CN102183504B - 一种微流控单细胞活性氧自动分析仪 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微流控单细胞活性氧自动分析仪。该分析仪由系统控制模块、细胞荧光标记模块、细胞/流体电动操纵模块、细胞/流体液压操纵模块、微流控芯片与芯片操作平台、单细胞捕获“识别与触发”模块、荧光检测模块、信号处理与数据采集模块和程序软件组成。本发明将单细胞组分分析方法、细胞荧光标记、细胞/流体操纵、荧光检测、微电子控制技术集成，提出了一种单细胞捕获“识别与触发”的概念，利用单细胞到达分离通道入口时的电阻变化识别单细胞的捕获，并同时触发“单细胞捕获、溶膜”操作的自动切换和数据采集。本发明可以实现微流控芯片上细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分离和单细胞内活性氧检测等操作。

Description

一种微流控单细胞活性氧自动分析仪

技术领域：

本发明涉及微流控分析平台技术，尤其涉及一种可以自动实现微流控芯片上细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分离和胞内活性氧检测的微流控单细胞活性氧自动分析仪。

背景技术：

细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元。在细胞的代谢过程中会不断产生各种活性氧(ROS)，例如：超氧阴离子(O₂ ^-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基(OH·)、脂自由基(ROO·)、过氧亚硝基阴离子(ONOO^-)等。适当水平的活性氧对生物正常的生理过程是重要的，它们参与细胞信号转导、细胞生长调节、重要生物物质的合成及细胞代谢。当生物处于氧化胁迫、外源性药物或毒素刺激条件下，过量活性氧的产生并积累则会诱导一系列有害的细胞信号转导，导致机体产生各种疾病及老化。近几年细胞水平上活性氧的分析研究非常令人关注，但由于细胞尺度小(通常直径在μm级、体积在pL级)、胞内活性氧含量低(一般为amol～zmol级)、生化反应快(通常在ms级)，使得目前一些分析方法多是将各种活性氧作为一个整体获得的结果多是基于静态、宏观的观察和整体平均而推导出来的。因此，发展高选择性、高灵敏度、能同时识别和检测单个细胞内不同活性氧的仪器装置及分析方法，对于发现宏观检测所不能获得的宝贵信息，进一步阐明活性氧种类、水平与生物生理、病理的相互关系，乃至疾病的早期诊断具有十分重要的意义。

目前，用于细胞水平上活性氧分析的商品化仪器，主要有激光扫描共聚焦显微镜、扫描隧道显微镜和流式细胞仪。激光扫描共聚焦显微镜和扫描隧道显微镜的优点是：可以对细胞内活性氧进行原位、实时动态和空间上的观察与分析；其不足是：受其质量测限高、分辨力低等因素限制，难以定量检测单细胞内活性氧的含量。流式细胞仪作为半个世纪以来科学研究和工程技术不断进步的结晶，被广泛应用于生物、医学等领域。例如：美国Bekman-Coulter公司的Cytomics FC500流式细胞仪，其优点是：可以对直线流动的细胞进行快速分选和单细胞内多参数的测量。其不足是：由于其测量数据是与生物样本比较的相对值，抗体非特异性结合直接影响细胞阳性、阴性的界定，因此需要在使用前对系统进行方法校准或标定，存在操作繁琐、细胞耗量大、仪器体积庞大、价格昂贵等问题。

近年来，以微流控芯片为核心的微流控分析在核酸、蛋白质、小分子等方面的应用研究发展迅猛，并正在向单细胞、单分子等领域渗透。与传统的宏观研究体系相比，微流控芯片作为单细胞研究平台具有以下优势：1)芯片通道尺寸(通常10-100μm)与典型晡乳类细胞的直径大小(一般为10-40μm)相匹配，便于细胞操纵；2)芯片通道的二维或三维网络式封闭结构，便于形成与细胞生理状态相接近的特定空间环境；3)芯片的平板式几何构型，容易对细胞进行观察、检测；4)芯片通道尺寸的减小，降低了细胞试样与试剂的消耗，同时可使分析速度成十倍、百倍地提高，便于实现高通量分析；5)将各种细胞操纵单元与电泳分离、检测技术组合，便于实现细胞内、尤其是单个细胞内多种化学组分的分离与定性、定量分析。迄今为止，已开展的微流控芯片细胞研究工作，其绝大部分集中在细胞培养、细胞分选、体外细胞微环境模拟、细胞生命过程鉴定等。少量报道的微流控单细胞组分分析是一种创新性尝试，其单个目标细胞的获得(即单细胞捕获)仍需要借助显微镜等观察装置，存在手工操作、速度慢、检测灵敏度低、装置复杂等问题。微流控单细胞组分分析通常包括：单细胞进样(细胞上样、单细胞捕获)、溶膜、电泳分离及胞内组分检测等操作步骤。目前，微流控单细胞组分分析所面临的主要技术问题是：1)缺少有效操纵单细胞的手段；2)缺少自动获知单个目标细胞已被捕获的适配技术；3)检测灵敏度有待进一步提高；4)缺少自动实现整个分析过程的仪器联用技术。对于微流控单细胞活性氧分析来讲，新型荧光探针及其装载方法的发展，为单细胞内活性氧的特异性识别与荧光检测奠定了基础。然而，由于受上述技术瓶颈和芯片上细胞活性氧标记技术的限制，目前还没有出现能够检测单个细胞内活性氧的微流控分析仪器。

