CN109270259A

CN109270259A - 一种检测内毒素的方法

Info

Publication number: CN109270259A
Application number: CN201811061693.XA
Authority: CN
Inventors: 刘利红; 牛俊心
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2018-09-12
Filing date: 2018-09-12
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-09-12
Also published as: CN109270259B

Abstract

本发明公开了一种检测内毒素的方法，该方法为将待测样品与荧光标记的LPS适配体，进行孵育；再加入还原氧化石墨烯和TBE缓冲液，再进行孵育；将孵育的样品加样到微流控芯片的进样口中，在微流控芯片的进、出样口之间施加电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理后检测Nafion膜通道与阳极之间的荧光强度；根据荧光强度和标准曲线判定待测样品中LPS的含量。本发明方法的最低检测限为8fM，线性范围为宽，灵敏度高，选择性好，抗干扰能力较强，且能快速区分革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌。

Description

一种检测内毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种检测内毒素的方法。

背景技术

内毒素(LPS)是一种高毒性的炎症刺激物，它可以与特异性细胞受体发生相互作用，从而产生炎性细胞因子，会导致发烧、败血症、多器官衰竭甚至死亡。由于可能产生严重的免疫反应，因此检测LPS变得至关重要，尤其是注射液等生物制品等，以便于确保灭菌产品的安全。目前用于LPS检测的主要方法是鲎试剂法(LAL)，在许多领域中都被广泛使用。^[2]近年来还有一些基于LPS抗体或适配体的电化学和光学传感器的研究，^[3,4]它们能够特异性地鉴别LPS，并且克服一些传统方法的缺点。适配体是具有高特异性和与靶标结合的高亲和性的单链寡核苷酸(ssRNA或ssDNA)，它可以通过折叠成独特的三维结构从而与靶分子结合，范围从小分子到蛋白质甚至细胞。^[5]最近也已经有较多研究筛选出LPS的适配体。

虽然鲎试剂法是目前测定LPS的金标准，但是它对温度、pH的变化以及干扰因子都非常敏感，并且样品制备程序繁琐。更重要的是，该方法依赖于因过度捕捞而严重减少的动物鲎。而基于LPS抗体、适配体的生物传感器虽然能够特异性识别LPS，但是其实际应用仍然受到成本高，耗时长，且灵敏度低的限制。迄今为止，LPS的检测灵敏度虽然已从毫摩尔水平提高到纳摩尔水平，但在飞摩尔水平检测LPS仍然是一个挑战。对于石墨烯，如果仅通过石墨烯来制造传感器，则不能很好地控制反应条件。例如，石墨烯的生物相容性非常低，这会影响其生物识别过程。最重要的是，石墨烯传感器的选择性和灵敏度都会受到限制。因此，研究一种检测LPS的新方法非常迫切。

发明内容

这了解决上述存在问题，本发明通过研究，基于内毒素适配体构建了一种检测LPS的生物传感器，具体开发了一种基于PDMS芯片进行连续进样检测LPS的方法。该检测系统将微流控芯片平台与适配体相结合，能够检测各种实际样品中的LPS，且所需时间更短(1h)，实验设置更简单。

本发明的目的在于提供一种检测内毒素的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测内毒素的方法，包括以下步骤：

1)将待测样品与荧光标记的LPS适配体，进行第一次混合孵育；再加入还原氧化石墨烯和TBE缓冲液，进行第二次混合孵育；

2)将微流控芯片清洗干净后，用含CH₃OH的TBE缓冲液充满整个微流控芯片的通道，然后将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的进样口中，在微流控芯片的进、出样口之间施加电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理后检测Nafion膜通道与阳极之间的荧光强度；根据荧光强度和标准曲线判定待测样品中LPS的含量；

