CN101216458A - 可控制进样体积的微流控芯片筛分电泳分析方法 - Google Patents

可控制进样体积的微流控芯片筛分电泳分析方法 Download PDF

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Abstract

一种可控制进样体积的微流控芯片筛分电泳分析方法，由微流控芯片、微型真空泵、真空瓶、电触点真空表、三通电磁阀和单路高压电源组成的装置控制，其特征是：所述微流控芯片从缓冲废液池(BW)到通道十字交叉口这一段分离通道中，充填筛分介质，微流控芯片的其他通道，包括进样通道(S－SW)和缓冲液池(B)到通道十字交叉口之间的分离通道充填电泳缓冲液；单路高压电源的两极分别与分离通道两端储液池(B)和(BW)中的溶液相连。本发明提供微流控芯片筛分电泳分析方法，由注样和分离二个阶段组成。进样体积可通过注样阶段的持续时间任意调节，具有进样速度快、无“歧视效应”、操作安全、可靠和成本低廉等优点。

Description

可控制进样体积的微流控芯片筛分电泳分析方法
技术领域
本发明涉及微流控芯片筛分电泳分析技术，特别是涉及微流控芯片筛分电泳中，改变进样体积的分析技术。
背景技术
自从1990年提出微全分析系统概念以来，微流控芯片技术在医学和生命科学等领域开辟了广阔的发展空间。微通道中充填筛分介质的微流控芯片筛分电泳，已广泛地用于分离不同长度的DNA片段和不同分子量的蛋白质。
在微流控芯片筛分电泳分析中，由于微通道中充填筛分介质后流体阻力很大，目前普遍采用电动夹流进样方法进样。即在注样阶段，在样品池(S)和样品废液池(SW)之间加一组直流电压，在缓冲液池(B)和缓冲废液池(BW)间加一组夹流电压，使样品溶液在进样通道和分离通道的交叉处形成稳定的样品塞；在分离阶段，通过同时切换上述二组电压，使在微流控芯片交叉处已形成皮克级的样品塞被电渗流带入分离通道分离测定。但是这类进样方法的一个特点是进样体积固定。变换进样体积时通常需采用加工不同芯片的方法来实现。例如，“双T”通道构型的芯片与“十”字通道构型的芯片相比，具有更大的进样体积。通过改变“双T”通道的间距，可改变进样体积。  用“多-T”或“双十字”型微流控芯片可在局部范围内改变进样体积，但该方法需要使用多路高压电源和多个电极，进样设备复杂，操作繁杂。并且电动进样时有“歧视效应”，即正负离子在电场中迁移速度不一致，导致样品塞的组成与样品溶液的组成不一致。同时，分析生物样品时芯片通道表面性质的变化会改变电渗流的大小，使进样的精密度大大降低；严重时电渗流方向也会改变，使样品无法进入进样和分离通道，导致无法进行微流控芯片筛分电泳。
发明内容
本发明目的是提供一种操作方便、进样量可任意控制、无“歧视效应”和使用设备简单的微流控芯片筛分电泳进样技术。克服目前微流控芯片筛分电泳进样量固定，进样速度慢，进样需用多路电源和复杂控制系统等的不足。
本发明提供的可控制进样体积的微流控芯片筛分电泳分析方法，由微流控芯片、微型真空泵、真空瓶、电触点真空表、三通电磁阀和单路高压电源组成的装置控制，其特征是：所述微流控芯片从缓冲废液池(BW)到微流控芯片十字交叉口这一段分离通道中，充填筛分介质；微流控芯片的其他通道，包括进样通道(S-SW)和缓冲液池(B)到通道十字交叉口之间的分离通道充填电泳缓冲液；单路高压电源的两极分别与分离通道两端储液池(B)和(BW)中的溶液相连。
本发明微流控芯片上有缓冲液池(B)、缓冲废液池(BW)、样品池(S)、样品废液池(SW)。微流控芯片进样通道为(S-SW)，分离通道为(B-BW)。电触点真空表作为控制微型真空泵的开关并用于指示真空瓶内压力，真空瓶通过聚四氟乙烯管与三通电磁阀c端口相接，三通电磁阀a端口直接与大气相通，三通电磁阀b端口通过聚四氟乙烯管和硅橡胶管与微流控芯片样品废液池(SW)相通。高压电源的两极分别与分离通道两端的储液池(B)和废液池(BW)中的溶液相联结。
本发明提供微流控芯片筛分电泳分析方法，由注样和分离二个阶段组成，分析步骤如下：
●将筛分介质加在缓冲废液池(BW)中，并通过加压使筛分介质充填在从缓冲废液池(BW)到微流控芯片十字交叉口这一段分离通道中，微流控芯片的其他通道，包括进样通道(S-SW)和缓冲液池(B)到通道十字交叉口之间的分离通道充填电泳缓冲液；
●在微流控芯片上的样品储液池(S)中加入样品溶液，在储液池(B)、(SW)加入不同体积的电泳缓冲液，保持样品储液池(S)中液面的高度小于缓冲液池(B)的液面高度，样品废液池(SW)中的液面高度小于样品池(S)中液面的高度；
