CN102181515A - 一种测定sds敏感蛋白酶活力的酶谱方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定SDS敏感蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成。与Neutral-PAGE酶谱法相比，本方法不但能够很好的检测SDS敏感蛋白酶的活性，且能确定蛋白酶的分子量大小，并克服普通酶谱方法酶活条带易呈点状扩散，形成重叠的缺陷，提高酶谱的分辨率。
Description
技术领域
本发明属于生物蛋白酶检测技术领域，具体涉及一种测定SDS敏感蛋白酶活力的酶谱方法。
背景技术
酶谱法（zymography）是一种在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术的基础上通过特异性底物和丙烯酰胺共聚合来测定酶活性的电泳检测技术。明胶酶谱法是测定蛋白酶活性的一种常用手段，因该技术能测定多种降解明胶的蛋白酶活性，且具有方法简单、检测结果直观和定量等优点，近年来被广泛应用于生物蛋白酶检测技术领域。
然而，大量的检测数据显示该方法仍存在一些缺点。如：1、缺乏一种能够适用于多数蛋白酶的通用方法。2、缺乏特异性更高且能和丙烯酰胺偶联的底物。3、难以测定一些SDS敏感蛋白酶的活性。4、难以测定一些含碱性蛋白酶的组分的活性。
相关文献:
相关的美国专利包括：7，153，660 B2， US2003/0171271 A1。相关日本专利包括：JP20010023781， JP20010131， JP20040299951， JP20041014。相关文献包括： Choi NS et al.， 2006， J. Microbiol. Biotechnol. 16:457-464; Boonyaras Kim SH and Choi NS， 2000， Biosci.， Biotechnol.， Biochem. 64:1722-1725; Cristiane M.C. de Salles et al.， 2006， Anal. Biochem. 357:153-155; Christa Heussen and Eugene B. Dowdle， 1980， Anal. Biochem. 102:196-202; Eiichi Saitoh et al.， 2007， Anal. Chem. Insights 2:51-59; Choi NS and Kim SH， 2000， Anal. Biochem. 281(2):236-8; Choi NS et al.， 2005， J. Microbiol. Biotechnol. 15:35-39; Jeff Wilkesman and Liliana Kurz， 2009， Recent Pat. Biotechnol. 3:175-184; Choi NS et al.， 2009， Anal. Biochem. 386:121-122; Choi NS et al.， 2001， J. Biochem. Mol. Biol. 34:531-536;Choi NS et al.， 2003， J. Biochem. Mol. Biol. 37:298-303; PA Snoek-van Beurden and JW Von den Hoff， 2005， BIOTECHNIQUES 38:73-83; Choi NS et al.， 2005， J. Microbiol. Biotechnol. 15:537-543; R. Porcel et al.， 2001， J. Colloid Interface Sci. 239:568-576; A Granelli-Piperno and E Reich， 1978， J. Exp. Med.; TM Leber and FR Balkwill， 1997， 249:24-28; 骞爱荣等， 2003， 解放军医学杂志， 28：282-283; 姜微波等， 2002， 植物学通报， 19:607-610。
发明内容
技术问题：本发明的目的在于解决酶谱测定时SDS敏感酶活性难以检测的问题，提供了一种用来测定SDS敏感蛋白酶的明胶酶谱方法。
技术方案：一种测定SDS敏感蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成：聚丙烯酰胺凝胶I由3质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：（1）丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6.67%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%，pH 6.8;（2）浓缩胶缓冲液为 0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 6.8;聚丙烯酰胺凝胶II由3质量份丙烯酰胺混合溶液II和1质量份分离胶缓冲液组成，其中：丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为13.33%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%、明胶质量体积比0.133%，pH 8.8;分离胶缓冲液为 1.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 8.8;上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶I：聚丙烯酰胺凝胶II=2:5，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。
