CN111206070B - 一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法，在角蛋白底物处理、制胶、电泳及水解条带显色步骤做了改进，包括(A)将10g角蛋白底物和500ml有机溶剂加入回流冷凝装置中，于80‑100℃消煮60‑100min；用两倍体积经4℃预冷的丙酮沉淀角蛋白；离心收集角蛋白沉淀，清洗后于4℃晾干；(B)在制备分离胶时，加入由(A)处理所得角蛋白底物，使得其质量百分含量为0.1％，然后于室温下以100r/min的速度搅拌1h，离心取上清，进行配置质量浓度为12％的分离胶。本发明克服了传统酶谱方法底物特异性低、水解条带区分度低、灵敏度低等局限，提供了一种准确、灵敏的检测角蛋白酶活力的酶谱方法。

Description

一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法
技术领域
本发明属于蛋白酶检测领域，具体涉及一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法。
背景技术
畜禽养殖生产中会产生大量角蛋白(keratin)废弃物，如羽毛、皮毛、角、蹄、爪等。角蛋白是一类硬性纤维状蛋白，它的结构通过二硫键、氢键，盐键和肽键相互作用来维系，不易溶解和消化。传统的物理化学方法处理角蛋白废弃物不仅转化率低，易破坏角蛋白的营养成分，还会造成环境污染。角蛋白降解微生物能够产生一类具有角蛋白水解活性的酶，1963年Nickerson等(Nickerson WJ,et al.Biochimica et Biophysica Acta,1963,77(1):73-86)将具有降解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶。目前发现的多数角蛋白酶具有广泛的底物范围，除了能够降解角蛋白外，还可以降解多种可溶性蛋白质，如胶原蛋白、弹性蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白等。研究显示，用化学合成的对硝基苯胺(para-nitroanilide)作为底物，角蛋白酶主要在P1位点切割疏水性芳香族氨基酸(Silveira ST,et al.Journalof Chemical Technology and Biotechnology,2009,84(3):361-366)。角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽、氨基酸及矿物元素，可以用于制造有机肥料以及饲料添加剂，这不仅解决了目前国内农业和畜牧业资源紧缺的难题，还降解了污染源，有利于改善环境。然而，如何快速鉴定与检测角蛋白酶资源，一直是角蛋白酶开发利用的瓶颈。
酶谱法(Zymogram technique)是用于检测蛋白水解酶的电泳技术，基于特异性底物与丙烯酰胺共聚合来实现酶的特异性检测。随着技术进步，酶谱分析方法又衍生了许多新的技术，包括凝胶酶谱法、原位酶谱分析法、体内酶谱法等。其中，凝胶酶谱法是用于检测蛋白酶活性的最常用手段，其原理大致为：先将目标检测酶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(含特异性底物)电泳分离；在电泳过程中，SDS与目标检测酶结合(可逆结合)，破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥水解作用；电泳结束后，将胶置于Trition中洗脱，由于SDS被Trition结合而去除，从而使酶恢复了活性，在各自的迁移位置发挥水解作用；最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，在蓝色背景下可出现酶的水解白色条带，条带的强弱与酶活性成正比。根据制胶过程中，在分离胶中加入的底物不同，从而能特异性检测不同的酶类。该方法具有检测结果直观、能对目标检测酶定量和定性分析等优点，因此被广泛用于蛋白酶检测技术领域。
然而，针对于某些特殊蛋白酶的检测(如：角蛋白酶)，凝胶酶谱法存在一些技术上的不足：(1)常用底物特异性低，无法针对性的检测具有广泛水解能力的角蛋白酶；(2)由于角蛋白底物的特殊性，直接加入角蛋白底物，不能与丙烯酰胺有效结合，导致在凝胶背景中，水解条带区分度低、灵敏度低，无法准确的对酶进行定量或定性分析。因此，亟待开发一种准确、灵敏的检测方法，以快速有效的鉴定角蛋白酶资源，加快角蛋白的生物转化，提高角蛋白废弃物的利用率。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法，其包括：