●设定电触点真空表的最大真空度和最小真空度后，使三通电磁阀b端和a端连通，c端截止，接通微型真空泵电源，使真空瓶内形成负压，当瓶内真空度达到设定真空度上限时，电触点真空表关闭微型真空泵电源，当瓶内真空度低于设定真空度下限时，电触点真空表启动微型真空泵，使瓶内真空度稳定在设定的范围内；
●将高压电源的二极分别与分离通道二端储液池B和BW中的溶液相连接；
●注样阶段：三通电磁阀b端口与c端口连通，使微流控芯片样品废液池与真空瓶相连接；在负压的作用下，缓冲液池(B)中的缓冲溶液通过微流控芯片交叉处流入废液，样品池(S)中的样品也通过微流控芯片交叉处而流入样品废液池(SW)；当样品溶液中带电荷的离子在流经微流控芯片交叉处时，被加在分离通道间电场驱动进入充填筛分介质的分离通道中，进入筛分介质的样品塞长度与注样阶段的持续时间成正比；
●分离阶段：三通电磁阀b端和a端连通，使样品废液池(SW)通过三通电磁阀与大气相通，它与其他液池之间的压力差立即同时消失；缓冲液池(B)中的缓冲溶液和样品池(S)中的样品同时停止通过微流控芯片交叉处流入样品废液池(SW)；已进入筛分介质的样品塞被加在分离通道上的电场电泳分离。
本发明注样阶段向分离阶段的转换由三通电磁阀控制。进样体积可通过注样阶段的持续时间任意调节。
本发明的优点：由于缓冲废液池(BW)到微流控芯片十字交叉口这一段分离通道中充填的筛分介质阻力很大，所以缓冲废液池(BW)中的溶液不能通过微流控芯片交叉处而流入样品废液池，当样品溶液中带电荷的离子在流经微流控芯片交叉处时，被加在分离通道间电场力的驱动进入充填筛分介质的分离通道中，通过调节注样阶段的持续时间可任意改变进样量；进样速度快，仅需要0.X-2秒(根据进样量多少选择)；而且仅需单路高压电源控制，克服了目前微流控芯片筛分电泳进样量固定，进样速度慢，进样需用多路电源和复杂控制系统等不足之处；本发明使用成本低廉(仅300元左右)的微量真空泵产生负压，由电触点真空表自动控制真空瓶内的真空度，由成本仅几十元的三通电磁阀控制注样阶段向分离阶段的转换。装置结构简单、成本低廉、操作方便、负压稳定、进样速度快。
附图说明
图1微流控芯片筛分电泳分离装置示意图
图中：1-微流控芯片，2-筛分介质，3-电泳缓冲液，4-高压电源，5-硅橡胶管，6-聚四氟乙烯管，7-三通电磁阀及a、b、c三个端口，8-电触点真空表，9-真空瓶，10-微量真空泵
图2微流控芯片筛分电泳分离牛血清白蛋白和碳酸酐酶的电泳图
图3连续20次分析DNA样品的电泳图
图4进样时间对DNA片段的峰高的影响
具体实施方式
实施例1
参见图1，微流控芯片1上缓冲液池(B)和缓冲废液池(BW)之间的通道是分离通道(B-BW)，样品储液池(S)和样品废液池(SW)之间的通道是进样通道S-SW。将筛分介质2加在缓冲废液池(BW)中，并使筛分介质2只充填在从缓冲废液池(BW)到通道十字交叉口这一段分离通道中，而在微流控芯片的其他通道，包括进样通道(S-SW)和缓冲液池(B)到通道十字交叉口之间的分离通道充填电泳缓冲液3。在微流控芯片上的样品储液池(S)中加入样品溶液，在储液池B、SW中加入不同体积的电泳缓冲液，保持样品储液池(S)中液面的高度小于缓冲液池(B)的液面高度，样品废液池(SW)中的液面高度小于样品池(S)中液面的高度。负压源由真空瓶9、电触点真空表8和微型真空泵10构成，用聚四氟乙烯管连接真空瓶9与三通电磁阀7的c端口；三通电磁阀7的a端口直接与大气相通，三通电磁阀7的b端口与聚四氟乙烯管6一端联连接，聚四氟乙烯管6的另一端插入内、外径合适的硅橡胶管5中，再将此硅橡胶管5插入样品废液池(SW)上部，以保证连接处的气密性。插入的聚四氟乙烯管6始终保持不与SW储液池内的电泳缓冲液的液面相接触。在分离通道B-BW二端接上高压电源4。操作步骤是：
首先设定电触点真空表的最大真空度为-210mbar，最小真空度为-200mbar。使三通电磁阀b端和a端连通，c端截止。接通微型真空泵电源，使真空瓶9内形成负压，当瓶内真空度达到设定真空度上限时，电触点真空表关闭微型真空泵电源，当瓶内真空度低于设定真空度下限时，电触点真空表启动微型真空泵，使瓶内真空度稳定在设定的范围内。