上述微流控芯片中的Nafion膜通道垂直于微流控芯片中的富集通道。

进一步的，所述待测样品包括血清样品、水溶液样品。

进一步的，步骤1)中，当待测样品为血清样品时，在待测样品与LPS适配体混合之前，还需加入SDS、β-巯基乙醇，并于92～100℃加热处理3～8min。

进一步的，所述SDS、β-巯基乙醇在待测样品中的浓度分别为7～10mg/mL、3～10％v/v。

更进一步的，SDS浓度为10mg/mL，β-巯基乙醇浓度为5％v/v。

进一步的，步骤1)中，所述荧光标记的LPS适配体在加入待测样品之前，于92～100℃加热5～13min，并再于10～20℃冷却5～12min。更进一步的，LPS适配体加热时间为5～10min，最佳的加热时间为10min；最佳的冷却时间为10min。

进一步的，步骤1)中，第一次混合孵育的温度为10～20℃，孵育时间为7～14min。

进一步的，步骤1)中，第二次混合孵育的时间不少于25min，温度为室温；第二次混合孵育时间在30min以上，检测效果会更佳。

进一步的，步骤1)中，第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为8～17μg/mL、荧光标记的LPS适配体浓度为4～8nM。

进一步的，步骤2)中，所述TBE缓冲液的pH为7～7.8，TBE缓冲液中含有20～30％v/v CH₃OH。

进一步的，步骤2)中，当待测样品为血清样品时，所述TBE缓冲液pH为7～7.8，含有20～30％v/v CH₃OH和4～10％v/v CH₃CN。更进一步的，CH₃CN的浓度为5％v/v时，检测效果会更佳。

进一步的，步骤2)中，电压处理时间为25～35min，电压为25～35V。

进一步的，步骤2)中，Nafion膜通道的宽度为200～400μm，深度为20～200μm。

更进一步的，Nafion膜通道的宽度为400μm，Nafion膜通道的深度为45μm时，检测效果会更佳。

本发明的有益效果是：

(1)本发明建立了一种检测样品中内毒素的新方法，该方法的最低检测限(LOD)为8 fM，线性范围为：50fM-1nM(水溶液样品)，50fM-50pM(血浆样品)。本发明灵敏度高，选择性好，抗干扰能力较强。

(2)本发明方法检测所需时间短，消耗试剂量少，且不依赖于动物来源

(3)本发明能够检测注射液及脓毒症模型小鼠血清中的LPS含量，能快速区分革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌。

附图说明

图1.LPS适配体的加热时间、冰浴时间以及与rGO孵育时间的对本发明检测LPS的影响； (a)适配体加热时间对检测荧光条带的影响图；(b)适配体加热时间对检测荧光强度影响的曲线图；(c)LPS适配体冰浴时间对检测荧光条带的影响图；(d)LPS适配体冰浴时间对检测荧光强度影响的曲线图；(e)rGO的孵育时间对检测荧光条带的影响图；(f)rGO的孵育时间对检测荧光强度影响的曲线图。

图2.在TEB缓冲液中使用有机溶剂CH₃CN对本发明检测LPS效果的影响。(a)CH₃CN的浓度对检测荧光条带的影响图；(b)CH₃CN浓度对检测荧光强度影响的曲线图。

图3.Nafion膜尺寸对对本发明检测LPS效果的影响。(a)Nafion膜通道的宽度对检测荧光条带的影响图；(b)Nafion膜通道的宽度对检测荧光强度影响的曲线图；(c)Nafion膜通道的深度对检测荧光条带的影响图；(d)Nafion膜通道的深度对检测荧光强度影响的曲线图。

图4.SDS和β-巯基乙醇对检测LPS效果的影响；(a)(b)为SDS浓度对富集荧光条带的影响：(a)为样品，(b)为空白(无LPS)；(c)(d)为β-巯基乙醇对富集荧光强度的影响： (c)样品，(d)为空白(无LPS)。

图5.本发明方法检测对脓毒症模型小鼠血清中LPS的检测。

图6.本发明方法的特异性检测；(a)和(b)分别为LPS水溶液样品和LPS血清样品对该方法的选择性。红色柱表示样品中同时存在竞争分子与LPS，黑色柱表示样品中只存在竞争分子。(c)30V电压下三种菌液(10⁸cfu/mL)在CI-ES平台的富集荧光强度。

图7.本发明方法检测LPS的荧光强度(y)与相应的浓度(x)的关系的标准曲线。(a)为水溶液样品，(b)为血清样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1一种检测内毒素的方法

