las variaciones genéticas, el ambiente y el fenotipo observado de un organismo (o de una población) podría proporcionar una información vital para entender los mecanismos básicos de la vida.

Uno de los polimorfismos que se observan más a menudo es una distinción de un solo par de pases en la secuencia de una hebra de ácido nucleico, en comparación con la hebra de ácido nucleico que se da con la mayor prevalencia (tipo salvaje), lo cual se denomina Polimorfismo de un Solo Nucleótido (SNP). Cuando se produce SNP en el gen que codifica para una proteína estructural o su región reguladora, tal polimorfismo genético podría influenciar la funcionalidad de la proteína codificada, de las células y del fenotipo de todo el organismo.

En la mayoría de los casos, en los organismos superiores el fenotipo que se observa es el resultado de la interacción de varios productos genes. Puesto que el mecanismo de compensación/ajuste que existe al nivel de la proteína podría influenciar al fenotipo final, el patrón de polimorfismo y la frecuencia de mutación que están en correlación con cualquier fenotipo pueden ser tan sólo ligeramente distintos en un grupo afectado en comparación con los del control. Para establecer tal correlación, se requieren habitualmente estudios de asociación del genoma completo en cohortes de población.

Puesto que los beneficios de tales estudios podrían mejorar mucho la vida humana, p. ej. introduciendo la diagnosis y la farmacogenómica basadas en DNA en la rutina hospitalaria, hay gran necesidad de establecer una metodología fiable de análisis de mutaciones y polimorfismos de DNA a gran escala del genoma en cohortes de población. A pesar del hecho de que la secuenciación del DNA está pasando a ser una metodología cada vez más rutinaria, ninguno de los otros métodos técnicos que en realidad existen para la detección de la variación de la secuencia genética podría ser aplicado p. ej. para estudios genéticos del genoma humano completo en cohortes de población a un aceptable nivel de consumo de tiempo y de costes.

En la actualidad podrían distinguirse al menos tres pasos en el proceso de detección de mutaciones/SNPs. En el primer paso hay que tomar una decisión sobre qué regiones/genes del genoma tienen que analizarse. En la segunda etapa tiene que llevarse a cabo un cribaje para detectar la presencia de mutaciones/SNPs en los genes/las regiones seleccionados, y en la última etapa podría ser necesaria una secuenciación de las muestras seleccionadas.

El proceso de detección de mutaciones/SNPs depende de la cantidad de NA (NA = ácido nucleico) diana en la muestra analizada. Podrían usarse varios métodos estándar para la purificación de ácidos nucleicos desde el material de partida, y también están disponibles los de una amplia selección de kits (kits = conjuntos de utensilios y materiales) comerciales para la purificación de ácidos nucleicos.

Cuando la cantidad aislada de ácidos nucleicos diana es suficiente para una detección específica, podrían aplicarse los métodos llamados "de detección directa de mutaciones".

Los métodos para la "detección directa" de secuencias específicas en ácidos nucleicos están en su mayoría basados en la hibridación de NA/NA (como p. ej. el método del DNA ramificado bDNA - Urdea et al., Gene 61:253-264 (1987)) o en la interacción de proteína/NA (Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción - RFLP).

Sin embargo, cuando la cantidad de ácidos nucleicos diana en la muestra analizada es demasiado pequeña para su análisis directo, es necesario un paso de amplificación de los fragmentos de los ácidos nucleicos seleccionados. El método más popular que se usa para la amplificación de los fragmentos de los ácidos nucleicos diana es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) como se describe en las Patentes U.S. Núms. 4.683.195 y 4.683.202 concedidas a Mullis et al. El proceso comprende los pasos de tratar hebras complementarias independientes del ácido nucleico con un exceso molar de dos cebadores oligonucleotídicos, extender los cebadores por medio de DNA polimerasa termoestable para formar productos de extensión de cebadores complementarios, que actúan como plantillas para sintetizar la deseada secuencia de ácido nucleico, y detectar la secuencia así amplificada. Los pasos de la reacción pueden realizarse paso a paso o bien simultáneamente, y pueden ser repetidos tantas veces como se desee.

Están entre otros métodos que podrían ser usados para la amplificación de ácidos nucleicos los siguientes:

\bullet: La Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR o LAR) - descrita por Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:189 (1991). La amplificación del NA diana por el método de la LCR está basada en la hibridación única de cuatro oligonucleótidos a los NA diana y a los pares cíclicos de ligación de los mismos. La posibilidad de hibridación inespecífica que podría conducir a una señal de fondo independiente de la diana y el hecho de que el método podría ser aplicado para la detección de variaciones genéticas conocidas, limitan el uso del método de la LCR.

\bullet: La Reacción Sintética Autosostenida (3SR/NASBA) - descrita por Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:1874-1878 (1990) es un método de amplificación de ácidos nucleicos basado en la transcripción que puede amplificar exponencialmente secuencias de RNA de 200-300 pares de bases de longitud a temperatura uniforme.

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Teniendo amplificados los ácidos nucleicos diana, podrían usarse varios métodos para la posterior detección y caracterización de mutaciones y polimorfismos. Todos esos métodos podrían dividirse en dos grupos:

\bullet: los biológicos o específicos - como el RFLP, la hibridación, la ASO PCR, la pirosecuenciación, etc.

\bullet: los físicos o de exploración - como el SSCP, la DGGE, la DHPLC, los métodos basados en la escisión, etc.

El amplio estudio de las técnicas usadas para la detección de SNPs/mutaciones fue presentado en la publicación Electrophoresis Nº 6/99, vol. 20 o en la US 5719028.

