CN101773861B - 一种微流控样品进样方法、装置及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微流控样品进样方法、装置及其应用。该装置主要包括结构为“十”字型微通道的微流控芯片、储液池、连接管、三通电磁阀、压力发生单元、信号检测单元、主机。其特征是门控状态：施加负压到bw和sw端驱动微流体，在“十”字通道中心形成水力门控，即s端的样品全部流入sw端，b端的缓冲液流入bw和sw端。b端缓冲液在bw和sw端的分流比通过加压端的压力比控制。通过瞬时增大bw和sw端的压力比值，s端的样品流入通道o-bw。进样的体积可以通过调节压力比值和进样时间控制。每次进样完毕后，仪器自动恢复水力门控状态，进样的样品在o-bw端可以被分离、检测和分析，应用本方法、仪器还可以进行细胞的药物刺激试验。

Description

一种微流控样品进样方法、装置及其应用

技术领域

本发明涉及一种微流控样品进样方法、装置及其应用，本方法是一种微流控芯片上皮升级至纳升级的液体样品进样方法，可应用于微流控芯片上的样品分离、细胞刺激等生化分析。

背景技术

近年来，微全分析系统(Micro-total analysis system，μ-TAS)或者芯片实验室(Lab on a chip)在化学、物理、生物以及生物工程等领域产生重大影响。微全分析系统以微流体和纳流体控制技术为基础，引导分析仪器向小型化、集成化、自动化、高通量快速定量分析方向发展。微全分析系统为生化环境样品的实时检测、现场分析提供了一种可能的策略，其在医疗诊断市场(Point-of-Care Testing)也有着巨大的商业前景。

皮升级到纳升级的样品进样是微全分析系统进行样品分析中一个必不可少的步骤。进样的重现性、线性度等参数极大地影响了分析仪器的性能。目前，微全分析系统中普遍采用的进样方式为电动(电渗流或/和电泳驱动)进样，其主要模式有夹流进样、门控进样、双“T”进样、双“L”进样等。电动进样易于实现仪器的小型化和集成化，在短时间内的运行有着较好的重现性。但是电动进样具有样品歧视效应，会导致进样的样品组分和原始样品的组分不同。另外，电动驱动流体在应用于活的生物样品时有着一个无法解决的矛盾，即如果电场强度过小则无法驱动体积较大的细胞或者微生物(大于10微米)，如果电场强度过大则细胞或微生物会因为电动驱动的电场效应和热效应受到不可逆的损伤。因此，电动进样只适合应用于分子样品和较小体积的细胞样品(小于5微米)。压力进样也被应用于微全分析系统的样品进样，其能解决电动进样方法中存在的一些问题。Landers研究组(Analytical Chemistry 2005，77，3637-3643)和Quake研究组(NatureBiotechnology 2004，22，435-439)在聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体芯片上集成微阀和微泵，利用压力驱动流体，微阀控制样品进样。这类方法能够驱动较大的生物样品，没有样品歧视效应。但这类方法使用的微流控芯片加工复杂，方法实施依赖于复杂的仪器，并不适合于大规模的商业化使用。此外，殷学锋研究组(Lab on a Chip 2006，6，258-264)开发出一种在“十”字型微流控芯片上的进样技术。该技术通过施加负压到微流控芯片的一个端口，形成缓冲液对样品的水力聚焦，然后撤销负压同时在分离通道两边施加一个电场，从而实现样品的电动进样。该方法无样品歧视效应，进样重现性好，但是其调节进样样品体积的能力十分有限。

发明内容

本发明的目的是克服现有微全分析系统样品进样的缺点(如进样方法存在歧视性、对活的生物样品有损伤、进样体积不可调节)，提供一种皮升级到纳升级的微流控样品进样方法、装置、及该方法在液相色谱分离和细胞刺激试验中的应用。