1)微流控芯片的制作：本实施例采用PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流控芯片，其中含有 Nafion膜，Nafion膜垂直于微流控芯片中的通道。微流控芯片的具体制作过程如下：

在真空干燥器中用三甲基氯硅烷处理硅片，以避免PDMS粘附到硅片模具上。PDMS与固化剂以重量比为10：1的比例充分混合均匀，放入真空干燥器中真空脱气至气泡完全消失后，缓慢浇注在硅片上，避免产生气泡。然后在95℃的加热板上固化2-3h，然后将PDMS 从硅片上剥离，这样硅片上的微结构就转移到了具有弹性的PDMS上，并在进样口和出样口处打孔。之后在1M NaOH亲水处理过的载玻片上制作Nafion膜：采用45μm厚，400μm宽的PDMS微通道，通道两端各有一个孔，将1μL Nafion膜液加到直通道的入口中，并在直通道出口处用注射器吸使Nafion膜液充满整个直通道。放置3min后迅速剥离PDMS通道，将含有Nafion膜的载玻片在95℃下加热5min后使其固化，然后将含有通道的PDMS芯片与含有Nafion膜的载玻片一起放入等离子清洗机中进行表面改性处理，最后将PDMS芯片不可逆地粘合到载玻片上，Nafion膜垂直于PDMS芯片的富集通道。

2)样品处理：首先将6-FAM(6-羧基荧光素)标记的LPS适配体在95℃沸水中加热10min，然后立即放入15℃水中冷却10min。而后将其与待测样品(如果待测样品为血清样品时，在待测样品与LPS适配体混合之前，还需将待测样品中加入SDS 7～10mg/mL、β-巯基乙醇3～10％v/v，并于95℃加热处理5min)混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rGO和1×TBE缓冲液，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

在上述第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为8～17μg/mL、荧光标记的LPS 适配体浓度为4～8nM。

上述rGO采用水热还原法制备：将50mL 0.05mg/mL GO(氧化石墨烯)水溶液加入到聚四氟乙烯衬里的高压釜中，然后在180℃下加热6h。然后将高压釜冷却至室温。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％BSA(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用TBE缓冲液(pH为7～7.8，含有 20～30％v/v CH₃OH；如果待测样品为血清样品时，1×TBE缓冲液含有20～30％v/vCH₃OH 和4～10％v/v CH₃CN)充满整个通道直至开始实验。将1-10μL枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有Nafion膜(厚45μm，宽400μm)；同时将连接DC电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加20～30V电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理30min后检测Nafion膜与阳极之间的荧光强度；根据荧光强度和标准曲线判定待测样品中LPS的含量。

上述荧光强度的具体测量过程为：通过Image J软件分析荧光图像，使用Image J的 Subtract函数从图像中扣除背景空白值。然后测量Nafion膜与阳极之间的浓度荧光条带(Image →Adjust→Threshold)以得到荧光强度。

实施例2一种检测内毒素的方法(LPS适配体的加热时间、冰浴时间以及与rGO孵育时间的优化)

1)微流控芯片的制作：同实施例1

2)样品处理：

LPS标准溶液的制备：用超纯水制备LPS的标准储备液(1mg/mL)。通过适当稀释储备溶液以制备不同浓度的LPS溶液。本实施例以10pM的LPS溶液作为后续待测样品。

取6-FAM(6-羧基荧光素)标记的LPS适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴分别加热1、5、10、12、20min，然后立即放入15℃水中分别冰浴1、5、10、12、20min。而后将其与待测样品(10pM的LPS溶液，LPS终浓度为1pM)混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rGO和1×TBE缓冲液(pH 7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下分别旋转孵育10、30、60、180min后上样进行检测。

在上述第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为10μg/mL、荧光标记的LPS适配体浓度为6nM。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％BSA(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用TBE缓冲液(pH 7.4，含有25％v/v CH₃OH)充满整个通道直至开始实验。将1-10μL枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有Nafion 膜通道(Nafion膜通道尺寸：深45μm，宽400μm)；同时将连接DC电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加30V电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理 30min后检测各组中Nafion膜与阳极之间的荧光强度。