所述电泳缓冲液中含有0.5‰ SDS。
凝胶制好后，按照生物化学常规电泳方法制备所需要的其它溶液，并参照常规操作或根据情况适当调整进行蛋白酶电泳和酶谱分析。
本发明可以应用于微生物、植物和动物体中得到的SDS敏感蛋白酶或普通蛋白酶的电泳和酶谱分析。
有益效果：与Neutral-PAGE酶谱法相比，Neutral-PAGE酶谱法只能定性的观测蛋白酶活力，并不能准确测定蛋白酶的分子量大小。本方法不但能够很好的检测SDS敏感蛋白酶的活性，且能确定蛋白酶的分子量大小，并克服普通酶谱方法酶活条带易呈点状扩散，形成重叠的缺陷，提高酶谱的分辨率。
附图说明
图1 本方法测SDS敏感蛋白酶活性(泳道1) 和基于非变性凝胶电泳的蛋白酶谱测定SDS敏感蛋白酶活性(泳道2)结果比较。符号M下面的数字是蛋白质分子量标记，单位是千道尔顿（KD）。图1（泳道1）简称为图1（1），图1（泳道2）简称为图1（2）。
图2 酶谱测定层析纯化组分蛋白酶活性。符号M以下的蛋白条带为蛋白质分子量标记，图左边和符号M下面的蛋白条带对应的数字标记出了各蛋白条带的分子量大小。
图3 层析纯化组分SDS-PAGE图谱，作为图2的对照。符号M以下的蛋白条带为蛋白质分子量标记，图左边和符号M下面的蛋白条带对应的数字标记出了各蛋白条带的分子量大小。
图4 三株高温菌胞外蛋白酶的酶谱比较。（a）图为使用本方法检测得到的结果，（b）为使用基于SDS变性蛋白电泳（SDS-PAGE）的酶谱方法检测得到的结果。
具体实施方式
实施例中所述的质量体积比单位为g/mL，体积比单位为mL/mL。
实施例1：
现采用该方法，对一株芽胞杆菌分泌的SDS敏感蛋白酶的粗酶液进行了酶谱检测，比较了不同方法对该菌株的发酵液进行酶谱分析的差异，作为该方法检测实例。
菌株：一株地衣芽孢杆菌（CGMCC No.1.807），这些菌株均为普通微生物保藏中心可以购买到的菌株。
培养条件：55℃培养24小时。发酵产酶条件：基础培养基30℃培养48小时左右。
样品制备：用基础培养基发酵地衣芽孢杆菌（CGMCC No.1.807），培养48小时后将菌液离心收集粗酶液。粗酶液蛋白组分对SDS敏感，用普通SDS-PAGE进行酶谱实验后无法正常检测到蛋白酶活性。
蛋白酶活性检测：
1、聚丙烯酰胺凝胶的配制:
a. 聚丙烯酰胺凝胶I由3质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：
（1）丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6.67%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%。
（2）浓缩胶缓冲液为 0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 6.8。
b. 聚丙烯酰胺凝胶II由3质量份丙烯酰胺混合溶液II和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：
（1）丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为13.33%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%、明胶质量体积比0.133%。
（2）分离胶缓冲液为 0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 8.8。
c. 上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶I：聚丙烯酰胺凝胶II=2:5，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。
2、凝胶制好后，取粗酶液样品与样品缓冲液(样品缓冲液由蔗糖、溴酚蓝、Tris-HCl组成，该溶液中蔗糖质量体积比为2％，溴酚蓝质量体积比为0.2％； Tris碱质量体积比为0.6%，pH 6.8)按一比一混合均匀后点样。上样后，将冰浴的电泳槽放入4℃冰箱，以60V电压使样品压成一条直线并进入分离胶，然后将电压增至100V，继续电泳至溴酚蓝前沿泳出分离胶时，停止电泳。取下凝胶，将胶置于洗脱液(该溶液由聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、CaCl2、Tris-HCl组成，其中Triton X-100质量体积比为2.5%， Tris碱质量体积比为0.6%，CaCl2质量体积比为0.05%，pH7. 5) 中振荡洗脱2次，每次30分钟，然后用漂洗液(除不含Triton X-100外其余同洗脱液) 漂洗2次，每次10分钟，接着， 将胶置于孵育液(该溶液由CaCl2、NaCl、Tris-HCl组成，其中CaCl2质量体积比为0.05%，Tris碱质量体积比为0.6% NaCl质量体积比为0.87% ，pH7.5)中55℃恒温孵育2-3h。孵育结束后经染色液(该溶液由考马斯亮蓝、甲醇、冰乙酸组成，其中考马斯亮蓝质量体积比为0.1%、甲醇质量体积比为45%、乙酸质量体积比为10%)染色20min，及脱色液A、B(甲醇体积浓度分别为30%、20% ，乙酸体积浓度分别为10%、10%)分别脱色0.5h、1h后，显示出蛋白酶为位于深色背景上的清晰透亮条带。于凝胶成像系统进行图像采集见图1（1）。同时，使用基于非变性凝胶电泳（Neutral-PAGE）的酶谱法测定该蛋白样品，作为图1（1）的对照见图1（2）。由图1(1)和(2)中蛋白条带的差异，可见基于非变性蛋白电泳(Neutral-PAGE)的酶谱法得到的条带要少于本方法，这是由于在非变性凝胶电泳过程中一些蛋白会从点样口逃逸。