采用的具体技术方案如下：

一种基于压力驱动的微流控水力门控样品进样方法，包括如下步骤：

第一步，将“十”字型微流控芯片的通道即“十”字通道的四个末端分别定义为样品端s，样品废液端sw、缓冲液端b和缓冲液废液端bw，所述“十”字通道的交叉点中心o与缓冲液废液端bw之间的通道o-bw定义为样品分析通道，对样品废液端sw和缓冲液废液端bw施加负压，在中心o处形成水力门控，此时样品端s的样品流入样品废液端sw，缓冲液端b的缓冲液流入缓冲液废液端bw和样品废液端sw。施加到所述样品废液端sw和缓冲液废液端bw的负压力和水力门控的紧密程度可以由以下公式确定：

$\frac{P_{\mathrm{sw}}g}{L_{\mathrm{sw}}+{\mathrm{gL}}_s}=\frac{P_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+P_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}{L_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}$

其中P_sw和P_bw分别为施加于sw和bw端口的负压；L_s、L_sw、L_b、L_bw分别为通道s-o、sw-o、b-o、bw-o端的长度；g为微通道o-sw内样品流占总量的比率，g越小门控越紧密，g＝1时为临界门控，即s中样品全部流入sw，b中缓冲液全部流入bw。

第二步，改变施加在“十”字通道的样品废液端sw和缓冲液废液端bw上的负压值，或者保持施加在缓冲液废液端bw上的负压值不变而撤销施加在样品废液端sw上的负压，以使样品端s的样品流入样品分析通道o-bw，实现样品进样。施加到所述样品废液端sw和缓冲液废液端bw的负压力和进样量的关系可以通过以下公式确定：

$\frac{{\mathrm{kP}}_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}+P_{\mathrm{sw}}{L}_{\mathrm{bw}}}{L_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}+{\mathrm{kL}}_{\mathrm{sw}}{L}_s+L_{\mathrm{bw}}{L}_s}=\frac{P_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+P_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}{L_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}$

其中P_sw、P_bw分别为施加于sw、bw端口的压力；L_s、L_sw、L_b、L_bw分别为通道s-o、sw-o、b-o、bw-o端的长度；k为进样时微通道o-bw内样品流占总量的比例，k越大单位时间内的进样量越大。

第三步，重新使得施加在样品废液端sw和缓冲液废液端bw上的负压值恢复到与第一步相同，在所述“十”字通道中心重新形成水力门控；

至此，一次样品进样完成，重复上述步骤，即可实现多次连续进样。

本发明在上述第二步中，可通过控制样品进样的时间，从而控制进样的样品量。

本发明所述的样品为液体样品。

一种实现上述方法的装置，该装置包括“十”字型微流控芯片、多个储液池、连接管、三通电磁阀、压力发生单元和主机，所述“十”字型微流控芯片上的“十”字通道的四个末端都安装有储液池，所述三通电磁阀用于控制压力发生单元输出压力的切换，以选择产生门控负压或进样负压。

将本方法应用于液相色谱分离和细胞刺激，实施装置还包括信号检测单元，用于将收集的信号传输给主机，以对所收集的信号进行分析处理。

所述的装置在对细胞的药物刺激中的应用，具体过程如下：

将细胞引入“十”字型微流控芯片的o-bw端，并培养至贴壁，启动主机后，所述负压同时施加到bw和sw，形成样品门控，药物的水溶液作为样品加入s端的储液池中，sw、b和bw端的储液池中加缓冲液，设置进样程序参数后进行多次进样，每次进样后细胞被药物刺激，每次进样完毕后恢复到门控，药物被缓冲液带走，细胞刺激被中止；

所述信号检测单元记录下细胞的荧光变化，通过分析细胞刺激和响应时间图对获得细胞生理信息。

本发明所述的信号检测单元为配备有CCD相机和光电倍增管的倒置荧光显微镜系统。

本发明的优点是，没有样品歧视效应、具有较强流体驱动能力、进样重现性好、线性度高、进样体积可控、系统结构简单、成本低、操作方便，对活的生物样品没有伤害。

附图说明

图1是本发明的原理示意图。其中(A)和(B)为样品门控，其中(A)为紧密门控g＜1的情况，(B)为样品临界门控g＝1情况。(C)改变施加在“十”字通道的样品废液端sw和缓冲液废液端bw负压值，样品进样。(D)撤销在样品废液端sw所加的负压，样品进样。s、sw、b和bw分别为指示样品端，样品废液端、缓冲液端和缓冲液废液端。o指示“十”字通道的交叉点。黑色箭头指示液体在通道中流动方向。

