CN104698057B - 一种可确定抑菌蛋白质片段分子量的抑菌实验方法 - Google Patents
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Abstract
一种可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，涉及微生物技术领域；制备试剂、分离胶和浓缩胶后，对进行抑菌实验的蛋白质进行蛋白质电泳，所得蛋白质电泳胶片进行脱色、染色，成像观察蛋白质分子量大小后，用于做抑菌实验；将蛋白质电泳胶片进行放入PBS缓冲液中平衡10min后，置于琼脂培养皿中；取处于对数生长期的菌液加入到50℃的营养琼脂培养基中，得到体积浓度为1%的菌液；取所得菌液倒入放有脱色后蛋白质电泳胶片的培养皿中,观察培养基中菌体生长情况，并确定抑菌效果好的蛋白质片段分子量的大小。本发明采用一种操作简单、准确、快速、廉价的方法来确定具有抑菌效果蛋白质片段分子量的大小，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体说是涉及一种可确定抑菌蛋白质片段分子量的抑菌实验方法。
背景技术
用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。通过抑菌实验,可以测定一种药物的最低抑菌浓度,用以评价该药物的抑菌性能,这是抗菌药物的最基本的药效学数据。主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。常用方法有常量肉汤稀释法、微量肉汤稀释法、琼脂稀释法、纸片扩散法和E试验（浓度梯度琼脂扩散试验）。
抑菌圈法是衡量杀菌防霉剂效果的一种方式，主要用于测定杀菌防霉剂对细菌、霉菌、酵母菌的抑菌作用，是定性或半定量的方法。通过杀菌防霉剂在琼脂平板上的扩散能力来初步筛选更有效的杀菌防霉剂品种。但是目前的抑菌圈法，不能确定有抑菌作用蛋白质的片段大小，后期实验有较多的不便，需对每个片段大小的蛋白质做抑菌试验，然后再对目的蛋白进行纯化，工作量极大，而且杂蛋白的存在对试验结果也有一定的影响，影响试验数据的准确性。因此建立一种快速、准确、简单的抑菌实验方法来确定抑菌蛋白质的片段大小有非常重要的意义。
发明内容
本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种可确定抑菌蛋白质片段分子量的抑菌实验方法，其可在观察蛋白质抑菌效果的同时快速、准确确定抑菌蛋白质的片段分子量的大小，且实验方法简单、容易操作。
一种可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，包括以下步骤：
步骤一、试剂和缓冲液的配制：
1)、染色液：称取0.25g考马斯亮蓝R-250置于容器中，加入225ml甲醇和46ml冰醋酸，搅拌至溶解后加超纯水定容至500ml，混合均匀，备用；
2）、脱色液：分别量取37.5ml冰醋酸和25ml甲醇置于容器中，加超纯水定容至500ml，混合均匀，备用；
3）、电极缓冲液：分别称取3.0g三羟甲基氨基甲烷、18.8g甘氨酸和1.0g十二烷基硫酸钠溶液置于容器中，加入超纯水搅拌溶解后，定容至1000ml，混合均匀，备用；
4）、上样缓冲液：分别称取1.0g十二烷基硫酸钠和0.02g溴酚蓝置于容器中，然后向容器中加入16ml甘油、1ml 的1.0mol/L pH6.8三羟甲基氨基甲烷-盐酸和1ml的β-巯基乙醇，混合均匀，加入超纯水搅拌溶解后定容至100ml，混合均匀，采用离心管分装，置于4℃保存；
5）、PBS缓冲液：分别称取8.0g NaCl、0.24g KH2PO、0.2g KCl和3.36g