Los métodos biológicos (específicos) están basados en el reconocimiento de una específica secuencia de ácidos nucleico, y por consiguiente son primariamente adecuados para la detección de SNPs/mutaciones conocidos. En contraste con ello, el segundo grupo de métodos no requiere un previo conocimiento de las secuencias investigadas, y estos métodos se usan para la detección y/o identificación de cualesquiera SNPs/mutaciones puntuales. Esto podría usarse p. ej. para el cribaje de regiones genéticas altamente variables. Un ejemplo de los métodos biológicos para la detección de diversidad genética podría ser la PCR competitiva, descrita en la Patente U.S. Nº 5.582.989. En ese método se usan dos conjuntos distintos de pares de cebadores para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana. Según este método, un conjunto de cebadores reconoce la secuencia de tipo salvaje y el otro conjunto reconoce la mutación puntual seleccionada. Otro ejemplo es un método que se usa para la detección de la presencia de SNPs específicos en los ácidos nucleicos diana sobre la base de la Amplificación Aleloespecífica (ASO) descrita por Shuber (1997) Pat. US Nº 5.633.134. Desgraciadamente, la reacción PCR podría generar resultados falsos, debido a la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos para las cuales los cebadores no son perfectamente complementarios. En consecuencia, en dependencia de las condiciones de reacción (temperatura, fuerza iónica) cualquier conjunto de cebadores competitivos podría cebar el alargamiento de la secuencia de tipo salvaje o de la secuencia mutante.

Las de otro grupo de técnicas desarrolladas para la detección y el análisis de SNPs/mutaciones están basadas en las propiedades de hibridación de los NA (biochips); véanse, p. ej. Sapolsky et al. (1999) US 5858659; Nerenberger, M et al. (2000) WO 0061805; Arnold, L., et al. (2000) WO 0050869. Asimismo, el método RFLP anteriormente mencionado podría ser usado par la detección de variabilidad genética en los fragmentos de ácidos nucleicos amplificados.

Sin embargo, con cualquiera de las técnicas que se han descrito anteriormente tiene que ser conocida con antelación al ensayo la naturaleza de la variabilidad genérica que se sospeche. Ello hace que dichas técnicas no sean aplicables cuando es necesario detectar la presencia de una mutación/un polimorfismo de carácter y posición desconocidos.

Sólo los del segundo grupo de métodos (los fisicoquímicos) son capaces de detectar mutaciones y polimorfismos ya sea conocidos o bien desconocidos en cualquier genoma seleccionado de interés.

Uno de estos métodos - la Electroforesis en Gel de Gradiente Desnaturalizante (DGGE) - está basado en los cambios de la movilidad electroforética en condiciones desnaturalizantes del híbrido NA/NA analizado. En ese método, las variantes genéticas pueden ser distinguidas sobre la base de las diferencias de las propiedades de fusión de los homoduplexes de NA frente a los heteroduplexes, que se diferencian en un único nucleótido, lo cual redunda en cambios de sus motilidades electroforéticas. Para incrementar el número de mutaciones que pueden ser reconocidas por DGGE, los fragmentos de ácido nucleico amplificados mediante la reacción PCR son "fijados" en un extremo por medio de un largo de tramo de pares de bases G-C (30-80) para evitar la completa disociación de las hebras permitiendo al mismo tiempo la completa desnaturalización de la secuencia de interés (Abrams et al., Genomics 7:463-475 [1990], Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:232-236 [1989]; y Lerman and Silverstein, Meth. Enzymol., 155:482-501 [1987]). Para incrementar el porcentaje de detección de SNPs/mutaciones, ha sido introducido por Wartell et al., Nucl. Acids Res., 18:2699-2701 [1990] el gradiente de temperatura durante la separación del NA diana amplificado.

Algunas limitaciones de ese método se derivan del hecho de que las condiciones desnaturalizantes (temperatura y concentración de urea) dependen de la secuencia analizada, por lo cual hay necesidad de una optimización de las condiciones desnaturalizantes para cada secuencia diana. La reproducibilidad final del método depende de la precisa preparación de gel de gradiente y del preciso control de la temperatura del gel. Son también una consideración importante el gasto extra ocasionado por la síntesis de la cola de fijación de GC para cada secuencia a someter a ensayo y el muy largo tiempo de análisis por muestra.

Uno de los métodos fisicoquímicos más extensamente usados para la detección e identificación de SNPs/mutaciones es el del Polimorfismo de Conformación de Hebra Única (SSCP). En el análisis SSCP, las diferencias de una sola base en los fragmentos de NA son reconocidas sobre la base de la diferencia de su movilidad de separación durante su separación bajo las condiciones nativas (Orita et al., Genomics 5:874-879 (1989)). En condiciones nativas los fragmentos de NA de una sola hebra adoptan una estructura secundaria según su secuencia y las condiciones físicas existentes. Puesto que la movilidad electroforética de una molécula de ácido nucleico de una sola hebra depende de su carga eléctrica neta y de su conformación tridimensional, la modificación de cualquier nucleótido único en el fragmento de DNA puede redundar en su distinta conformación tridimensional y por consiguiente puede influenciar la movilidad de separación. Algunas de las modificaciones de un solo nucleótido podrían sin embargo redundar en una distinta conformación tridimensional solamente en determinadas condiciones fisicoquímicas, de las cuales las más importantes son la fuerza iónica, el pH y la temperatura. El número y la estabilidad energética de los confórmeros bidimensionales de cualquier molécula de ácido nucleico de una sola hebra en función de la temperatura y de la fuerza iónica podrían calcularse p. ej. sobre la base del algoritmo de termodinámica del vecino más cercano, que está disponible en línea en http.//bioinfo.math.rpi.edu/\simmfold/dna/.

Sin embargo, solamente en condiciones óptimas, marcadas con la letra B en la Fig. 1, se observaron diferencias en los patrones de separación entre los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutantes. En las condiciones marcadas en la Fig. 1A, la diferencia de la conformación espacial de los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutantes no influencia a la movilidad de separación en tal medida que la medición de eso fuese posible, con lo cual no se observó diferencia alguna en el patrón de separación de los dos ácidos nucleicos de una sola hebra analizados.

En la Fig. 1 se presentan dos secuencias de tipo salvaje de moléculas de ácido nucleico hipotético con tres mínimos enérgicos locales distintos - confórmeros estables y un mutante distinto en una sola base, que poseen solamente dos confórmeros estables (la parte de la Fig. 1A) en las mismas condiciones físicas. La separación de dios moléculas de ácido nucleico de una sola hebra de este tipo en condiciones nativas podría redundar en dos distintos patrones de separación si las condiciones de separación son óptimas para expresar la diferencia de conformación espacial. En contraste con la composición del medio de separación, la mayor influencia en el perfil de separación la poseería la temperatura del medio de separación.