实施例2：
现采用该方法，对一株芽胞杆菌分泌的SDS敏感蛋白酶经离子层析柱纯化后的SDS敏感组分进行了酶谱检测和变性蛋白质电泳(SDS-PAGE)分析，比较了不同方法对该SDS敏感组分分析的差异，作为该方法检测实例。
菌株：一株地衣芽孢杆菌（CGMCC No.1.807），这些菌株均为普通微生物保藏中心可以购买到的菌株。
培养条件：55℃培养24小时。发酵产酶条件：基础培养基30℃培养48小时左右。
样品制备：用基础培养基发酵地衣芽孢杆菌（CGMCC No.1.807），培养48小时后将菌液离心收集粗酶液。粗酶液经硫酸铵沉淀后，通过离子交换层析分离到耐热蛋白酶组分。经层析得到的蛋白组分对SDS敏感，用普通SDS-PAGE进行酶谱实验后无法正常检测到蛋白酶活性。
蛋白酶活性检测：
1、聚丙烯酰胺凝胶的配制:
a. 聚丙烯酰胺凝胶I由3质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：
（1）丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6.67%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%。
（2）浓缩胶缓冲液为 0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 6.8。
b. 聚丙烯酰胺凝胶II由3质量份丙烯酰胺混合溶液II和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：
（1）丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为13.33%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%、明胶质量体积比0.133%。
（2）分离胶缓冲液为 0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 8.8。
c. 上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶I：聚丙烯酰胺凝胶II=2:5，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。
2、凝胶制好后，取层析样品5μL、10μL、20μL分别与样品缓冲液(2％wt蔗糖，0.2％wt溴酚蓝，50mmol/L Tris-HCl，pH 6.8)按一比一混合均匀后点样。上样后，将冰浴的电泳槽放入4℃冰箱，以60V电压使样品压成一条直线并进入分离胶，然后将电压增至100V，继续电泳至溴酚蓝前沿泳出分离胶时，停止电泳。取下凝胶，将胶置于洗脱液(该溶液由聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、CaCl2、Tris-HCl组成，其中Triton X-100质量体积比为2.5%， Tris碱质量体积比为0.6%，CaCl2质量体积比为0.05%，pH7. 5) 中振荡洗脱2次，每次30分钟，然后用漂洗液(除不含Triton X-100外其余同洗脱液) 漂洗2次，每次10分钟，接着， 将胶置于孵育液(该溶液由CaCl2、NaCl、Tris-HCl组成，其中CaCl2质量体积比为0.05%，Tris碱质量体积比为0.6% NaCl质量体积比为0.87% ，pH7.5)中55℃恒温孵育2-3h。孵育结束后经染色液(该溶液由考马斯亮蓝、甲醇、冰乙酸组成，其中考马斯亮蓝质量体积比为0.1%、甲醇质量体积比为45%、乙酸质量体积比为10%)染色20min，及脱色液A、B(甲醇体积浓度分别为30%、20% ，乙酸体积浓度分别为10%、10%)分别脱色0.5h、1h后，显示出蛋白酶为位于深色背景上的清晰透亮条带。于凝胶成像系统进行图像采集见图2。同时，使用变性凝胶电泳（SDS-PAGE）检测该蛋白组分，作为图2的对照见图3。图2泳道3、2、1中的蛋白均为通过离子交换层析分离到耐热蛋白酶组分，该组分对SDS敏感，样品上样量分别为5μL、10μL、20μL。图2泳道3、2、1分别对应图3泳道1、2、3，可以明显的发现本方法中蛋白酶条带的亮度和蛋白酶的上样量有很好的正相关性。同时， SDS-PAGE对照上的蛋白质分子量标记（图3 泳道M.MASS）和本方法中的蛋白质分子量标记（图2泳道M.MASS）位置完全一致。非变性蛋白电泳(Neutral-PAGE)酶谱法只能定性的观测蛋白酶活力，并不能准确测定蛋白酶的分子量大小。由图2和图3可见本方法不但能够很好的检测SDS敏感蛋白酶的活性，且能确定蛋白酶的分子量大小。
实施例3：
现采用该方法，对3株高温菌分泌的受到0.1%质量体积比SDS强烈抑制的蛋白酶粗酶液进行酶谱检测，比较了不同方法对该菌株的发酵液进行酶谱分析的差异，作为该方法检测实例。
菌株：3株地衣芽孢杆菌（CGMCC No.1.265）、枯草芽孢杆菌（CGMCC No.1.892）和枯草芽孢杆菌（CGMCC No.1.354），这些菌株均为普通微生物保藏中心可以购买到的菌株。
培养条件：55℃培养24小时。发酵产酶条件：基础培养基30℃培养48小时左右。
样品制备：用基础培养基发酵地衣芽孢杆菌（CGMCC No.1.265）、枯草芽孢杆菌（CGMCC No.1.892）和枯草芽孢杆菌（CGMCC No.1.354），培养48小时后将菌液离心收集粗酶液。粗酶液经0.1%质量体积比SDS，分别残留20.73%、19.91%、9.07%的活力。
蛋白酶活性检测：
1、聚丙烯酰胺凝胶的配制:
a. 聚丙烯酰胺凝胶I由3质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：