Na2HPO4.12H2O置于容器中，加入900mL去离子水，搅拌至完全溶解后，调节pH至7.4，加入去离子水定容到1L，然后置于121℃高温灭菌20min，冷却至室温，备用；
6）、12%分离胶溶液：每10ml的12%分离胶溶液中含有30%丙烯酰胺混合溶液 4.0ml，1.5mol/L的pH8.8三羟甲基氨基甲烷-盐酸2.5 ml，质量分数为10%的十二万基硫酸钠溶液0.1 ml，质量分数为10%的过硫酸铵溶液0.1 ml，四甲基乙二胺0.004 ml、去离子水3.3ml和尿素3g；其中，所述30%丙烯酰胺混合溶液的配制方法为，取丙烯酰胺30g和双丙烯酰胺0.8g置于容器中，然后加入100ml去离子水搅拌至完全溶解，即得到30%丙烯酰胺混合溶液；
7）、5 %浓缩胶溶液：每5ml的5 %浓缩胶溶液中含有30%丙烯酰胺混合溶液0.83ml，1.5mol/L的pH8.8三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.63 ml，质量分数为10%的十二万基硫酸钠溶液0.05 ml，质量分数为10%的过硫酸铵溶液0.05 ml，四甲基乙二胺0.004 ml和去离子水3.4 ml；所述30%丙烯酰胺混合溶液的配制方法为，取丙烯酰胺30g和双丙烯酰胺0.8g置于容器中，然后加入100ml去离子水搅拌至完全溶解，即得到30%丙烯酰胺混合溶液；
步骤二、分别灌注12%分离胶溶液和5 %浓缩胶溶液制备12%分离胶和5%浓缩胶，备用；
步骤三、将蛋白质样品和蛋白质标准品分别与上样缓冲液按照体积比1:1的比例混合均匀后，均置于水浴锅中100℃水浴5分钟，自然冷却至室温，备用；
步骤四、上样：采用微量进样器将蛋白质样品与蛋白质标准品分别加入到浓缩胶上的加样孔内，加入量为20μL/孔；浓缩胶上的空加样孔应采用20μL的上样缓冲液灌注，以保证电流在胶中分布均匀；
步骤五、电泳：盖上电泳槽盖，连接电泳仪，接通电源，调节电压使蛋白质样品和蛋白质标准品在浓缩胶中时控制电压为80V，当蛋白质样品和蛋白质标准品进入分离胶后的电压为100V，电泳至溴酚蓝指示带接近分离胶底部1-1.5cm时断开电源，停止电泳，取出蛋白质电泳胶片，备用；
步骤六、电泳结果检测：采用染色液对蛋白质电泳胶片进行染色后，用脱色液进行脱色，然后进行成像拍照；通过蛋白质样品与蛋白质标准品条带的对比得知样品蛋白质的分子量大小；将已经检测过的脱色后蛋白质电泳胶片保存，备用；
步骤七、脱色后蛋白质电泳胶片做抑菌实验：
1）、在已灭菌的培养皿中倒入10ml 灭菌的质量分数为2%的琼脂进行封底；所述质量分数为2%的琼脂，每100ml去离子水中含有2g琼脂；
2）、将脱色后蛋白质电泳胶片放入PBS缓冲液中平衡10min，然后置于倒入质量分数为2%的琼脂的培养皿中；
3）、取2ml处于对数生长期的菌液加入到50℃的200ml营养琼脂培养基中，轻轻摇匀后，得到体积浓度为1%的菌液；所述营养琼脂培养基含有质量分数为 1%的蛋白质胨、质量分数为 0.3%的牛肉膏粉、质量分数为 0.5%的NaCl和质量分数为 1.5%的琼脂，余量为水；
4）、取30ml体积浓度为1%的菌液倒入放有脱色后蛋白质电泳胶片的培养皿中；然后置于37℃培养12h，观察菌体生长情况，并确定抑菌效果好的蛋白质片段分子量的大小。
所述灌注12%分离胶溶液的方法为：用移液枪将配制好12%的分离胶溶液反复吹打5次，使分离胶溶液混合均匀；用移液枪将混匀后的分离胶溶液灌入到电泳槽中由高板和矮板组成的玻璃腔中，灌注高度为矮板高度的3/5，灌胶完成后，立即向玻璃腔中加满去离子水压平分离胶界面，待分离胶溶液凝结完全，即得到12%分离胶；倒去分离胶顶部的去离子水，并用滤纸吸干残余水分。