1)角蛋白底物预处理，清除羽毛角蛋白上的杂质；
2)角蛋白胶谱的制备，包括制备分离胶和浓缩胶；
3)进行电泳和水解条带显色；
其中：
(A)步骤1)中，将10g角蛋白底物和500ml有机溶剂加入回流冷凝装置中，于80-100℃消煮60-100min；用两倍体积经4℃预冷的丙酮沉淀角蛋白；离心收集角蛋白沉淀，清洗后于4℃晾干；
(B)在制备分离胶时，加入由(A)处理所得角蛋白底物，使得其质量百分含量为0.1％，然后于室温下以100r/min的速度搅拌1h，离心取上清，进行配置质量浓度为12％的分离胶；
所述角蛋白底物包括羽毛；所述有机溶剂包括二甲基亚砜、乙二醇中的一种。
本发明通过对角蛋白底物进行消煮处理，有效的清除了角蛋白表面的油脂或其它杂质。本发明的发明人发现，在消煮时，温度和时间对后续的酶谱反应效果影响较大，温度过高或时间过长易使得角蛋白炭化。
在制胶过程中，本发明的发明人惊奇的发现，通过向制胶溶液加入经(A)处理后的角蛋白底物，再经(B)步骤控制温度和搅拌时间并进行离心制备分离胶，已进一步去除杂质，使角蛋白底物更均匀的与丙烯酰胺共聚结合，可有效提高酶谱试验的区分度与灵敏度。如本发明的实施例所示，利用本发明酶谱方法对角蛋白酶进行检测，水解条带辨识度强，可轻易判别目标酶的活性；更重要的是还可以进行目标酶的酶学特性检测。
本领域技术人员均知，在对酶进行酶谱检测时，水解条带的辨识度的强弱是至关重要的。如本发明的一个实验例所示，现有技术在利用酶谱法对角蛋白酶进行检测时，所得水解条带辨识度极差，最多只能对目标酶的大小进行粗略估计，难以进行酶活的对比，更无法对目标酶的酶学特性进行检测。因此，应当理解，本发明所得的技术效果对于角蛋白酶的检测领域而言，是极其显著的，对角蛋白废弃物资源高值化综合利用具有巨大的应用价值。
优选的，用丙酮沉淀角蛋白后，于2000g离心15min收集角蛋白沉淀，用去离子水重悬，清洗沉淀，于2000g离心15min收集沉淀，重复清洗一次后于4℃晾干。
利用上述方法处理角蛋白底物，可以使得检测效果更好。
优选的，将角蛋白沉淀晾干后，再进行研磨，过100目筛。
本发明的发明人发现，角蛋白底物的预处理对于后续的酶谱检测较为重要，通过将角蛋白沉淀晾干后再进行研磨过100目筛，可增强水解条带的辨识度。
优选的，所述有机溶剂为乙醇。
本发明的发明人发现，利用二甲基亚砜或乙醇处理角蛋白底物，可有效的去除角蛋白表面的油脂或其它杂质。特别的，利用乙醇处理时，不仅效果优秀，且试剂的毒性小、成本低，利于推广应用。
优选的，配置所述质量浓度为12％的分离胶时，其方法为：依次加入ddH2O 3.3ml，30％丙烯酰胺溶液4ml，1.5mol/LpH＝8.8的Tris溶液2.5ml，10％SDS 50ul，再加入由(A)处理后的角蛋白底物0.05-0.1g，于室温下以100r/min的转速搅拌1h，然后将溶液在2000g离心15min，取上清，按10ml分离胶中加入10％过硫酸铵100ul以及N,N,N',N'-四甲基二乙胺4ul的体积比例制备成混合溶液。
优选的，在电泳时，酶样品按体积比1:3与上样缓冲液混合；按5-10ul/孔混合样品上样，于4℃条件下，进行SDS-PAGE电泳，80-100V恒压跑至分离胶和浓缩胶交界处后改为170–200V恒压，直至溴酚蓝跑出胶外；所述上样缓冲液的成分为：0.32％Tris-HCl 6.4ml，4％pH 7.2SDS 8ml，16％甘油3.2ml，溴酚蓝0.024g，ddH2O 2.4ml。
优选的，电泳结束后，将凝胶置于洗脱液中振荡洗脱2次，每次20-40min；然后，用漂洗液漂洗2次，每次10-20min；接着，将凝胶置于孵育液中37℃孵育24–40h；孵育结束后经染色液于室温染色2-4h或于4℃染色过夜；最后，用脱色液A和脱色液B分别脱色0.5-1h和1-2h；
所述脱色液A由甲醇、乙酸、去离子水按体积比3:1:6组成；
所述脱色液B由甲醇、乙酸、去离子水按体积比2:1:8组成。
优选的，所述洗脱液为：2.5％Triton X-100，50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1μMZnCl2，pH7.6；所述漂洗液为：50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，pH7.6；所述染色液为：0.05％考马斯亮蓝，甲醇30ml，乙酸10ml，ddH2O 60ml。