在注样阶段，使三通电磁阀b端和c端连通，真空瓶9经三通电磁阀7与微流控芯片样品废液池SW连通，使样品废液池中形成负压，微流控芯片上S和B储液池中的样品溶液和缓冲液等在大气压的作用下向样品废液池SW流动；由于高压电源的二极分别联结于分离通道二端储液池B和BW，当样品溶液带电荷的离子在流经微流控芯片交叉处时，被加在分离通道间电场力的驱动下进入充填筛分介质的分离通道中。进入筛分介质的样品塞长度与注样阶段的持续时间成正比。因此可以通过调节注样阶段的持续时间来控制微流控芯片筛分电泳中样品塞的长度。在分离阶段，使三通电磁阀b端和a端连通。由于三通电磁阀的a端直接与大气相通，样品废液池也与大气相通。它与其他液池之间的压力差立即同时消失。缓冲液池(B)中的缓冲溶液和样品池(S)中的样品同时停止通过微流控芯片交叉处流入样品废液池(SW)。已进入筛分介质的样品塞被加在分离通道上的电场所产生的电场力分离测定。
实施例2
根据实施例1提供一个微流控芯片筛分电泳分离不同蛋白质的实例。参见图1，微流控芯片上通道宽度为60μm，深20μm，其中S与SW之间的通道是进样通道，长度为10mm，B和BW之间的通道是分离通道，长度为50mm。分离通道与进样通道十字交叉。在进样通道和分离通道两端各打小孔，在小孔上用粘接剂粘合微量塑料储液池，塑料储液池外径6mm，内径4mm，高6mm。分别用S、SW、B、BW表示样品池、样品废液池、缓冲液池和缓冲废液池。在储液池BW中加入190μL筛分介质12％线性聚丙烯酰胺，用20mL的注射器通过压缩空气的方法将12％线性聚丙烯酰胺充入BW到分离通道与进样通道十字交叉处的微通道中，再分别在B和SW中加入电泳缓冲液溶液(20mmol/L Tris-20mmol/L tricine+0.1％SDS，pH8.0)190μL和10μL，在样品池S加入样品溶液30μL，样品溶液为荧光试剂FQ标记过的浓度为50μmol/L牛血清白蛋白和碳酸酐酶的混合物。
取外径为1.6mm内径0.8mm的聚四氟乙烯管作为连接管，一端与三通阀的b端相接，另一端插入作为密封胶管的硅橡胶管中，硅橡胶管长10mm，内径1.5mm，外径4.1mm，再将密封胶管插入废液储液池SW上部。始终保持插入的聚四氟乙烯管不与SW储液池内的电泳缓冲液的液面相接触，同时保证接口的气密性。
将激光光斑聚焦在分离通道上距通道十字交叉点20mm的检测点处，用激光荧光法检测电泳分离结果。使分离通道B端接地，BW端施加+1000V高电压。设定电触点真空表的最大真空度为-210mbar，最小真空度为-200mbar。使三通电磁阀b端和a端连通，c端截止。开启微型真空泵10，使真空瓶9内形成负压，当瓶内压力达到设定真空度上限时，电触点真空表8关闭微型真空泵电源，当瓶内压力低于设定真空度下限时，电触点真空表启动微型真空泵10，使瓶内真空度稳定在-210mbar～-200mbar的设定范围内。
微流控芯片筛分电泳分析的操作由注样和分离两个阶段组成。在注样阶段，使三通电磁阀b端和c端连通，真空瓶9经聚四氟乙烯管6与微流控芯片样品废液池连通，使样品废液池上方中形成负压，微流控芯片上储液池S中的样品溶液和储液池B中的缓冲液在大气压的作用下向样品废液池SW流动，当样品溶液流经微流控芯片交叉处时，样品中的牛血清白蛋白和碳酸酐酶被加在分离通道间电场力的驱动进入充填了12％线性聚丙烯酰的分离通道。通过调节注样阶段的持续时间可以调节进入线性聚丙烯酰中样品塞的长度。
在分离阶段，使三通电磁阀b端和a端连通，同时记录电泳图。由于三通电磁阀7的a端直接与大气相通，从而使使样品废液池与大气相通，它与其它储液池之间的压力差立即同时消失。缓冲液池(B)中的缓冲溶液和样品池(S)中的样品同时停止通过微流控芯片交叉处流入样品废液池(SW)。已进入筛分介质的样品塞被加在分离通道上的电场的作用下开始电泳分离。进样时间为2s时得到的电泳图见图2。
实施例3
再根据实施例1提供一个分离DNA片段的实例。微流控芯片筛分电泳分离装置示意图见图1，使用的微流控芯片的尺寸实施例2中的相同。以2％的羟乙基纤维素作为筛分介质，用1×TBE(90mmol/L Tris，90mmol/L的硼酸，2mmol/L EDTA，pH8.2)作为电泳缓冲液溶液，DNA样品溶液为荧光试剂SYBR标记过的浓度为5μmol/L ΦX 174-hae III digest。除分离电压由1000V调整为550V外，其它操作步骤与实施例2中的相同。进样时间为2s、连续20次分析DNA样品的电泳图见图3。从图3可见，DNA片段迁移时间的标准相对偏差为1.1～1.3％，峰高的标准相对偏差为5.0～9.0％。进样时间分别为0.1，0.3，0.5，1.0，1.5和2.0s的电泳图见图4。从图4可见，电泳图上各DNA片段的峰高与进样时间成正比，进样时间增加，电泳图上的峰高也增高。