所述5 %浓缩胶的灌注方法为：用移液枪将配制好5 %浓缩胶溶液反复吹打5次，使浓缩胶溶液混合均匀；用移液枪将混匀后的浓缩胶溶液灌入到分离胶顶部，灌至距离矮板顶部0.5cm停止，然后将样品槽模板插入浓缩胶中，并保证样品槽模板底部无气泡产生，静置40min，待浓缩胶溶液完全凝结，拔出样品槽模板，形成加样孔；用去离子水加入到加样孔中倒出；然后调换玻璃腔使矮板向里，再用固定板将玻璃腔固定，即得到5 %浓缩胶；接着，向电泳槽内加入电极缓冲液。
所述样品槽模板为电泳梳。
所述将采用染色液对蛋白质电泳胶片进行染色后，用脱色液进行脱色的具体操作方法为：将蛋白质电泳胶片置于培养皿中，加入染色液，染色2h后倒掉染色液，用蒸馏水清洗几次后，加入脱色液，在摇床上脱色12h，每4h更换一次脱色液，直至电泳条带清晰可见。
所述步骤六采用凝胶成像仪对蛋白质电泳胶片进行成像拍照。
有益效果是：
1、本发明利用重组DNA或重组RNA的技术而诱导表达的具有抑菌效果的蛋白质，其发酵液中可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究目的蛋白质的抑菌效果，传统的方法是首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来，然后再进行抑菌试验。蛋白质的初纯化主要有超滤、盐析、等电点沉淀、双水相萃取等，目前广泛应用的蛋白质纯化方法主要是液相层析，这些方法不仅操作复杂、耗时、耗力需要各种大型实验仪器，而且纯化会或多或少的影响多肽的活性。然而用粗蛋白质跑SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经济、快速、不易破坏蛋白质的结构，用其电泳胶片做抑菌试验，不仅可以有效分离目的蛋白质和杂蛋白质，还能直观的反映目的蛋白质的抑菌效果。该方法简单易于操作无需大型仪器还能节省大量时间。
2、本发明还改进了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶的配方，不仅可以有效分离大分子蛋白质而且对于小分子蛋白质也可进行分离。即本发明蛋白质电泳根据抑菌实验而设计，其中分离胶中添加了尿素，加入尿素后有利于小分子蛋白质的分离，而且相对于Tricine-SDS-PAGE方法简单易于操作。采用蛋白质电泳胶片做抑菌实验能够快速确定具有抑菌效果蛋白质片段分子量的大小，方便后续实验的进行，可以根据目的蛋白片段的大小，对其进行纯化，减少杂蛋白对试验结果的影响，为后续与抗生素的联合抑菌试验、对动物生长及免疫机能的影响做基础。本发明采用一种操作简单、准确、快速、廉价的方法来确定具有抑菌效果蛋白质片段分子量的大小，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1中康肽宝电泳胶片对产肠毒大肠杆菌的抑菌效果图；
图中标记：1、2、3、4为康肽宝的泳道；
图2是本发明实施例1的康肽宝的蛋白质电泳图；
图中标记：1为上样缓冲液的阴性对照；2、3、4为康肽宝的泳道；M为蛋白质标准品的电泳条带；
图3是本发明实施例2中康肽宝电泳胶片对金黄色葡萄球菌的抑菌图；
图中标记：2、3、4、5、6、7、8、9、10是康肽宝的泳道；1为上样缓冲液的阴性对照；
图4是本发明实施例2中康肽宝的蛋白质电泳图；
图中标记：M为蛋白质标准品的电泳条带;1、2、3、4、5、6、7、8、9为康肽宝的泳道。
具体实施方式
一种可确定抑菌蛋白质片段分子量的抑菌实验方法，包括以下步骤：
步骤一、试剂和缓冲液的配制：
1)、染色液：称取0.25g考马斯亮蓝R-250置于容器中，加入225ml甲醇和46ml冰醋酸，搅拌至溶解后加超纯水定容至500ml，混合均匀，备用；
2）、脱色液：分别量取37.5ml冰醋酸和25ml甲醇置于容器中，加超纯水定容至500ml，混合均匀，备用；
3）、电极缓冲液：分别称取3.0g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、18.8g甘氨酸和1.0g十二烷基硫酸钠溶液（SDS）置于容器中，加入超纯水溶解后，定容至1000ml，混合均匀，备用；