El ejemplo de la influencia de la temperatura del gel en la detección de una diferencia de un solo nucleótido por el método SSCP se ha mostrado en la Fig. 1C. Ese mismo conjunto de cinco muestras de ácidos nucleicos de una sola hebra del exón 8 del gen p53 humano fue cargado en dos geles idénticos y las electroforesis se efectuaron en esas mismas condiciones, exceptuando la temperatura. En las Figs. 1E y F, la temperatura del gel fue ajustada a 13ºC y 23ºC, respectivamente. Quedó claramente de manifiesto la influencia de la temperatura del gel en la separación electroforética de ácidos nucleicos de una sola hebra que se diferencian entre sí en un único par de bases.

Estos hallazgos han sido sustentados por el hecho de que las estructuras bidimensionales generadas sobre la base del algoritmo de la termodinámica del vecino más cercano [SantaLucia, Jr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, febrero 1998, 1460-1465] que es usado por el software que está disponible en http.//bioinfo.math.rpi.edu/\simmfold/dna/ han presentado confórmeros estables muy distintos y energéticos cuando la temperatura fue variada en aproximadamente 6ºC. Eso viene a apoyar la idea de que toda molécula de DNA de una sola hebra podría tener una temperatura individual/óptima para el análisis SSCP, que podría depender de un contenido de G+C [Kiyama, M., Fujita, T., Biotechniques 21:710-716, 1996], Sin embargo, los cambios en la composición de las bases de A+T son también muy fácilmente detectados por el método SSCP [Collins, A. Lonjjou, C. y Morton, N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 15173-15177], La influencia de la temperatura del gel en la detección de mutaciones en el exón 8 del gen p53, como se ha descrito anteriormente, sugiere que parte de los resultados falso-negativos del SSCP podría estar ocasionada por el inadecuado control de la temperatura del gel más que por el propio método. También sugerimos que al comparar los resultados de SSCP de distintos laboratorios tiene que aplicarse al menos la versión simplificada del modelo de transferencia de calor del gel al exterior (ecuación 1 del Ejemplo 1) para estimar la temperatura real del gel en cada experimento. Tales ajustes de la temperatura del gel deberían ser considerados especialmente al llevar a cabo el análisis SSCP en un equipo de electroforesis en placa o de electroforesis capilar con un módulo de intercambio de calor entre aire y sólido o con sistemas de refrigeración para largo tiempo de reacción.

A pesar de la sencillez de ejecución y de la relativamente alta sensibilidad (de más de un 90%) se ha informado sobre algunas limitaciones del método SSCP. Las más importantes eran las dificultades para obtener resultados consistentes y la falta de una teoría que ayude a predecir las óptimas condiciones de separación (fuerza iónica, pH, temperatura) para un determinado fragmento de NA, haciendo dichas limitaciones que el porcentaje de detección de mutaciones sea inferior al 100%. La observada variabilidad del SSCP según muchos autores depende de la inconsistencia de las condiciones de separación y de la situación de la mutación dentro del fragmento de NA analizado (Glavac y Dean, 1993, Hayashi y Yandell, 1993, Liu y Sommer, 1944). Para hacer que disminuyese la influencia de la temperatura en la separación electroforética, p. ej., fue aplicado bajo voltaje (potencia), si bien ello redundó en un muy largo tiempo de separación - de hasta 12-14 horas. La sensibilidad del método SSCP pudo ser incrementada hasta cerca del 100% aplicando al menos dos distintas condiciones de separación para el análisis de los mismos ácidos nucleicos diana. Las condiciones de separación que ejercen la mayor influencia en la movilidad de separación de ácidos nucleicos de una sola hebra son el tipo de soporte poroso, la composición química del tampón de separación y la temperatura, como ha sido descrito por Liu et al. en la WO 0020853. Sin embargo, el tiempo y el coste de tal enfoque aumentan proporcionalmente al número de separaciones adicionales aplicadas para analizar el mismo conjunto de muestras, y sería muy difícil usar tales enfoques en diagnosis de rutina.

La variabilidad genética podría también ser determinada sobre la base del análisis por espectroscopia de masas especial de los NA diana según Monforte (1998) WO 98/12355, Turano et al. (1998) WO 98/14616 y Ross et al. (1997) Anal. Chem. 15, 4197- 202. En realidad ese método requiere un equipo muy caro y especializado, la cual es la consideración principal.

Grace et al., Nucl. Acids Res. 23 (1995), 4224 a 4226, describen un análisis del polimorfismo de conformación de hebra única con gradiente de temperatura transversal para la optimización de la temperatura de detección de mutaciones SSCP Frío.

Chen et al., Nucl. Acids Res. 23 (1995), 4524 a 4524, describen un SSCP de alta resolución por optimización de la temperatura mediante electroforesis en gel con gradiente de temperatura transversal.

Rübben et al, Eur. J. Epidemiol. 11 (1995), 301 a 306, describen un análisis de SSCP con gradiente de temperatura no radiactivo y electroforesis en gel con gradiente de temperatura para la detección de variantes de HPV6.

Resumiendo, hay gran necesidad de una herramienta analítica que permita efectuar de manera fiable, con alto rendimiento en cuanto al coste y al tiempo y a un nivel cercano al 100% la detección de variabilidad genética de los ácidos nucleicos. Para convertirse en una útil herramienta diagnóstica o tecnológica, debería idealmente operar de modo totalmente automático analizando varias muestras al mismo tiempo. Tales métodos permitirían un más extendido cribaje diagnóstico de los humanos con respecto a sus predisposiciones a contraer varias enfermedades que constituyen amenazas para la vida en comparación con lo que es actualmente posible, y podrían redundar en un cambio del paradigma del cuidado de la salud para pasar de la diagnosis y tratamiento a la prevención sanitaria.

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Breve exposición de la invención

La presente invención se refiere a unos medios para cambiar la movilidad de separación nativa de ácidos nucleicos de una sola hebra mediante cambios de los parámetros físicos de las condiciones de separación. Según la presente invención, los medios para cambiar la movilidad de separación son al menos un cambio de temperatura durante la separación nativa de ácidos nucleicos de una sola hebra. Los cambios de la movilidad de separación de ácidos nucleicos de una sola hebra son usados para la detección de cambios de una sola base conocidos y desconocidos en los ácidos nucleicos a efectos de investigación y diagnosis, entre otras aplicaciones.