图2是本发明的系统示意图。其中1为“十”字型微流控芯片，2为“十”字型微流控芯片的通道，3为储液池，5和6为三通电磁阀，c、d和e为三通电磁阀的三个端口，c至d气路为常开连接，c至e气路为常闭连接；7为压力发生单元，f、g、h、j分别为压力发生单元的四个不同的压力输出端口；8为信号检测单元；9为主机。

图3是CCD相机拍摄样品门控图(显微镜放大100倍)。图中黑色为样品流，黑色虚线为通道边缘。s、sw、b和bw分别为指示样品端，样品废液端、缓冲液端和缓冲液废液端。o指示“十”字通道的交叉点。

图4是荧光素连续进样检测图。荧光素连续进样20次，每次进样100毫秒，间隔500毫秒。倒置荧光激发，光子计数器柱上荧光检测。

图5是进样体积和时间线性度图。进样时间分别为5、10、20、50、100、200、500和1000毫秒。一次线性拟合，R²＝0.9992。

图6是将本方法应用于细胞刺激的示意图，其中(A)为样品门控，定位于分析通道o-bw的细胞被缓冲液冲洗。(B)为样品进样，细胞被样品(如：毒素、兴奋剂等)刺激。(C)为重新门控，刺激样品被缓冲液带走，细胞脱离被刺激的状态。

图7是细胞刺激响应图，贴壁生长在“十”字型微流控芯片o-bw通道的单个HeLa细胞在ATP多次进样刺激下，荧光探针Fluo-3/AM指示细胞内钙变化图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

一种基于压力驱动的微流控水力门控样品进样方法，包括如下步骤：

第一步，如图1(A)所示，将“十”字型微流控芯片的通道(即“十”字通道)的四个末端分别定义为样品端s，样品废液端sw、缓冲液端b和缓冲液废液端bw，将“十”字通道的交叉点定义为中心o，中心o与缓冲液废液端bw之间的通道o-bw定义为样品分析通道。对样品废液端sw和缓冲液废液端bw施加负压，在中心o处形成样品门控，即此时样品端s的样品流入样品废液端sw，缓冲液端b的缓冲液流入缓冲液废液端bw和样品废液端sw。施加到所述样品废液端sw和缓冲液废液端bw的负压力和水力门控的紧密程度可以由以下公式确定：

$\frac{P_{\mathrm{sw}}g}{L_{\mathrm{sw}}+{\mathrm{gL}}_s}=\frac{P_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+P_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}{L_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}$

$(\frac{L_b{L}_{\mathrm{bw}}}{L_s{L}_b+L_s{L}_{\mathrm{bw}}+L_b{L}_{\mathrm{bw}}}\≤g\≤1)$

其中P_sw和P_bw分别为施加于sw和bw端口的负压；L_s、L_sw、L_b、L_bw分别为通道s-o、sw-o、b-o和bw-o的长度；g为通道o-sw内样品流占总量的比例，g越小门控越紧密，g＝1时为临界门控(如图1(B)所示)，即s中样品全部流入sw，b中缓冲液全部流入bw。

第二步，改变施加在“十”字通道的样品废液端sw和缓冲液废液端bw负压值，如图1(C)，或者撤销在样品废液端sw所加的负压，如图1(D)，使样品端s的样品流入样品分析通道o-bw，实现样品进样。施加到所述样品废液端sw和缓冲液废液端bw的负压力和进样量的关系可以通过以下公式确定：

$\frac{{\mathrm{kP}}_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}+P_{\mathrm{sw}}{L}_{\mathrm{bw}}}{L_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}+{\mathrm{kL}}_{\mathrm{sw}}{L}_s+L_{\mathrm{bw}}{L}_s}=\frac{P_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+P_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}{L_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}$