4）、上样缓冲液：分别称取1.0g十二烷基硫酸钠（SDS）和0.02g溴酚蓝置于容器中，然后向容器中加入16ml甘油、1ml的1.0mol/L的pH6.8三羟甲基氨基甲烷（Tris） -盐酸（HCL）和1ml的β-巯基乙醇混合均匀后，加入超纯水溶解，定容至100ml，混合均匀，采用离心管分装，置于4℃保存；
5）、PBS缓冲液：分别称取8.0g NaCl、0.24g KH2PO、0.2g KCl和3.36g
Na2HPO4.12H2O置于容器中，加入900mL去离子水，搅拌至完全溶解后，调节pH至7.4，加入去离子水定容到1L，然后置于121℃高温灭菌20min，冷却至室温，备用；
6）、12%分离胶溶液：每10ml的12%分离胶溶液中含有30%丙烯酰胺混合溶液 4.0ml，1.5mol/L的pH8.8三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸（HCL）2.5 ml，质量分数为10%的十二万基硫酸钠溶液（SDS）0.1 ml，质量分数为10%的过硫酸铵溶液（AP）0.1 ml，四甲基乙二胺（TEMED）0.004 ml、去离子水3.3 ml和尿素3g；其中，所述30%丙烯酰胺混合溶液的配制方法为，取丙烯酰胺（Acr）30g和双丙烯酰胺0.8g置于容器中，然后加入100ml去离子水搅拌至完全溶解，即得到30%丙烯酰胺混合溶液；
7）、5 %浓缩胶溶液：每5ml的5 %浓缩胶溶液中含有30%丙烯酰胺混合溶液0.83ml，1.5mol/L的pH8.8三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸（HCL）0.63 ml，质量分数为10%的十二万基硫酸钠溶液（SDS）0.05 ml，质量分数为10%的过硫酸铵溶液（AP）0.05 ml，四甲基乙二胺（TEMED）0.004 ml和去离子水3.4 ml；所述30%丙烯酰胺混合溶液的配制方法为，取丙烯酰胺（Acr）30g和双丙烯酰胺0.8g置于容器中，然后加入100ml去离子水搅拌至完全溶解，即得到30%丙烯酰胺混合溶液。
步骤二、灌注浓缩胶和分离胶
1）、12%分离胶的灌注：
所述灌注12%分离胶溶液的方法为：用移液枪将配制好12%的分离胶溶液反复吹打5次（吹打过程中避免出现气泡），使分离胶溶液混合均匀；用移液枪将混匀后的分离胶溶液灌入到电泳槽中由高板和矮板组成的玻璃腔中，灌注高度约为矮板高度的3/5，灌胶完成后，立即向玻璃腔中加满去离子水压平分离胶界面，待分离胶溶液凝结完全，即得到12%分离胶；倒去分离胶顶部的去离子水，并用滤纸吸干残余水分。
2）、5 %浓缩胶的灌注：
用移液枪将配制好5 %浓缩胶溶液反复吹打5次（吹打过程中避免出现气泡），使浓缩胶溶液混合均匀；用移液枪将混匀后的浓缩胶溶液灌入到分离胶顶部，灌至距离矮板顶部0.5cm停止，然后将样品槽模板插入浓缩胶中，并保证梳子底部无气泡产生，静置约40min，待浓缩胶溶液完全凝结，拔出梳子，形成加样孔；用去离子水加入到加样孔中倒出；然后调换玻璃腔使矮板向里，再用固定板将玻璃腔固定，即得到5 %浓缩胶；接着，向电泳槽内加入电极缓冲液。
步骤三、样品处理：将蛋白质样品和蛋白质标准品分别与上样缓冲液按照体积比1:1的比例混合均匀后，均置于水浴锅中100℃水浴5分钟，自然冷却至室温，备用；
步骤四、上样：采用微量进样器将蛋白质样品与蛋白质标准品分别加入到浓缩胶上的加样孔内，加入量为20μL/孔；浓缩胶上的空加样孔应采用20μL的上样缓冲液灌注，以保证电流在胶中分布均匀；
步骤五、电泳：盖上电泳槽盖，连接电泳仪，接通电源，调节电压使样品在浓缩胶中时控制电压为80V，当样品进入分离胶后的电压为100V，电泳至溴酚蓝指示带接近分离胶底部1-1.5cm时断开电源，停止电泳，取出蛋白质电泳胶片，备用；