La presente invención está basada en el descubrimiento de que los cambios de la temperatura durante la separación nativa de ácidos nucleicos de una sola hebra incrementan la diferenciación de las moléculas analizadas sobre la base de la diferencia de la movilidad de separación de las moléculas de ácido nucleico de una sola hebra analizadas.

Donde se altera la movilidad de separación de ácidos nucleicos de una sola hebra durante la separación nativa, no se pretende que la invención quede limitada por los medios mediante los cuales es alterada la movilidad de separación. Según la presente invención, los medios son la temperatura. El cambio de medios puede manifestarse en un cambio de conformación secundaria y terciaria de los ácidos nucleicos de una sola hebra diana, como se ha representado esquemáticamente en la Fig. 1.

La presente invención contempla medios que cambian la movilidad de separación de los ácidos nucleicos de una sola hebra durante la separación mediante la temperatura Se contempla la temperatura como algo particularmente útil por cuanto que podría ser rápida y repetidamente cambiada durante la separación y porque la influencia de la temperatura en la estructura secundaria y terciaria de los ácidos nucleicos de una sola hebra es importante.

La presente invención se refiere a medios para cambiar la movilidad de separación de un ácido nucleico de una sola hebra de manera dependiente de la secuencia. Los cambios de la movilidad de separación son usados para el cribaje con respecto a las mutaciones conocidas y desconocidas, incluyendo los cambios de base única en los ácidos nucleicos.

La presente invención aporta un método como el que se define en la reivindicación 1. Se desprenden de las reivindicaciones dependientes adicionales realizaciones.

En una realización, la presente invención contempla un método para detectar los cambios de conformación en ácidos nucleicos de una sola hebra durante su separación, comprendiendo dicho método los pasos de: a) prever ácidos nucleicos de una sola hebra; c) separar dichos NA de una sola hebra bajo condiciones tales que dichos ácidos nucleicos de una sola hebra puedan formar una o varias estructuras secundarias y/o terciarias para así generar un patrón de separación de dichas moléculas. Detectando los cambios de estructura secundaria y terciaria, el método de la presente invención detecta indirectamente secuencias. El método comprende adicionalmente el paso f) de comparar dicho patrón de separación de dichos ácidos nucleicos de una sola hebra diana con el patrón de un segundo NA de una sola hebra. En un caso así la secuencia del segundo ácido nucleico de una sola hebra diana puede ser afín pero distinta (p. ej. un control de tipo salvaje para una secuencia mutante).

En una realización, el ácido nucleico de una sola hebra diana contiene una etiqueta fluorescente y la detección del paso e) comprende la detección de fragmentos etiquetados con dicha etiqueta fluorescente.

Se pretende que la invención no quede limitada por la naturaleza del medio de separación usado para la separación de ácidos nucleicos ni por la fuerza física usada para el movimiento de los ácidos nucleicos a través del medio.

La presente invención contempla distintas condiciones de separación (como la fuerza iónica, el pH, la temperatura y la viscosidad, p. ej.), así como el tipo y la forma constructiva del equipo usado para la separación nativa de confórmeros de ácidos nucleicos de una sola hebra.

Se pretende que la invención no quede limitada por la naturaleza del ácido nucleico. En las realizaciones anteriormente descritas, el ácido nucleico diana puede ser DNA de una sola hebra, DNA de doble hebra o RNA.

Descripción de los dibujos

La Fig. 1 aporta un esquema de una realización del método de detección de la presente invención y de la influencia de la temperatura del gel en la detección de mutaciones del gen p53 humano en el exón 8 por el método SSCP.

La Fig. 2 aporta un esquema de una realización del método de detección de la presente invención que demuestra la influencia de los cambios de temperatura durante la separación nativa de dos distintos confórmeros de NA de una sola hebra en su movilidad electroforética.

La Fig. 3 ilustra la influencia de las modificaciones de la temperatura del gel durante la electroforesis nativa en la movilidad electroforética de fragmentos de DNA de una sola hebra desde el exón 7 del gen PAH humano.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a unos medios para cambiar la movilidad de separación de ácidos nucleicos de una sola hebra cambiando la temperatura durante la separación nativa de dichos ácidos nucleicos de una sola hebra.

La observación de que los cambios de temperatura durante la separación nativa de ácidos nucleicos de una sola hebra incrementa la diferenciación del patrón de separación constituye la base del nuevo método de detección de específicas secuencias de ácidos nucleicos.

Según la presente invención, podría obtenerse un "patrón diferenciador" mediante la aplicación de estos cambios de temperatura durante la separación en solitario o bien en combinación con cualesquiera cambios de cualesquiera otros parámetros físicos.

La presente invención aporta un método para la diferenciación de moléculas de ácidos nucleicos de una sola hebra con secuencias putativamente distintas.

La presente invención funciona con cualquier equipo de separación de ácidos nucleicos o cualquier otro ambiente de secuenciación que suponga la determinación o detección de variaciones de las secuencias de nucleótidos.

Los cambios de la movilidad de separación de ácidos nucleicos de una sola hebra se usan para la detección de cambios de una sola base conocidos y desconocidos en ácidos nucleicos a efectos de investigación y diagnosis, entre otras aplicaciones.

Para facilitar la comprensión de la invención se definen a continuación algunas expresiones que aquí se usan:

NA: Ácido Nucleico

ss NA: NA de una sola hebra

"gen": se refiere a un fragmento de DNA que contiene las secuencias de control y codificación que son necesarias para la síntesis de un polipéptido o su precursor.

"de tipo salvaje": se refiere a una secuencia génica que es la más común en la naturaleza, cuando es el gen estructural que habitualmente codifica la proteína funcional.

"mutante": se refiere a un gen que presenta una secuencia alterada en comparación con el gen de tipo salvaje. La proteína codificada por el gen mutante podría tener características alteradas en comparación con el producto del gen de tipo salvaje.

"variación de secuencia": en el sentido en el que se la utiliza en la presente, esta expresión se refiere a diferencias en la secuencia de ácido nucleico entre dos fragmentos de ácido nucleico. Los ejemplos de variación de secuencia incluye, aunque sin carácter limitativo, a las sustituciones y/o deleciones de una sola base, o a las inserciones de uno o varios nucleótidos.