$(0\≤k\≤\frac{L_s{L}_b+L_{\mathrm{sw}}{L}_b}{L_s{L}_{\mathrm{sw}}+L_s{L}_b+L_{\mathrm{sw}}{L}_b})$

其中k为进样时通道o-bw内样品流占总量的比例，k越大单位时间内的进样量越大。负压力一定时，通过控制样品进样的时间，可以控制进样的样品量。

第三步，重新使得施加在样品废液端sw和缓冲液废液端bw上的负压值恢复到与第一步相同，在所述“十”字通道中心重新形成水力门控；

至此，一次样品进样完成，重复上述步骤，即可实现多次连续进样。

本实施例还提供了一种实现上述方法的装置(见图2)，该装置包括“十”字型微流控芯片1、储液池3、连接管4、三通电磁阀5和6、压力发生单元7和主机9，“十”字型微流控芯片1上的“十”字通道的四个末端都安装有储液池3，样品端s上安装有样品储液池，样品废液端sw上安装有样品废液池、缓冲液端b上安装有缓冲液储液池缓冲液废液端bw上安装有缓冲液废液池。

样品加入样品储液池，同等体积的缓冲液分别加入缓冲储液池、缓冲液废液池和样品废液池sw。由于液面相等，此时样品不会流入样品分析通道o-bw。压力发生单元7的两个压力输出端口g和j用于输出产生门控所需的负压，另两个压力输出端口f和h用于输出使样品进样的负压。三通电磁阀5和6分别用于控制压力发生单元7的压力输出端口之间的切换，以选择产生门控负压或进样负压。本实施例中的三通电磁阀的c端和d端之间形成常开连接；c端和e端之间为常闭连接，即通电后连通。通过连接管4分别连接三通电磁阀5、6的c端和储液池bw和sw。连接管有很好的弹性，能够和储液池形成紧密的连接。启动主机9后，电磁阀5、6的c端连通e端，g、j端的负压同时施加到bw和sw。样品溶液在负压驱动下在”十”字型微流控芯片的中心o形成门控，即样品由s端全部流入sw端。电磁阀5、6切换c端和d、e之间的连接，改变bw和sw上的压力比值，使样品进入样品分析通道o-bw，每次进样时间结束后，系统自动切换三通电磁阀5、6回到门控状态。

通过控制样品进样的时间，可以控制进样的样品量，通过多次切换电磁阀，即可实现多次连续进样。

进样结束后，设置压力发生单元7的f、h端口为大气压，主机9给电磁阀5、6断电，c端连通到f、h端口。

另外，如果在通道o-bw填充有色谱分离的固定相，可以实现多组分样品的分离。如将细胞定位在分析通道o-bw，选择细胞刺激物作为样品可以实现时间可控的细胞刺激，用于研究细胞信号通路、毒理学等。

另外，该装置还可以包括信号检测单元8，用于将收集的信号传输给主机9，主机9对信号进行实时监控、分析、存储。

下面以荧光素样品进样为例，具体说明本方法的特点和性能。

实验中使用的微流控芯片1的微通道2的几何尺寸为高60μm、宽80μm，o-bw通道长18.5mm，其他通道长6.5mm。

信号检测单元8为倒置荧光显微镜系统。该系统配备CCD相机和光子计数器作为检测器。CCD相机用于观察微通道2上o处，流体门控和进样的情况。光子计数器用于检测分析通道o-bw上某一点荧光强度随时间的变化。汞灯作为激发光源，激发光通过激发滤光片，被60X物镜聚焦到离中心o点200μm处。发射光经过物镜、发射滤光片被光子计数器收集。