Claims (4)

1.一种可控制进样体积的微流控芯片筛分电泳分析方法，由微流控芯片、微型真空泵、真空瓶、电触点真空表、三通电磁阀和单路高压电源组成的装置控制，其特征是：所述微流控芯片从缓冲废液池(BW)到微流控芯片十字交叉口这一段分离通道中，充填筛分介质；微流控芯片的其他通道，包括进样通道(S-SW)和缓冲液池(B)到通道十字交叉口之间的分离通道充填电泳缓冲液；单路高压电源的两极分别与分离通道两端储液池(B)和(BW)中的溶液相连。
2.权利要求1所述微流控芯片筛分电泳分析方法，由注样和分离二个阶段组成，分析步骤如下：
●将筛分介质加在缓冲废液池(BW)中，并通过加压使筛分介质充填在从缓冲废液池(BW)到微流控芯片十字交叉口这一段分离通道中，微流控芯片的其他通道，包括进样通道(S-SW)和缓冲液池(B)到通道十字交叉口之间的分离通道充填电泳缓冲液；
●在微流控芯片上的样品储液池(S)中加入样品溶液，在储液池(B)、(SW)加入不同体积的电泳缓冲液，保持样品储液池(S)中液面的高度小于缓冲液池(B)的液面高度，样品废液池(SW)中的液面高度小于样品池(S)中液面的高度；
●设定电触点真空表的最大真空度和最小真空度后，使三通电磁阀b端和a端连通，c端截止，接通微型真空泵电源，使真空瓶内形成负压，当瓶内真空度达到设定真空度上限时，电触点真空表关闭微型真空泵电源，当瓶内真空度低于设定真空度下限时，电触点真空表启动微型真空泵，使瓶内真空度稳定在设定的范围内；
●将高压电源的二极分别与分离通道二端储液池B和BW中的溶液相连接；
●注样阶段：三通电磁阀b端口与c端口连通，使微流控芯片样品废液池与真空瓶相连接；在负压的作用下，缓冲液池(B)中的缓冲溶液和样品池(S)中的样品同时通过微流控芯片交叉处而流入样品废液池(SW)；当样品溶液中带电荷的离子在流经微流控芯片交叉处时，被加在分离通道间电场驱动进入充填筛分介质的分离通道中，进入筛分介质的样品塞长度与注样阶段的持续时间成正比；
●分离阶段：三通电磁阀b端和a端连通，使样品废液池(SW)通过三通电磁阀与大气相通，它与其他液池之间的压力差立即同时消失；缓冲液池(B)中的缓冲溶液和样品池(S)中的样品同时停止通过微流控芯片交叉处流入样品废液池(SW)；已进入筛分介质的样品塞被加在分离通道上的电场电泳分离。
3.根据权利要求2所述微流控芯片筛分电泳分析装置的电泳分析方法，其特征是进样体积可通过注样阶段的持续时间任意调节。
4.根据权利要求2所述微流控芯片筛分电泳分析装置的电泳分析方法，其特征是注样阶段向分离阶段的转换由三通电磁阀控制。
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