"condiciones nativas": condiciones en las cuales el NA de una sola hebra adoptaría su conformación espacial resultante de la interacción intermolecular de los átomos de dicha molécula. Habitualmente dichas condiciones podrían quedar definidas por los parámetros físicos más decisivos, pero sin quedar limitadas a los mismos, tal como: una temperatura de 0-50ºC, una fuerza iónica de KCl 0-1M, 6 < pH < 9.

"3-D, 2-D": es la versión corta de: conformación espacial tridimensional, bidimensional.

"confórmero": se refiere a una determinada conformación espacial 3-D o 2-D de la molécula de NA de una sola hebra. Es sabido que toda molécula de NA de una sola hebra podría adoptar distintas conformaciones tridimensionales en dependencia de la secuencia de NA y de las condiciones físicas. La estabilidad y las conformaciones bidimensionales de la molécula de NA de una sola hebra podrían estimarse sobre la base p. ej. del modelo del algoritmo de termodinámica del vecino más cercano [SantaLucia, Jr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, febrero 1998, 1460-1465], Podría verse por ese modelo que para toda molécula individual de NA de una sola hebra podrían lograrse varias conformaciones bidimensionales. La mayor influencia en la conformación bidimensional de una determinada molécula de NA de una sola hebra la poseen la temperatura, la fuerza iónica y el pH. Podría también verse por el modelo del algoritmo de termodinámica del vecino más cercano que la óptima gama de temperaturas que podría usarse para cambios de conformación bidimensional es la de 0-50ºC en condiciones nativas.

"patrón de movilidad": en el sentido en el que esta expresión es usada en la presente, la misma se refiere a la distribución espacial o en el tiempo de determinados confórmeros de NA de una sola hebra como resultado de su separación. Los confórmeros son generados a partir de cualquier diana nucleica sin referencia a un tipo salvaje u otro control. La invención contempla el uso del método tanto para la identificación basada en el "patrón de movilidad" de cualesquiera ácidos nucleicos sin referencia a un control como para la identificación de formas mutantes de ácidos nucleicos mediante la comparación de la forma mutante con un control de tipo salvaje o un control mutante conocido,

"oligonucleótido": está definido como una molécula que consta al menos de dos desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, y en la práctica habitualmente de más de diez. El tamaño exacto dependerá de muchos factores, y en mm depende de la función final o del uso final del oligonucleótido.

"cebador": se refiere a un oligonucleótido que es capaz de actuar como punto de iniciación de síntesis de NA al ser puesto en condiciones en las cuales es iniciada la extensión del cebador.

"etiqueta": se refiere a cualquier átomo o molécula que pueda usarse para proporcionar una señal detectable (preferiblemente cuantificable) y pueda unirse a un ácido nucleico. Las etiquetas pueden proporcionar señales detectables mediante cualesquiera de las medidas físicas, tales como: ondas electromagnéticas, fluorescencia, radiactividad, difracción o absorción de rayos X, magnetismo y medidas similares,

"óptimas condiciones de {}\hskip0.4cm separación": se refiere a un conjunto de condiciones que produce la Separación más distante de las bandas presentes en una muestra, con la más uniforme intensidad de señal entre las bandas. Los ejemplos de condiciones modificadas incluyen, aunque sin carácter limitativo, a la temperatura, la fuerza iónica, el pH, etc.

En dependencia de las condiciones y de la secuencia primaria, el ácido nucleico asume la estructura secundaria. Ácidos nucleicos con al menos una diferencia de una sola base asumirían distintas estructuras bidimensionales y/o tridimensionales, lo cual redunda en su distinta movilidad de separación. El registro de la separación de dichos ácidos nucleicos distintos en el tiempo o en el espacio, como se ha representado esquemáticamente en la Fig. 1, redunda en dos distintos patrones de separación. Idealmente, todo cambio de una sola base afectaría al patrón de movilidad de separación de determinados ácidos nucleicos de una sola hebra.

Según el método de la presente invención para la separación se usan moléculas que poseen las estructuras tridimensionales formadas tras la renaturalización de ácidos nucleicos diana desnaturalizados completos. La desnaturalización de ácidos nucleicos puede lograrse tratándolos con medios físicos, químicos o enzimáticos que desorganicen la estructura secundaria de los ácidos nucleicos, tales como un bajo (< 3) o un alto (> 10) pH, una alta temperatura, bajas concentraciones salinas o sustancias químicas tales como p. ej. urea, formamida o proteínas (como p. ej. helicasas) o una combinación de los mismos. Las más eficaces y sencillas de cara al uso parecen ser las combinaciones de alta temperatura (de aproximadamente 100ºC) en presencia de formaldehído o urea, p. ej. Mediante la disminución de la temperatura, la adición de sal, la neutralización del pH y la retiración de las sustancias químicas o proteínas se logra el plegamiento o renaturalización del ácido nucleico. Al ser retirados los medios de desnaturalización, se obtiene una colección de moléculas con estructura tridimensional única dependiente de su secuencia y de las condiciones físicas. Estos confórmeros constituyen una marca característica del ácido nucleico, que podría ser detectada mediante la separación de estos confórmeros sobre un medio poroso en condiciones óptimas.

Tanto los cambios de la secuencia de un ácido nucleico como los parámetros físicos del medio alteran la conformación espacial de los ácidos nucleicos, lo cual redunda en un distinto patrón de separación que refleja la diferencia en la secuencia de la molécula analizada o los cambios de las condiciones de análisis. El hecho de que el parámetro ambiental podría influenciar tan marcadamente al patrón de separación (lo que podría ser la causa de la baja fiabilidad de los análisis SSCP sobre la que se informa en la técnica) constituyó una base para incrementar la probabilidad de obtener dos distintos parámetros de separación al analizar dos ácidos nucleicos con una secuencia muy similar. Según el método de la presente invención, se cambian al menos una vez las condiciones durante la separación nativa de confórmeros de ácidos nucleicos. Eso incrementa la probabilidad de que el ácido nucleico de una sola hebra analizado conserve otra estructura bidimensional y/o tridimensional durante el análisis e incrementa la probabilidad de obtener dos distintos patrones de separación.