优选的，所述孵育液为下述孵育液中的一种：
1)50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.02％NaN3，0.05％Brij-35，pH 7.6；
2)0.1M柠檬酸48.5ml，0.2M NaHPO451.5 ml，pH 5.0；
3)50mM Tris-HCl，150mM NaCl，10mM CaCl2，0.02％NaN3，pH 7.5。
本发明通过大量实验发现，在制胶、电泳和水解条带显色过程中，利用上述方案可以使角蛋白底物更均匀的与丙烯酰胺共聚结合，使得检测的区分度与灵敏度更优。
本发明的有益效果：
1)本专利克服了传统酶谱方法底物特异性低、水解条带区分度低、灵敏度低等局限，针对于角蛋白的特殊性，提供了一种准确、灵敏的检测角蛋白酶活力的酶谱方法；
2)本专利技术能快速有效的鉴定角蛋白酶资源，有望为角蛋白废弃物资源高值化综合利用提供技术支持。
附图说明
图1为实施例1和对比例1的检测效果对比图；其中A为对比例1的检测效果图，B为实施例1的检测效果图，keratinase意为角蛋白酶，Marker意为蛋白标记物；
图2为不同蛋白酶抑制剂对K.paraultunense厌氧角蛋白酶的影响图；其中，pepstatinA意为天冬氨酸蛋白酶抑制剂-胃酶抑素，PMSF意为丝氨酸蛋白酶抑制剂-苯甲基磺酰氟，EDTA意为金属蛋白酶抑制剂-乙二胺四乙酸，E-64意为半胱氨酸蛋白酶抑制剂，Control意为对照组。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
1.角蛋白底物预处理
(1)消煮
在回流冷凝装置中加入10g羽毛和500ml二甲基亚砜或乙二醇，于80-100℃消煮60-100min。然后，用两倍体积经4℃预冷的丙酮，沉淀羽毛角蛋白。
(2)清洗晾干
离心收集角蛋白沉淀，2000g/15min。用去离子水重悬，清洗沉淀，2000g/15min离心收集沉淀，重复清洗一次后于4℃晾干。
(3)研磨过筛
角蛋白经研磨后，过100目筛，得到角蛋白粉底物，分装备用。
2.角蛋白酶胶谱的制备
(1)分离胶的配制(含0.1％经预处理的角蛋白底物，此处以10ml分离胶为标准说明)
按《分子克隆实验指南》所述标准，配制浓度为12％的分离胶(依次加入ddH2O3.3ml，30％丙烯酰胺溶液4ml，1.5mol/LpH＝8.8Tris溶液2.5ml，10％SDS 50ul)，再加入经上述预处理的羽毛粉0.05-0.1g，采用磁力搅拌仪于室温下以100r/min低速搅拌1h，然后将溶液在2000g离心15min，去除未溶解杂质，取上清，按10ml分离胶中加入10％过硫酸铵100ul以及N,N,N',N'-四甲基二乙胺4ul的体积比例制备成混合溶液；
(2)浓缩胶的配制参照《分子克隆实验指南》所述标准，根据实验需求量配制即可。
3.电泳
酶样品根据非变性电泳样品制备标准来准备(不加入还原剂或不进行高温加热，以免破坏蛋白的高级结构)：酶样品按1:3与上样缓冲液(0.32％Tris-HCL 6.4ml，4％PH7.2SDS 8ml，16％甘油3.2ml，溴酚蓝0.024g，ddH2O 2.4ml)混合。按5-10ul/孔混合样品上样，于4℃条件下，进行SDS-PAGE电泳，80-100V恒压跑至分离胶和浓缩胶交界处后改为170-200V恒压，直至溴酚蓝跑出胶外。
4.水解条带显色
电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5％Triton X-100，50mM Tris-HCl，5mMCaCl2，1μM ZnCl2，pH7.6)中振荡洗脱2次，每次20-40min，以去除SDS。然后，用漂洗液(50mMTris-HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，pH7.6)漂洗2次，每次10-20min。接着，将凝胶置于孵育液(以下三种孵育液均可)中37℃孵育24-40h(孵育时间可根据目标酶的上样量与酶活性进行调整)。孵育结束后经染色液(0.05％考马斯亮蓝，甲醇30ml，乙酸10ml，ddH2O 60ml)染色(室温2–4h或4℃染色过夜)。最后，用脱色液A、B(甲醇：乙酸：去离子水分别为3:1:6和2:1:8)分别脱色0.5-1h、1-2h后，显示出被目标检测酶水解的地方呈无色透明条带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，以供进一步分析。