本实施例分别探究了LPS适配体的加热时间、冰浴时间以及与rGO孵育时间的最佳条件，检测结果如图1所示，从中可以看出，图(a)和(b)表明LPS适配体加热时间为5～10min、 10～13min时，能够较好检测出样品中的LPS，其中最佳的加热时间为10min；图(c)和(d) 表明LPS适配体冰浴时间为5～12min时，能够较好检测出样品中的LPS，其中最佳的冰浴时间为10min；图(e)和(f)表明与rGO孵育时间为25min以上，能够较好检测出样品中的LPS，其中孵育时间在30min以上，检测效果会更佳。

实施例3一种检测内毒素的方法(CH₃CN的效果检测)

1)微流控芯片的制作：同实施例1

2)样品处理：

LPS加标血清的制备：采集健康人的血清，加入实施例2中已知浓度的LPS标准储备液，将混合物在95℃沸水中加热5min，即得LPS加标血清，将该加标血清加入SDS 10mg/mL，β-巯基乙醇5％v/v，并于95℃沸水中加热5min，作为后续的待检测样品。

取6-FAM(6-羧基荧光素)标记的LPS适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中分别冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rGO以及1×TBE缓冲液，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％BSA(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用不同的1×TBE缓冲液(pH7.4，含有25％v/v CH₃OH，CH₃CN的浓度分别设置为0％、1％、3％、5％、7％、10％v/v)充满整个通道直至开始实验。将1-10μL枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有Nafion膜(厚45μm，宽400μm)；同时将连接DC电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加20V电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理30min后检测各组中Nafion膜与阳极之间的荧光强度。

本实施例分别探究了CH₃CN本发明检测LPS效果的影响，检测结果如图2所示，从中可以看出，图(a)和(b)表明血清样品基质比水溶液样品更复杂，我们发现在TBE缓冲液中添加CH₃CN可改善带状稳定性，当没有CH₃CN时，荧光条带较为松散。当CH₃CN的浓度为4～10％v/v CH₃CN时，检测效果较好，当CH₃CN的浓度为5％v/v时，检测效果会更佳。

实施例4一种检测内毒素的方法(Nafion膜通道的深度和宽度的优化)

1)微流控芯片的制作：除了将Nafion通道的尺寸宽度分别设置成100、200、400、600、800μm，深度设置成20、45、100、200μm；其他均同实施例1

2)样品处理：

取6-FAM(6-羧基荧光素)标记的LPS适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中分别冰浴10min。而后将其与上述待测样品(10pM的 LPS溶液)混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rGO及 1×TBE缓冲液(pH 7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％BSA(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用TBE缓冲液(含25％v/vCH₃OH) 充满整个通道直至开始实验。将1-10μL枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有Nafion膜；同时将连接DC电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加30V电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理30min后检测各组中Nafion膜与阳极之间的荧光强度。

本实施例分别探究了Nafion膜通道的宽度和深度对检测的荧光条带和荧光强度的影响，检测结果如图3所示，从中可以看出，图(a)和(b)表明Nafion膜通道的宽度为200～400 μm时，检测到的荧光条带较清晰、集中，检测到的荧光强度较高，其中最佳Nafion膜通道的宽度为400μm；图(c)和(d)表明Nafion膜通道的深度为20～200μm时，检测到的荧光条带较清晰、集中，检测到的荧光强度较高，其中最佳Nafion膜通道的深度为45μm。

实施例5一种检测内毒素的方法(β-巯基乙醇和SDS的效果检测)

1)微流控芯片的制作：同实施例1

2)样品处理：

LPS加标血清的制备：采集健康人体的血清，加入实施例2中已知浓度的LPS标准储备液，即得LPS加标血清，然后将上述加标血清中分别加入SDS的浓度为7、10、13、18mg/mL；以及分别加入β-巯基乙醇的浓度为3、5、7、10、15％v/v，将各组混合物在95℃沸水中加热5min，分别作为后续的待检测样品。