（1）丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6.67%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%。
（2）浓缩胶缓冲液为 0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 6.8。
b. 聚丙烯酰胺凝胶II由3份丙烯酰胺混合溶液II和1份浓缩胶缓冲液组成，其中：
（1）丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为13.33%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%、明胶质量体积比0.133%。
（2）分离胶缓冲液为 0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 8.8。
c. 上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶I：聚丙烯酰胺凝胶II=2:5，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。
2、凝胶制好后，取层析样品5μL、10μL、20μL分别与样品缓冲液(2％wt蔗糖，0.2％wt溴酚蓝，50mmol/L Tris-HCl，pH 6.8)按一比一混合均匀后点样。上样后，将冰浴的电泳槽放入4℃冰箱，以60V电压使样品压成一条直线并进入分离胶，然后将电压增至100V，继续电泳至溴酚蓝前沿泳出分离胶时，停止电泳。取下凝胶，将胶置于洗脱液(该溶液由聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、CaCl2、Tris-HCl组成，其中Triton X-100质量体积比为2.5%， Tris碱质量体积比为0.6%，CaCl2质量体积比为0.05%，pH7. 5) 中振荡洗脱2次，每次30分钟，然后用漂洗液(除不含Triton X-100外其余同洗脱液) 漂洗2次，每次10分钟，接着， 将胶置于孵育液(该溶液由CaCl2、NaCl、Tris-HCl组成，其中CaCl2质量体积比为0.05%，Tris碱质量体积比为0.6% NaCl质量体积比为0.87% ，pH7.5)中55℃恒温孵育2-3h。孵育结束后经染色液(该溶液由考马斯亮蓝、甲醇、冰乙酸组成，其中考马斯亮蓝质量体积比为0.1%、甲醇质量体积比为45%、乙酸质量体积比为10%)染色20min，及脱色液A、B(甲醇体积浓度分别为30%、20% ，乙酸体积浓度分别为10%、10%)分别脱色0.5h、1h后，显示出蛋白酶为位于深色背景上的清晰透亮条带。于凝胶成像系统进行图像采集见图4（a）。同时，使用基于SDS变性凝胶电泳（SDS-PAGE）的酶谱法测定该蛋白样品，作为图4（a）的对照见图4（b）。比较图4（a）和图4（b）我们可以发现，改进型明胶酶谱的效果明显要优于基于SDS-PAGE的明胶酶谱，特别是对受到SDS强烈抑制的蛋白酶，如枯草芽孢杆菌（CGMCC No.1.892）和枯草芽孢杆菌（CGMCC No.1.354），效果更加明显。增加蛋白酶的上样量可以抵消一部分SDS的影响，但是基于SDS-PAGE的酶谱方法依然受到其最高上样量的限制，进一步浓缩蛋白费时费力。特别是遇到特别不耐受SDS的蛋白酶如枯草芽孢杆菌（CGMCC No.1.892），增加上样量的方法也无法应对。同时，我们还能发现，图4(a)条带的形状要明显优于图4（b），这表明普通酶谱方法酶活条带易呈点状扩散，形成重叠，降低酶谱的分辨率。
Claims (2)
1.一种测定SDS敏感蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，其特征在于电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成：
a. 聚丙烯酰胺凝胶I由3质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：
（1）丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6.67%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%，pH 6.8;
（2）浓缩胶缓冲液为 0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 6.8;
b. 聚丙烯酰胺凝胶II由3质量份丙烯酰胺混合溶液II和1质量份分离胶缓冲液组成，其中：
（1）丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为13.33%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%、明胶质量体积比0.133%，pH 8.8;
（2）分离胶缓冲液为 1.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 8.8;
c. 上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶I：聚丙烯酰胺凝胶II=2:5，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。
2.根据权利要求1所述的测定SDS敏感蛋白酶活力的酶谱方法，其特征在于电泳缓冲液中含有0.5‰ SDS。
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