Según la presente invención, el cambiar la temperatura del medio durante la separación incrementa la probabilidad de que el ácido nucleico analizado conserve una distinta conformación espacial. Los cambios de la temperatura durante la separación pueden ser usados para detectar cambios de una sola base en moléculas de ácido nucleico de manera cómoda y rápida. El método de la invención se denomina "Polimorfismo de Conformación de Hebra Única Multitemperatura", y de manera abreviada "MSSCP".

Los ácidos nucleicos diana que pueden ser analizados por el método incluyen tanto al RNA como al DNA. Tales ácidos nucleicos diana pueden ser todos ellos obtenidos usando técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, el NA diana puede ser aislado de un cultivo o una muestra de tejido, de células, de bacterias o de virus, puede ser transcrito in vitro desde una plantilla de DNA, o bien puede ser sintetizado químicamente. Además, los sustratos pueden ser aislados de un organismo, ya sea como material genómico o bien como plásmido o DNA extracromosómico, o bien pueden ser un fragmento de tal material generado mediante tratamiento con una endonucleasa de restricción o con otros agentes de escisión, o bien pueden ser sintéticos.

Los ácidos nucleicos diana pueden también ser producidos mediante amplificación usando la PCR. Cuando la diana debe ser una molécula de una sola hebra, la diana puede producirse usando la PCR con amplificación preferente de una hebra (PCR asimétrica). La diana de una sola hebra puede también ser generada de otras maneras que son conocidas en la técnica, tal como mediante digestión de una hebra de una molécula de doble hebra con exonucleasa.

Los ácidos nucleicos diana pueden contener una etiqueta para ayudar a su detección a continuación de la separación. La etiqueta puede ser un radioisótopo situado en el extremo 5' o en el extremo 3' del ácido nucleico. También podría usarse una etiqueta fluorófora, que puede ser detectada directamente, o cualquier grupo reactivo que permita un reconocimiento específico por parte de un agente secundario. Por ejemplo, los ácidos nucleicos biotinilados pueden ser detectados mediante sondeo con una molécula de estreptavidina, que se acopla a un indicador (como p. ej. una enzima o un fluoróforo).

En una realización preferida, el ácido nucleico no etiquetado es visualizado mediante coloración con iones de plata o mediante colorantes para ácidos nucleicos de una sola hebra de los que están comercialmente disponibles. También cuando estén disponibles para el análisis suficientes cantidades de DNA, la fluorescencia directa de los fragmentos de ácido nucleico permitiría análisis paralelos de varias muestras. Tal enfoque sería especialmente útil para las comparaciones automatizadas de p. ej. formas mutantes y de tipo salvaje de un gen separado en ese mismo gel.

Los confórmeros espaciales de los ácidos nucleicos diana con distintas conformaciones tridimensionales podrían ser analizados y resueltos por vahos métodos entre los que se incluye la electroforesis, la cromatografía y la polarización de fluorescencia. La invención se ¡lustra con el uso de separación electroforética. Sin embargo, se señala que la separación de los confórmeros diana no queda limitada a la electroforesis. La separación de confórmeros de ácidos nucleicos de una sola hebra en campo eléctrico se describe para ilustrar el método de la invención puesto que la electroforesis es uno de los métodos más populares que se usan para la separación de moléculas biológicas.

La reacción MSSCP es útil para cribar rápidamente y con alto rendimiento en materia de costes las diferencias de secuencia en una sola base entre moléculas de ácido nucleico. Para optimizar la reacción MSSCP para cualquier ácido nucleico diana deseado (como p. ej. un ácido nucleico de tipo salvaje y una o varias formas mutantes del ácido nucleico de tipo salvaje), podría ser conveniente usar la forma de tipo salvaje y un mutante en un único par de bases para determinar las mejores condiciones de MSSCP (los pasos de temperatura y la concentración salina) que les permitan a las moléculas diana formar los dos patrones de separación más claramente distintos.

Análogamente pueden usarse otros factores que afecten a las estructuras de los ácidos nucleicos, tales como formamida, urea o pH extremos. El ensayo inicial típicamente comprenderá dos separaciones de confórmeros tridimensionales a cuatro temperaturas durante un ciclo: 45ºC, 30ºC, 15ºC y 5ºC. También podrían seleccionarse las concentraciones salinas, p. ej. de 5 mM o 35 mM. Se pretende que la sal que se utilice no limite a la presente invención. La sal que se utilice puede ser elegida de entre los miembros del grupo que consta de cloruro potásico, cloruro sódico, etc.

Hasta la fecha, cada diferencia de un solo nucleótido en el ácido nucleico diana analizado analizada por el método MSSCP ha producido un distinto y reproducible patrón de fragmentos. El corto tiempo de electroforesis (3 min. por muestra) y la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad cercana al 100% gracias al preciso método de control de la temperatura del medio de separación hace que este método de análisis sea muy adecuado para el rápido cribaje de la variabilidad genética en estudios del genoma completo en cohortes de población.

Ello es así especialmente a efectos tales como los de diagnosis de cáncer, tipificación tisular, identidad genética, tipificación bacteriana, cribaje de mutantes en cruces genéticos, etc. Una clara ventaja de usar el método MSSCP es la de que el patrón de confórmeros separados en una determinada combinación de condiciones físicas constituye una huella característica, con lo cual un potencial mutante puede ser comparado con mutantes previamente caracterizados sin secuenciación. Asimismo, al expresar las bandas las distintas movilidades, el tipo salvaje podría ser usado como matriz para una posterior reacción de secuenciación sin necesidad de un procedimiento de clonación. Eso mejoraría de manera importante la calidad de la reacción de secuenciación de la WO 02/063043 PCT/PL01/00012, puesto que solamente se usa un NA de una sola hebra para la reacción de reamplificación. Así, ese enfoque podría conducir muy rápidamente al descubrimiento de nuevos SNPs o mutaciones de un solo punto.

Parte experimental

Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar ciertos aspectos y realizaciones preferidos de la presente invención, y no deberá considerarse que los mismos limiten el alcance de la misma en modo alguno.