50μL的1×10^-5M荧光素的水溶液作为样品加入s端的储液池中，将相同体积的超纯水加入其他储液池。设置压力发生单元7的压力输出端口g、j分别为-3600Pa和-2400Pa，连接三通电磁阀5、6的c端和储液池bw和sw。启动主机9后，电磁阀5、6的c端连通e端，g、j端的负压同时施加到bw和sw，形成样品紧密门控(见图3)。设置压力发生单元7的压力输出端口f、h压力分别为-3600Pa和0Pa。设置进样程序参数，进样为20次，每次进样时间为100ms，进样之间的时间间隔为500ms。启动进样程序，荧光检测结果如图4所示。使用相同的进样程序，采用六组不同的进样压力(bw端进样的压力分别为-1200、-2400、-3600、-4800、-6000、-7200Pa，sw的进样压力不变)，得到荧光峰高的最大RSD为1.6％，荧光峰面积的最大RSD为2.1％。结果说明该方法具有很好的重现性。设置压力发生单元7的压力输出端口f、h压力分别为-3600Pa和0Pa。设置进样程序参数，进样时间为5ms、10ms、20ms、50ms、100ms、200ms、500ms、1000ms，每个进样时间分别进样20次，每次进样间的间隔为500ms。计算所得荧光峰面积的平均值和方差，然后做直线拟合得到，过零点直线的R²＝0.9992(见图5)。说明该方法有着很好的进样时间线性度。通过理论计算得到在该压力下进样时间为100ms时，进样体积为130pL。说明该方法可以实现皮升至纳升级的进样。

下面以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)作为刺激物，利用本发明刺激海拉(HeLa)细胞，具体说明本方法在细胞刺激方面的应用。

本实验中使用的微流控芯片1的微通道2的几何尺寸为高36μm、宽60μm，o-b、o-s、o-bw、o-sw长度均为7mm。

将培养在细胞培养瓶中的HeLa细胞用胰酶消化、吹打、悬浮在细胞培养液中。将悬浮的HeLa细胞引入芯片的o-bw端，隔夜贴壁培养。将Fluo-3/AM灌入“十”字通道内孵育HeLa细胞30分钟，然后用缓冲液冲洗通道将通道中的Fluo-3/AM洗去。Fluo-3/AM是一种钙离子探针，可以反应细胞胞质内钙离子的变化。

信号检测单元8为倒置荧光显微镜系统。该系统配备CCD相机和光子计数器作为检测器。将“十”字型微流控芯片固定在倒置荧光显微镜的载物台上。CCD相机用于观察和对焦微通道中的HeLa细胞。光子计数器用于检测通道o-bw中单个HeLa细胞荧光强度随时间的变化。汞灯作为激发光源，激发光通过激发滤光片，被60X物镜聚焦到离中心o点较近处的单个HeLa细胞上。发射光经过物镜、发射滤光片被光子计数器收集。

设置压力发生单元7的压力输出端口g、j分别为-2300Pa和-2900Pa，连接三通电磁阀5、6的c端和储液池bw和sw。启动主机9后，电磁阀5、6的c端连通e端，g、j端的负压同时施加到bw和sw，形成样品紧密门控(如图6(A)所示)。50μL的2×10^-5mol/L ATP的水溶液作为样品加入s端的储液池中，替代s端的储液池中的缓冲液。设置压力发生单元7的压力输出端口f、h压力分别为-2300Pa和0Pa。设置进样程序参数，进样为14次，每次进样之间的时间间隔为500ms，进样时间依次为30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、110ms、120ms、240ms、960ms、10s和200s。每次进样后HeLa细胞被ATP刺激(如图6(B))所示，每次进样完后恢复到门控，ATP被缓冲液冲走，细胞刺激被停止(如图6(C))。信号检测单元记录下的单个HeLa细胞的荧光变化如图7所示，通过分析细胞刺激和响应图，可以得到细胞信号通路、细胞表面受体动力学、细胞毒理学等相关信息。

Claims (9)

1.一种基于压力驱动的微流控水力门控样品进样方法，包括如下步骤：

第一步，将“十”字型微流控芯片的通道即“十”字通道的四个末端分别定义为样品端s，样品废液端sw、缓冲液端b和缓冲液废液端bw，所述“十”字通道的交叉点中心o与缓冲液废液端bw之间的通道o-bw定义为样品分析通道，对样品废液端sw和缓冲液废液端bw施加负压，使得在中心o处形成水力门控，此时样品端s的样品流入样品废液端sw，缓冲液端b的缓冲液流入缓冲液废液端bw和样品废液端sw；