步骤六、电泳结果检测：将蛋白质电泳胶片取出置于培养皿中，加入染色液，染色约2h后倒掉染色液，用蒸馏水反复清洗几次后，加入适量脱色液，在摇床上脱色约12h，每4h更换一次脱色液，直至电泳条带清晰可见，用凝胶成像仪成像拍照，可清晰的显示蛋白质样品和蛋白质标准品的电泳条带，通过蛋白质样品与蛋白质标准品条带的对比可以得知样品蛋白质的分子量大小；将已经检测过的脱色后蛋白质电泳胶片保存，备用；
步骤七、脱色后蛋白质电泳胶片做抑菌实验：
1）、在已灭菌的培养皿中倒入10ml 灭菌的质量分数为2%的琼脂进行封底；所述质量分数为2%的琼脂，每100ml去离子水中含有2g琼脂；
2）、将脱色后蛋白质电泳胶片放入PBS缓冲液中平衡10min，然后置于倒入质量分数为2%的琼脂的培养皿中；
3）、取2ml处于对数生长期的菌液加入到50℃的200ml营养琼脂培养基中，轻轻摇匀后，得到体积浓度为1%的菌液；所述营养琼脂培养基含有质量分数为 1%的蛋白质胨、质量分数为 0.3%的牛肉膏粉、质量分数为 0.5%的NaCl和质量分数为 1.5%的琼脂，余量为水；
4）、取30ml体积浓度为1%的菌液倒入放有脱色后蛋白质电泳胶片的培养皿中；然后置于37℃培养12h，观察菌体生长情况，并确定抑菌效果好的蛋白质片段分子量的大小。
实施例1 康肽宝对产肠毒大肠杆菌的抑菌效果实验：
康肽宝对产肠毒大肠杆菌的抑菌效果实验方法，包括以下步骤：
步骤一、按表1配制12%分离胶和5%浓缩胶，备用；
表1 聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶和分离胶的配制
步骤二、分离胶和浓缩胶分别灌注后，向电泳槽内加入适量电极缓冲液，保证电泳槽内无气泡存在。然后用微量进样器将康肽宝与标准蛋白质加入相应的孔内，加样量为20μL，空位孔应以20μL的上样缓冲液灌注，以保证电流在胶中分布均匀。
步骤三、调节电压使样品在浓缩胶中时控制电压为80V，当样品进入分离胶后调节电压为100V, 电泳至溴酚蓝指示带接近分离胶底部时断开电源，停止电泳。
步骤四、将蛋白质电泳胶片取出置于培养皿中，加入染色液，染色约2h后倒掉染色液，用蒸馏水反复清洗几次后，加入适量脱色液，在摇床上脱色约12h，每4h更换一次脱色液，直至电泳条带清晰可见。所得脱色后蛋白质电泳胶片保存，备用；
步骤五、蛋白质电泳胶片做抑菌实验：
1）、在已灭菌的培养皿中倒入10ml 2%琼脂进行封底。蛋白质电泳胶片放入PBS缓冲液中平衡10min，放入含有琼脂的培养皿中。
2）、取2ml处于对数生长期的产肠毒大肠杆菌菌液加入到冷却至50℃的200ml营养琼脂培养基中，轻轻摇匀，避免产生气泡，得到体积浓度为1%的产肠毒大肠杆菌菌液。
3）、用50ml带刻度的灭菌离心管量取30ml体积浓度为1%的产肠毒大肠杆菌菌液倒入放有蛋白质电泳胶片的培养皿中,观察培养基中菌体生长情况。蛋白质电泳胶片中含有康肽宝的部分出现抑菌圈。
实验结果如图1和图2所示，从图中可以明显看出康肽宝对产肉毒大肠杆菌的抑菌片段位置，通过与蛋白质标准品对比可以得知有抑菌效果的活性成分的分子量范围在：31kD-97.4kD。
实施例2 康肽宝对鸡大肠杆菌的抑菌实验
康肽宝对鸡大肠杆菌的抑菌实验，包括以下步骤：
步骤一、按表1配制12%分离胶和5%浓缩胶，并分别进行灌注后，向电泳槽内加入适量电极缓冲液，保证电泳槽内无气泡存在。然后用微量进样器将康肽宝与标准蛋白质加入相应的孔内，加样量为20μL，空位孔应以20μL的上样缓冲液灌注，以保证电流在胶中分布均匀。
步骤二、调节电压使样品在浓缩胶中时控制电压为80V，当样品进入分离胶后调节电压为100V, 电泳至溴酚蓝指示带接近分离胶底部时断开电源，停止电泳。