取6-FAM(6-羧基荧光素)标记的LPS适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中分别冰浴10min。而后将其与上述各组待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rGO以及1×TBE缓冲液(pH7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％BSA(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用1×TBE缓冲液(pH 7.4，含有25％ v/v CH₃OH和5％v/v CH₃CN)充满整个通道直至开始实验。将1-10μL枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有Nafion膜(厚45μm，宽400μm)；同时将连接DC电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加20V电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理30min后检测各组中Nafion膜与阳极之间的荧光强度。

本实施例探究了SDS和β-巯基乙醇对检测LPS效果的影响，检测结果如图4所示，从中可以看出图(a)和(b)表明SDS浓度为7～10mg/mL时，检测到的荧光条带清晰、集中，最佳的SDS浓度为10mg/mL，且空白组基本无荧光富集。图(c)和(d)表明β-巯基乙醇浓度为3～10％v/v时，检测到的荧光条带清晰、集中，最佳β-巯基乙醇浓度为5％v/v，且空白组基本无荧光富集；上述结果说明通过加入SDS和β-巯基乙醇能够降低血浆样品荧光的干扰，且整个检测过程只需要5min。

实施例6一种检测内毒素的方法(动物实验)

1)微流控芯片的制作：同实施例1

2)样品处理：

LPS血清样品的制备(动物实验)：取南方医科大学实验动物中心6-7周无特定病原体 (SPF)KM小鼠。实验时它们的重量为31.6±1.0g。所有实验均按照国家实验室动物护理和使用指南进行。在动物实验中，腹腔注射15mg/kg的LPS，然后分别在注射后4h和12h 时取0.3mL血液用于LPS试验。经测量，注射LPS后小鼠肛温由36.2℃降至32.2℃。将获得的血液样品以300g离心10min，分离获得LPS血清样品，之后将上述小鼠血清加入10 mg/mL SDS，5％v/vβ-巯基乙醇，并于95℃沸水中加热5min。作为后续的待测样品。

取6-FAM(6-羧基荧光素)标记的LPS适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中分别冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rGO以及1×TBE缓冲液(pH 7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％BSA(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用TBE缓冲液(pH 7.4，含有25％v/v CH₃OH和5％v/v CH₃CN)充满整个通道直至开始实验。将1-10μL枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有Nafion膜(厚45μm，宽400μm)；同时将连接DC电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加20V电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理30min 后检测各组中Nafion膜与阳极之间的荧光强度。

检测结果如图5所示，可见利用本发明方法分别对注射LPS 4h及12h后的脓毒症模型小鼠血清进行测定，均能检测出小鼠血清中的LPS，且对照组基本无荧光富集。

实施例7一种检测内毒素的方法(细菌实验及特异性检测)

方法：

1)微流控芯片的制作：同实施例1

2)样品处理：

①基体为水溶液：

空白组：已知浓度的LPS标准水溶液，作为待测样品。

取6-FAM(6-羧基荧光素)标记的LPS适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rGO以及1×TBE缓冲液(pH 7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

焦磷酸盐组：已知浓度的LPS标准水溶液+同浓度焦磷酸盐，作为待测样品。

FAD⁺组：已知浓度的LPS标准水溶液+同浓度FAD⁺，作为待测样品。

NAD⁺组：已知浓度的LPS标准水溶液+同浓度NAD⁺，作为待测样品。

AMP组：已知浓度的LPS标准水溶液+同浓度AMP，作为待测样品。

ADP组：已知浓度的LPS标准水溶液+同浓度ADP，作为待测样品。

ATP组：已知浓度的LPS标准水溶液+同浓度ATP，作为待测样品。

磷脂酰胆碱组：已知浓度的LPS标准水溶液+同浓度磷脂酰胆碱，作为待测样品。

脂磷壁酸组：已知浓度的LPS标准水溶液+同浓度脂磷壁酸，作为待测样品。

β-D-葡聚糖组：已知浓度的LPS标准水溶液+同浓度β-D-葡聚糖，作为待测样品。

②基体为血清：除了需要在LPS加标血清中加入10mg/mL SDS和5％v/vβ-巯基乙醇在沸水中进行加热处理5min与①不同，其他均与①相同。

③大肠杆组：通过4,000rpm离心10min收集大肠杆菌，并用1×TBE(pH 7.4)洗涤3遍，然后以13,000rpm离心10min破碎细菌，取上清后稀释于1×TBE溶液中(C＝10⁸cfu/mL)作为待测样品。