第二步，改变施加在“十”字通道的样品废液端sw和缓冲液废液端bw上的负压值，或者保持施加在缓冲液废液端bw上的负压值不变而撤销施加在样品废液端sw上的负压，使样品端s的样品流入样品分析通道o-bw，实现样品进样；

第三步，重新使得施加在样品废液端sw和缓冲液废液端bw上的负压值恢复到与第一步相同，在所述“十”字通道中心重新形成水力门控；

至此，一次样品进样完成，重复上述步骤，即可实现多次连续进样。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述门控状态下，施加到所述样品废液端sw和缓冲液废液端bw的负压与门控紧密程度的关系可以通过以下公式确定：

$\frac{P_{\mathrm{sw}}g}{L_{\mathrm{sw}}+{\mathrm{gL}}_s}=\frac{P_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{b}w+P_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}{L_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}$

其中P_sw和P_bw分别为施加于样品废液端sw和缓冲液废液端bw端的负压；L_s、L_sw、L_b、L_bw分别为样品端s与交叉点中心o之间的通道s-o、样品废液端sw与交叉点中心o之间的通道sw-o、缓冲液端b与交叉点中心o之间的通道b-o、样品分析通道o-bw的长度；g为通道sw-o内样品流占总量的比例。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，样品进样状态下，施加到所述样品废液端sw和缓冲液废液端bw的负压与进样量的关系可以通过以下公式确定：

$\frac{{\mathrm{kP}}_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}+P_{\mathrm{sw}}{L}_{\mathrm{bw}}}{L_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}+{\mathrm{kL}}_{\mathrm{sw}}{L}_s+L_{\mathrm{bw}}{L}_s}=\frac{P_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+P_{\mathrm{bw}}{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}{L_{\mathrm{sw}}{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_b{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_{\mathrm{bw}}+L_s{L}_{\mathrm{sw}}{L}_b}$

其中P_sw、P_bw分别为施加于样品废液端sw、缓冲液废液端bw端口的压力；L_s、L_sw、L_b、L_bw分别为样品端s与交叉点中心o之间的通道s-o、样品废液端sw与交叉点中心o之间的通道sw-o、缓冲液端b与交叉点中心o之间的通道b-o、样品分析通道o-bw的长度；k为进样时样品分析通道o-bw内样品流占总量的比例。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在上述第二步中，可通过控制样品进样的时间，来控制进样的样品量。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的样品为液体样品。

6.一种实现上述权利要求1-5之一所述方法的装置，该装置包括“十”字型微流控芯片(1)、四个储液池(3)、连接管(4)、三通电磁阀(5，6)、压力发生单元(7)和主机(9)，所述“十”字型微流控芯片(1)上的“十”字通道的四个末端都安装有储液池(3)，四个储液池(3)中的缓冲液废液端bw的储液池和样品废液端sw的储液池通过连接管(4)分别与三通电磁阀(5，6)的c端相连，三通电磁阀(5，6)的d端和e端各自分别与压力发生单元(7)的一路压力输出端相连，主机(9)与压力发生单元(7)以及三通电磁阀相连(5，6)，所述三通电磁阀(5，6)用于控制压力发生单元(7)输出压力的切换，以选择产生门控负压和进样负压。

7.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，该装置还包括信号检测单元(8)，用于将收集的信号传输给主机(9)，以对所收集的信号进行分析处理。

8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述的信号检测单元(8)为倒置荧光显微镜系统。

9.权利要求7-8之一所述的装置在对细胞的药物刺激中的应用，具体过程如下：

将细胞引入“十”字型微流控芯片的样品分析通道o-bw，并培养至贴壁，启动主机(9)后，所述负压同时施加到缓冲液废液端bw和样品废液端sw，形成样品门控，药物的水溶液作为样品加入样品端s的储液池中，样品废液端sw、缓冲液端b和样品废液端bw端的储液池中加缓冲液，设置进样程序参数后进行多次进样，每次进样后细胞被药物刺激，每次进样完毕后恢复到门控，药物被缓冲液带走，细胞刺激被中止；

所述信号检测单元记录下细胞的荧光变化，通过分析细胞刺激和响应时间图对获得细胞生理信息。

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