在水解条带步骤中，设置三个方案，分别采取以下三种孵育液：
A)50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.02％NaN3，0.05％Brij-35，pH 7.6；
B)0.1M柠檬酸48.5ml，0.2M NaHPO451.5 ml，pH 5.0；
C)50mM Tris-HCl，150mM NaCl，10mM CaCl2，0.02％NaN3，pH 7.5。
对比例1
参照实施例1的方法，在角蛋白底物预处理时不进行羽毛角蛋白底物的过筛，以及制备分离胶的低温低速搅拌和离心步骤，具体参照以下方法：
1.角蛋白底物预处理
(1)消煮和清洗晾干步骤参照实施例1
(2)研磨备用。
2.角蛋白酶胶谱的制备
(1)分离胶的配制(角蛋白底物消煮研磨后按0.1％的比例加入到分离胶溶液中制备浓度为12％的分离胶)
按《分子克隆实验指南》所述标准，配制浓度为12％的分离胶(依次加入ddH2O3.3ml，30％丙烯酰胺溶液4ml，1.5mol/L pH＝8.8Tris溶液2.5ml，10％SDS 50ul)，再加入经上述预处理的角蛋白底物0.05-0.1g，按10ml分离胶中加入10％过硫酸铵100ul以及N,N,N',N'-四甲基二乙胺4ul的体积比例制备成混合溶液。
(2)浓缩胶的配制参照《分子克隆实验指南》所述标准，根据实验需求量配制即可。
后续电泳步骤3和4参照实施例1。
实验例1
采用实施例1所述酶谱方法与对比例1所述《分子克隆实验指南》的传统酶谱方法对经层析纯化后的K.paraultunense厌氧菌角蛋白酶进行酶谱检测(角蛋白降解菌株K.paraultunense购自天津西玛科技有限公司)，比较两种方法的区分度与灵敏度。将厌氧菌K.paraultunense按5％-10％(v/v)接种于含1％(w/v)羽毛底物的发酵培养基中。然后，置于55℃培养24–48h，至羽毛完全降解。收集发酵液上清，12000rpm离心30min。接下来，上清经0.22μm滤膜，去除去除菌体，得到粗酶液。粗酶液样品依次经中空纤维柱浓缩和蛋白层析分离纯化得到角蛋白酶组分，并进行SDS-PAGE检测与角蛋白酶活性检测。经纯化后，SDS-PAGE结果显示纯化蛋白为20kDa大小的单一条带，酶活检测其酶活力为纯化前酶活的900倍以上。为了进一步确定纯化条带的角蛋白水解活性，取5-10μl角蛋白酶样品，按1:3的比例与上样缓冲液混合后，采用本专利实施例1的酶谱方法与对比例1的传统酶谱方法分别进行检测。
结果显示，采用本发明角蛋白酶酶谱检测方法，在K.paraultunense厌氧菌角蛋白酶大小相应位置有清晰的水解条带，如附图1所示，水解条带辨识度强、灵敏度高、结果准确，相对而言，加入角蛋白底物的传统酶谱检测方法区分度差、灵敏度低、角蛋白在聚丙烯酰胺凝胶中分布不均，导致水解区域难以辨别(附图1)。
实验例2酶谱检测不同蛋白酶抑制剂对K菌角蛋白酶的影响
为了进一步确定K.paraultunense厌氧菌角蛋白酶的酶学特性，分别用不同的蛋白酶抑制剂处理K.paraultunense厌氧菌角蛋白酶。发酵纯化步骤同上述实验例1，发酵液经纯化后，取5-10μl角蛋白酶样品，按1:3的比例与上样缓冲液混合后，利用实施例1所述方法进行角蛋白酶酶谱检测。其中，在水解条带显色过程中，孵育阶段分别在孵育液中加入四种常见蛋白酶抑制剂：10mM丝氨酸蛋白酶抑制剂-苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF)；10μM天冬氨酸蛋白酶抑制剂-胃酶抑素(pepstatinA)；10uM半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64；10mM金属蛋白酶抑制剂-乙二胺四乙酸(Ethylene DiamineTetraaceticAcid，EDTA)。
结果显示，仅丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF能特异性抑制K.paraultunense厌氧菌角蛋白酶的对角蛋白底物水解的酶活力，其他抑制剂均没有明显作用效果(附图2)。因此，根据本发明酶谱方法的实验结果，可以容易的判定K.paraultunense厌氧菌角蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。