④金黄色葡萄球菌组：通过4,000rpm离心10min收集金黄色葡萄球菌，并用1×TBE(pH 7.4)洗涤3遍，然后以13,000rpm离心10min破碎细菌，取上清后稀释于1×TBE溶液中(C＝10⁸ cfu/mL)作为待测样品。

⑤白色念珠菌组：通过4,000rpm离心10min收集白色念球菌，并用1×TBE(pH 7.4)洗涤3遍，然后以13,000rpm离心10min破碎细菌，取上清后稀释于1×TBE溶液中(C＝10⁸cfu/mL)作为待测样品。

取6-FAM(6-羧基荧光素)标记的LPS适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中分别冰浴10min。而后将其与上述各待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rGO以及1×TBE缓冲液(pH7.4，)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

3)微流控芯片检测：同实施例2。

检测结果如图6所示，从中可以看出，本发明方法具有较好的特异性。在一些竞争生物分子(焦磷酸盐，FAD⁺，NAD⁺，AMP，ADP，ATP，磷脂酰胆碱，LTA，β-D-葡聚糖)的存在下，根据其荧光强度来评估其选择性，如图6(a)和(b)所示，所有竞争性生物分子均不会引起荧光强度的显著增加。我们所用的是已报道的能够特异性识别LPS的适配体，因此，只有LPS能诱导荧光强度发生显著的变化。该方法还能够区分革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌。我们使用大肠杆菌(革兰氏阴性细菌)，金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)和白色念珠菌(真菌)作为实例进行实验。并且在上述优化实验获得的最佳条件下，对新鲜细菌悬浮液(C＝10⁸cfu/mL)进行测定。(a)和(b)分别为LPS水溶液样品和LPS血清样品对该方法的选择性。红色柱表示样品中同时存在竞争分子与LPS，黑色柱表示样品中只存在竞争分子。(c)30V电压下三种菌液(10⁸cfu/mL)在的富集荧光强度。

本发明能够检测注射液及脓毒症模型小鼠血清中的LPS含量，能快速区分革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌。

实施例8标准曲线的制备

方法：通过该方法分别测定水溶液和血清中八种不同浓度 (50,100,500,10³,10⁴,5×10⁴,10⁵,10⁶fM和50,100,500,10³,5×10³,10⁴,2×10⁴,5×10⁴fM)的LPS标准溶液获得线性图。通过测定LPS在8种不同浓度的标准溶液获得。每个点对应于三次独立实验的平均值。三次重复实验的RSD<4.0％。

结果：

标准曲线的制备结果如图7所示，从中可以看出，本发明方法的最低检测限(LOD)为 8fM，线性范围为：50fM-1nM(水溶液样品)，见图7(a)；50fM-50pM(血清样品)，见图7(b)；最低检测限(LOD)为8fM。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测内毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，当待测样品为血清样品时，在待测样品与LPS适配体混合之前，还需加入SDS、β-巯基乙醇，并于92～100℃加热处理3～8min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述SDS、β-巯基乙醇在待测样品中的浓度分别为7～10mg/mL、3～10％v/v。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述荧光标记的LPS适配体在加入待测样品之前，于92～100℃加热5～13min，并再于10～20℃冷却5～12min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，第一次混合孵育的温度为10～20℃，孵育时间为7～14min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为8～17μg/mL、荧光标记的LPS适配体浓度为4～8nM。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述TBE缓冲液的pH为7～7.8，TBE缓冲液中含有20～30％v/v CH₃OH。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，当待测样品为血清样品时，所述TBE缓冲液pH为7～7.8，含有20～30％v/v CH₃OH和4～10％v/v CH₃CN。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，电压处理时间为25～35min，电压为25～35V。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，Nafion膜通道的宽度为200～400μm，深度为20～200μm。