步骤三、将胶取出置于培养皿中，加入染色液，染色约2h后倒掉染色液，用蒸馏水反复清洗几次后，加入适量脱色液，在摇床上脱色约12h，每4h更换一次脱色液，直至电泳条带清晰可见。所得脱色后蛋白质电泳胶片保存，备用；
步骤四、在已灭菌的培养皿中倒入10ml 2%琼脂进行封底，蛋白质电泳胶片放入PBS缓冲液中平衡10min，放入含有琼脂的培养皿中。
步骤五、蛋白质电泳胶片做抑菌实验：
1）、在已灭菌的培养皿中倒入10ml 2%琼脂进行封底。蛋白质电泳胶片放入PBS缓冲液中平衡10min，放入含有琼脂的培养皿中，得到放有蛋白质电泳胶片的培养皿；
2）、取2ml处于对数生长期的鸡大肠杆菌菌液加入到冷却至50℃的200ml营养琼脂培养基中，轻轻摇匀，避免产生气泡，得到体积浓度为1%的鸡大肠杆菌菌液。
3）、用50ml带刻度的灭菌离心管量取30ml体积浓度为1%的鸡大肠杆菌菌液倒入放有蛋白质电泳胶片的培养皿中,观察培养基中菌体生长情况。蛋白质电泳胶片中含有康肽宝的部分出现抑菌圈。
实验结果如图3和图4所示，从图中可以明显看出康肽宝对鸡大肠杆菌的抑菌片段位置，通过与蛋白质标准品对比可以得知有抑菌效果的活性成分的分子量范围在：31kD-97.4kD。
Claims (5)
1.一种可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、试剂和缓冲液的配制：
1)、染色液：称取0.25g考马斯亮蓝R-250置于容器中，加入225ml甲醇和46ml冰醋酸，搅拌至溶解后加超纯水定容至500ml，混合均匀，备用；
2）、脱色液：分别量取37.5ml冰醋酸和25ml甲醇置于容器中，加超纯水定容至500ml，混合均匀，备用；
3）、电极缓冲液：分别称取3.0g三羟甲基氨基甲烷、18.8g甘氨酸和1.0g十二烷基硫酸钠溶液置于容器中，加入超纯水搅拌溶解后，定容至1000ml，混合均匀，备用；
4）、上样缓冲液：分别称取1.0g十二烷基硫酸钠和0.02g溴酚蓝置于容器中，然后向容器中加入16ml甘油、1ml 的1.0mol/L pH6.8三羟甲基氨基甲烷-盐酸和1ml的β-巯基乙醇，混合均匀，加入超纯水搅拌溶解后定容至100ml，混合均匀，采用离心管分装，置于4℃保存；
5）、PBS缓冲液：分别称取8.0g NaCl、0.24g KH2PO、0.2g KCl和3.36g
Na2HPO4.12H2O置于容器中，加入900mL去离子水，搅拌至完全溶解后，调节pH至7.4，加入去离子水定容到1L，然后置于121℃高温灭菌20min，冷却至室温，备用；
6）、12%分离胶溶液：每10ml的12%分离胶溶液中含有30%丙烯酰胺混合溶液 4.0 ml，1.5mol/L的pH8.8三羟甲基氨基甲烷-盐酸2.5 ml，质量分数为10%的十二万基硫酸钠溶液0.1 ml，质量分数为10%的过硫酸铵溶液0.1 ml，四甲基乙二胺0.004 ml、去离子水3.3 ml和尿素3g；其中，所述30%丙烯酰胺混合溶液的配制方法为，取丙烯酰胺30g和双丙烯酰胺0.8g置于容器中，然后加入100ml去离子水搅拌至完全溶解，即得到30%丙烯酰胺混合溶液；
7）、5 %浓缩胶溶液：每5ml的5 %浓缩胶溶液中含有30%丙烯酰胺混合溶液0.83 ml，1.5mol/L的pH8.8三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.63 ml，质量分数为10%的十二万基硫酸钠溶液0.05 ml，质量分数为10%的过硫酸铵溶液0.05 ml，四甲基乙二胺0.004 ml和去离子水3.4ml；所述30%丙烯酰胺混合溶液的配制方法为，取丙烯酰胺30g和双丙烯酰胺0.8g置于容器中，然后加入100ml去离子水搅拌至完全溶解，即得到30%丙烯酰胺混合溶液；
步骤二、分别灌注12%分离胶溶液和5 %浓缩胶溶液制备12%分离胶和5%浓缩胶，备用；