Claims (6)

1.一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法，其包括：
1)角蛋白底物预处理，清除羽毛角蛋白上的杂质；
2)角蛋白胶谱的制备，包括制备分离胶和浓缩胶；
3)进行电泳和水解条带显色；
其特征在于：
(A)步骤1)中，将10g角蛋白底物和500ml有机溶剂加入回流冷凝装置中，于80-100℃消煮60-100min；用两倍体积经4℃预冷的丙酮沉淀角蛋白；离心收集角蛋白沉淀，清洗后于4℃晾干，将角蛋白沉淀晾干后，再进行研磨，过100目筛；
(B)在制备分离胶时，加入由(A)处理所得角蛋白底物，使得其质量百分含量为0.1％，然后于室温下以100r/min的速度搅拌1h，离心取上清，进行配置质量浓度为12％的分离胶；配置所述质量浓度为12％的分离胶时，其方法为：依次加入ddH2O 3.3ml，30％丙烯酰胺溶液4ml，1.5mol/L pH＝8.8的Tris溶液2.5ml，10％SDS 50ul，再加入经(A)处理所得角蛋白底物0.05-0.1g，于室温下以100r/min的速度搅拌1h，然后将溶液在2000g离心15min，取上清，按10ml分离胶中加入10％过硫酸铵100ul以及N,N,N',N'-四甲基二乙胺4ul的体积比例制备成混合溶液；
(C)在电泳时，酶样品按体积比1:3与上样缓冲液混合；按5-10ul/孔混合样品上样，于4℃条件下，进行SDS-PAGE电泳，80-100V恒压跑至分离胶和浓缩胶交界处后改为170-200V恒压，直至溴酚蓝跑出胶外；所述上样缓冲液的成分为：0.32％Tris-HCl 6.4ml，4％pH7.2SDS8ml，16％甘油3.2ml，溴酚蓝0.024g，ddH2O 2.4ml；
所述角蛋白底物包括羽毛；所述有机溶剂包括二甲基亚砜、乙二醇中的一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用丙酮沉淀角蛋白后，于2000g离心15min收集角蛋白沉淀，用去离子水重悬，清洗沉淀，于2000g离心15min收集沉淀，重复清洗一次后于4℃晾干。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙二醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，电泳结束后，将凝胶置于洗脱液中振荡洗脱2次，每次20-40min；然后，用漂洗液漂洗2次，每次10-20min；接着，将凝胶置于孵育液中37℃孵育24-40h；孵育结束后经染色液于室温染色2-4h或于4℃染色过夜；最后，用脱色液A和脱色液B分别脱色0.5-1h和1-2h；
所述脱色液A由甲醇、乙酸、去离子水按体积比3:1:6组成；
所述脱色液B由甲醇、乙酸、去离子水按体积比2:1:8组成。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述洗脱液为：2.5％Triton X-100，50mMTris-HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，pH7.6；所述漂洗液为：50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1μMZnCl2，pH7.6；所述染色液为：0.05％考马斯亮蓝，甲醇30ml，乙酸10ml，ddH2O 60ml。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述孵育液为下述孵育液中的一种：
1)50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.02％NaN3，0.05％Brij-35，pH 7.6；
2)0.1M柠檬酸48.5ml，0.2M NaHPO4 51.5ml，pH 5.0；
3)50mM Tris-HCl，150mM NaCl，10mM CaCl2，0.02％NaN3，pH 7.5。
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