En la parte que viene a continuación son de aplicación las abreviaturas siguientes: amplicones (fragmentos amplificados de DNA producidos mediante la reacción PCR); vol. (volumen); w/v (peso a volumen); v/v (volumen a volumen); DNA (ácido desoxirribonucleico); mi (mililitros); M (molar); mM (milimolar); EDTA (ácido etilendiaminotetraacético); SDS (dodecilsulfato sódico); Tris (tris(hidroximetil)-aminometano); TBE (Tris-Borato-EDTA, es decir, tampón Tris titrado con ácido bórico y que contiene EDTA); PBS (salina tamponada con fosfato); PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida); Perkin Elmer (Norwalk, Con.); Promega Corp. (Madison, Wis.); Kucharczyk Inc. (Varsovia, Polonia).

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Ejemplo 1

1) Construcción del Sistema DNA Pointer

A fin de controlar la temperatura del gel durante la electroforesis, se ha construido el Sistema DNA Pointer dedicado. Este Sistema consta de tres módulos:

1 - la cámara de electroforesis en gel en placa con dos cámaras de refrigeración, 2 - módulo de intercambio de calor - basado en células Peltier termoeléctricas y en un eficaz sistema de circulación, 3 - unidad de control - un ordenador personal con software dedicado que permite controlar y programar el perfil de temperatura del gel durante la electroforesis, considerando la cantidad de calor generada por el flujo de corriente a través del gel.

Los parámetros básicos del Sistema DNA Pointer son los siguientes: Gama de temperaturas del gel: 2º-65ºC, precisión de la temperatura del gel 0,1ºC, tamaño del gel (anchura x altura): modelo estándar - 150 x 150 mm. El algoritmo de software que controla la temperatura del gel está basado en la siguiente ecuación que describe la transferencia de calor:

(1)\DeltaT = Qo/(2 A) * (¼ \Deltax1/\lambda1 + \Deltax2/\lambda2 + 1/\lambda3)

Donde:

\DeltaT - diferencia de temperaturas entre el medio refrigerante y el gel

Qo - calor generado dentro del gel

A - superficie de la conductividad térmica (superficie de vidrio de refrigeración del gel)

\Deltax1 - espesor del gel

\lambda1 - conductividad térmica del gel

\lambdax2 - espesor de las placas de vidrio

\lambda2 - conductividad térmica de las placas de vidrio

\lambda3 - coeficiente de transferencia de calor por convección entre la placa de vidrio y el refrigerante

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Ejemplo 2

La influencia de los cambios de la temperatura del gel durante la separación nativa de confórmeros de ácido nucleico de una sola hebra en la detección de la diferencia en un solo nucleótido en el exón 7 del gen PAH humano.

1) Amplificación del exón 7 del gen Fenilalanina Hidroxilasa humano

La preparación de DNA para amplificar fragmentos desde el exón 7 del gen PAH humano se hizo mediante el procedimiento estándar. El exón 7 fue amplificado mediante reacción PCR usando los cebadores AP287 - (TGCCTCT
GACTCAGTGGTGAT) y AP423 - (CCCAAACCTCATTCTTGCAGCA).

Los medios de reacción PCR contenían 100 ng de DNA genómico como plantilla, Tris-HCl 50 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, 2 \muM de cada cebador, 0,2 mM de dNTPs, y 2 U/100 \mul de Taq polimerasa (Kucharczyk Inc., Varsovia). La PCR fue llevada a cabo en 25 \mul, y las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 94ºC por espacio de 5 min. seguidos por 31 ciclos de 94ºC, por espacio de 30 seg., 58ºC por espacio de 30 seg. y 72ºC por espacio de 45 seg. con extensión final a 72ºC por espacio de 5 minutos.

2) Análisis MSSCP y SSCP de amplicones desde el exón 7 del gen PAH humano

1 \mul de producto de PCR de p.1) fue añadido a 5 \mul de urea 7M, 2 \mul de tampón de carga de gel (azul de bromofenol al 0,25% (w/v), xilenocianol FF al 0,25% (w/v), glicerina en agua al 30% (v/v)). Fueron añadidos 4 \mul de H_{2}O hasta un volumen total de 12 \mul. La mezcla fue calentada hasta 94ºC por espacio de 2 minutos y fue luego enfriada sobre hielo. La mezcla enfriada fue inmediatamente cargada en gel de poliacrilamida nativa al 9% (w/v) (acrilamida:bisacrilamida al 9% - 29 : 1, conteniendo glicerina al 5% (v/v)). La electroforesis fue realizada en 1 x TBE en el Sistema DNA Pointer de Detección de Mutaciones (Kucharczyk Inc., Varsovia) con una potencia constante de 40 W. Primeramente fueron llevadas a cabo tres electroforesis SSCP por separado a las siguientes temperaturas constantes del gel: 34ºC, 22ºC y 10ºC y cada una tuvo una duración de 1000 Vh. Tras las electroforesis las bandas de NA de una sola hebra resueltas en todos los geles fueron visualizadas mediante coloración con plata usando el Silver Stain Kit de Kucharczyk Inc., Varsovia, y fueron secadas y exploradas. Los resultados se muestran en las Figs. 3 A, B y C, donde las temperaturas del gel fueron de 34ºC, 22ºC y 10ºC, respectivamente.

En la Fig. 3 los carriles marcados con los números del 1 al 6 y con el número 8 contienen NA de una sola hebra de ocho distintos mutantes de un solo punto del gen PAH humano en el exón 7, y el carril marcado con el número 7 contiene la versión de tipo salvaje.

La selección de la óptima temperatura del gel para el análisis SSCP se basa en la actualidad principalmente en los datos empíricos. Con la Fig. 3 quedó demostrado que al cambiar la temperatura del gel durante la separación nativa de ácidos nucleicos diana incrementamos la diferenciación de patrones electroforéticos.

Eso quedó demostrado al analizar ocho distintos alelos del exón 7 del gen PAH humano. Las Figs. 3 A, B y C demuestran que mientras que el patrón de confórmeros de DNA de una sola hebra resueltos generados a partir de cada mutante cambia al disminuir la temperatura de separación, solamente son generados 5, 5 y 6 distintos patrones durante la electroforesis SSCP a temperaturas constantes del gel de 34ºC, 22ºC y 10ºC, respectivamente. Y no todas las muestras analizadas podían ser distinguidas entre sí y de tipo salvaje.

Sin embargo, durante la electroforesis MSSCP, al ser cambiada la temperatura del gel pasando a 34ºC a 22ºC y a continuación a 10ºC, por espacio de 333 Vh durante la electroforesis a cada temperatura, son generados distintos patrones desde cada mutante y desde el tipo salvaje como se muestra en la Fig. 3 D.