步骤三、将粗蛋白质样品和蛋白质标准品分别与上样缓冲液按照体积比1:1的比例混合均匀后，均置于水浴锅中100℃水浴5分钟，自然冷却至室温，备用；
步骤四、上样：采用微量进样器将蛋白质样品与蛋白质标准品分别加入到浓缩胶上的加样孔内，加入量为20μL/孔；浓缩胶上的空加样孔应采用20μL的上样缓冲液灌注，以保证电流在胶中分布均匀；
步骤五、电泳：盖上电泳槽盖，连接电泳仪，接通电源，调节电压使蛋白质样品和蛋白质标准品在浓缩胶中时控制电压为80V，当蛋白质样品和蛋白质标准品进入分离胶后的电压为100V，电泳至溴酚蓝指示带接近分离胶底部1-1.5cm时断开电源，停止电泳，取出蛋白质电泳胶片，备用；
步骤六、电泳结果检测：采用染色液对蛋白质电泳胶片进行染色后，用脱色液进行脱色，然后进行成像拍照；通过蛋白质样品与蛋白质标准品条带的对比得知样品蛋白质的分子量大小；将已经检测过的脱色后蛋白质电泳胶片保存，备用；
步骤七、脱色后蛋白质电泳胶片做抑菌实验：
1）、在已灭菌的培养皿中倒入10ml 灭菌的质量分数为2%的琼脂进行封底；所述质量分数为2%的琼脂，每100ml去离子水中含有2g琼脂；
2）、将脱色后蛋白质电泳胶片放入PBS缓冲液中平衡10min，然后置于倒入质量分数为2%的琼脂的培养皿中；
3）、取2ml处于对数生长期的菌液加入到50℃的200ml营养琼脂培养基中，轻轻摇匀后，得到体积浓度为1%的菌液；所述营养琼脂培养基含有质量分数为 1%的蛋白质胨、质量分数为 0.3%的牛肉膏粉、质量分数为 0.5%的NaCl和质量分数为 1.5%的琼脂，余量为水；
4）、取30ml体积浓度为1%的菌液倒入放有脱色后蛋白质电泳胶片的培养皿中；然后置于37℃培养12h，观察菌体生长情况，并确定抑菌效果好的蛋白质片段分子量的大小；
将所述采用染色液对蛋白质电泳胶片进行染色后，用脱色液进行脱色的具体操作方法为：将蛋白质电泳胶片置于培养皿中，加入染色液，染色2h后倒掉染色液，用蒸馏水清洗几次后，加入脱色液，在摇床上脱色12h，每4h更换一次脱色液，直至电泳条带清晰可见。
2.如权利要求1所述的可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，其特征在于：所述灌注12%分离胶溶液的方法为：用移液枪将配制好的12%分离胶溶液反复吹打5次，使分离胶溶液混合均匀；用移液枪将混匀后的分离胶溶液灌入到电泳槽内由高板和矮板组成的玻璃腔中，灌注高度为矮板高度的3/5，灌胶完成后，向玻璃腔中加满去离子水压平分离胶界面，待分离胶溶液凝结完全，即得到12%分离胶；倒去分离胶顶部的去离子水，并用滤纸吸干残余水分。
3.如权利要求1所述的可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，其特征在于：所述5 %浓缩胶的灌注方法为：用移液枪将配制好5 %浓缩胶溶液吹打5次，使浓缩胶溶液混合均匀；用移液枪将混匀后的浓缩胶溶液灌入到分离胶顶部，灌至距离矮板顶部0.5cm停止，然后将样品槽模板插入浓缩胶中，并保证样品槽模板底部无气泡产生，静置40min，待浓缩胶溶液完全凝结，拔出样品槽模板，形成加样孔；用去离子水加入到加样孔中倒出；然后调换玻璃腔使矮板向里，再用固定板将玻璃腔固定，即得到5 %浓缩胶；接着，向电泳槽内加入电极缓冲液。
4.如权利要求3所述的可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，其特征在于：所述样品槽模板为电泳梳。
5.如权利要求1所述的可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，其特征在于：所述步骤六中，采用凝胶成像仪对蛋白质电泳胶片进行成像拍照。
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