Todas las muestras analizadas tienen patrones electroforéticos claramente distintos y se distinguen fácilmente unas de otras y del tipo salvaje. El tiempo total de la electroforesis MSSCP fue de aproximadamente 65 minutos (1000 Vh). Después de la electroforesis los geles fueron coloreados con plata durante 30 minutos usando el Silver Stain Kit (Kucharczyk Inc., Varsovia) y fueron después secados en el aparato de sacado de gel Dryout (Kucharczyk Inc., Varsovia) y fueron luego explorados y analizados usando el software Gelscan (Kucharczyk Inc., Varsovia). Estos datos sugieren que no solamente las temperaturas seleccionadas son las condiciones suficientes para detectar todas las variantes de secuencia en los fragmentos de DNA de una sola hebra, sino que también el hecho de cambiar la temperatura del gel durante la electroforesis hace que aumente la diferencia electroforética entre las muestras analizadas.

Con ayuda de la tecnología MSSCP hemos analizado otros SNPs y otras mutaciones puntuales en genes humanos tales como APOE, APOB y LHR, y en cada caso se obtuvo un más alto porcentaje de detección de mutaciones o una más clara diferenciación de alelos en comparación con el método SSCP clásico (manuscritos en preparación). Sobre la base de esta evidencia acumulada, hemos llegado a la conclusión de que la sensibilidad del método MSSCP es bastante más alta que el porcentaje de detección de mutaciones por SSCP publicado. Asimismo, el tiempo total de análisis y el coste de las sustancias químicas que se usan en nuestros experimentos, que van hasta aproximadamente 4 minutos y hasta menos a 0,2 dólares estadounidenses por muestra respectivamente, constituyen importantes perfeccionamientos en comparación con el método SSCP clásico. Adicionalmente, debido al bajo volumen de reacción PCR con cebador no etiquetado usado para la amplificación de fragmentos de DNA, disminuyó el coste de la reacción PCR y también el coste total del procedimiento de cribaje de SNPs/mutaciones. La combinación del análisis MSSCP con un rápido y eficaz método de electroelución de moléculas de DNA de una sola hebra seleccionadas desde el gel de PA para la posterior reacción de secuenciación (manuscrito en preparación) constituye una plataforma técnica para un rápido y económicamente rentable descubrimiento de SNPs y de mutaciones puntuales.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias que cita el solicitante se aporta solamente en calidad de información para el lector y no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha procedido con gran esmero al compilar las referencias, no puede excluirse la posibilidad de que se hayan producido errores u omisiones, y la OEP se exime de toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción

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Claims

1. Método para detectar una variación en una molécula de ácido nucleico comprendiendo dicho método los pasos de:

(a): prever ácidos nucleicos;

(b): transformar los ácidos nucleicos en un confórmero o varios confórmeros espaciales de ácidos nucleicos de una sola hebra;

(c): separar el (los) confórmero(s) bajo condiciones nativas;

(d): cambiar una condición de separación al menos una vez durante la separación, donde el cambio puede impartir un cambio de conformación en el (los) confórmero(s);

(e): detectar el patrón de movilidad del (de los) confórmero(s); y

(f): comparar el patrón de movilidad del (de los) confórmero(s) con un patrón de movilidad de un confórmero de ácido nucleico de control para con ello detectar una variación en la molécula de ácido nucleico,

donde la condición es la temperatura, y donde se baja la temperatura durante la separación.

2. El método de la reivindicación 1, donde la variación es una diferencia de una sola base en dicha molécula de ácido nucleico en comparación con dicho control.

3. El método de la reivindicación 2, donde dicha diferencia de una sola base es un polimorfismo de un solo nucleótido.

4. El método de la reivindicación 2, donde dicha diferencia de una sola base es una mutación.

5. El método de la reivindicación 2, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende DNA de doble hebra.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende RNA.

7. El método de la reivindicación 1, donde dichos ácidos nucleicos son obtenidos de un cultivo o muestra de tejido, de células, de bacterias o de virus, transcritos in vitro desde una plantilla de DNA o sintetizados químicamente.

8. El método de la reivindicación 1, donde dichos ácidos nucleicos se obtienen por PCR.

9. El método de la reivindicación 1, donde dicha transformación de ácidos nucleicos comprende el paso de someter a dichos ácidos nucleicos a medios físicos, químicos o enzimáticos o a una combinación de los mismos, donde es desorganizada la estructura secundaria de dicho ácido nucleico.

10. El método de la reivindicación 9, donde dichos medios físicos, químicos o enzimáticos son seleccionados de entre los miembros del grupo que consta de bajo pH, alto pH, alta temperatura, baja concentración salina, urea o formamida.

11. El método de la reivindicación 10, donde dicha transformación comprende el paso de calentar dichos ácidos nucleicos hasta aproximadamente 94ºC.

12. El método de la reivindicación 1, donde dicho paso de separación es seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de electroforesis o cromatografía.

13. El método de la reivindicación 12, donde dicho paso de separación es electroforesis en gel de poliacrilamida.

14. El método de la reivindicación 1, donde el paso de cambiar la condición durante dicha separación cambia la energía total de dicho confórmero espacial de ácido nucleico de una sola hebra.

15. El método de la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico contiene una etiqueta fluorescente.

16. El método de la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico contiene una etiqueta electromagnética.

17. El método de la reivindicación 15, que comprende adicionalmente la detección de dicha etiqueta fluorescente.

18. El método de la reivindicación 16, que comprende adicionalmente la detección de dicha etiqueta electromagnética.

19. El método de la reivindicación 1, donde dicha detección es por coloración con plata.

20. El método de la reivindicación 1, donde el confórmero de control es una secuencia de tipo salvaje.

21. El método de la reivindicación 1, donde el confórmero de control es una secuencia mutante.

22. El método de la reivindicación 1, donde el confórmero de control contiene una variación de secuencia.

23. El método de la reivindicación 1, que comprende además los pasos de:

(a): electroeluir el (los) confórmero(s) de ácido nucleico; y

(b): determinar la secuencia de ácido nucleico de dicho(s) confórmero(s).