发明内容：

本发明的目的旨在克服现有技术的不足，提供了一种微流控单细胞活性氧自动分析仪。利用本发明可以实现微流控芯片上细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分离和胞内活性氧检测等操作，达到无需借助显微境以及手工操作即可自动实现单细胞内活性氧分析的目的。

本发明的目的可通过如下技术措施来实现：

所述的分析仪由系统控制模块、细胞荧光标记模块、细胞/流体电动操纵模块、细胞/流体液压操纵模块、微流控芯片与芯片操作平台、单细胞捕获“识别与触发”模块、荧光检测模块、信号处理与数据采集模块、程序软件组成；所述的系统控制模块的核心是一单片机；所述的细胞荧光标记模块包括细胞荧光标记所需微区温度的控制与监测；所述的细胞/流体电动操纵模块由六路直流高压组成；所述的细胞/流体液压操纵模块由二路微注射泵组成；所述的荧光检测模块由激发光学模块、荧光收集光学模块、激发光与芯片通道对中成像光学模块组成；所述的程序软件由单片机控制程序和PC机应用程序组成。

本发明的目的还可通过如下技术措施来实现：

所述的单片机通过RS-485通讯接口与PC机的串行口相连，组成通讯、运算、控制、显示/记录等功能；

细胞荧光标记所需微区温度的控制与监测：

单片机顺序连接温控电路、微型热敏电阻，组成细胞荧光标记的微区温度控制；

微型热敏电阻顺序连接A/D转换与温度补偿电路、单片机，组成细胞荧光标记的微区温度监测；

六路直流高压分别通过高压导线、铂丝电极与微流控芯片的贮液池对应连接，实现细胞/流体的电动操纵：

单片机顺序连接一个八通道12位D/A转换电路、一个八通道放大电路、六个并列的DC-DC高压模块、六个并列的“双刀双掷”高压继电器，组成输出模式为“悬空、高压、接地”的所述六路直流高压；

六个并列的DC-DC高压模块与单片机之间连接有电压/电流测量电路，组成所述的六路直流高压的输出电压/电流监测；

单片机与六个并列的“双刀双掷”高压继电器之间连接有继电器控制电路，组成所述的六路直流高压输出模式—“悬空、高压、接地”的转换；

二路微注射泵分别通过内径为50-500微米的疏水性聚合材料导管与微流控芯片的贮液池对应连接，实现细胞/流体的液压操纵：

单片机顺序连接驱动电路、二个并列的步进电机、二个并列的微动推拉装置、二个并列的微型注射器，组成工作模式为“推进/灌注、等待、回拉”的所述二路微注射泵；

微流控芯片与芯片操作平台，微流控芯片可为不同材质(如，石英、玻璃、PDMS等)、不同结构(如，贮液池≤8个)的微流控芯片：

微流控芯片的样品池底部沉积有适合细胞荧光标记的微型热敏电阻，微流控芯片分离通道的入口处沉积有适合单细胞捕获“识别与触发”的二对微电极(A1-A2，B1-B2)；

微流控芯片水平固定于芯片操作平台上，芯片操作平台可以X、Y、Z轴三维调节，且能实现微流控芯片与聚焦物镜焦平面相对位置的任意匹配关系；

单细胞捕获“识别与触发”模块：

单片机与恒流源的输入端相连，恒流源的输出端与微流控芯片分离通道入口处的二对微电极(A1-A2、B1-B2)串联连接；

电压测量电路1、电压测量电路2的输入端分别与所述的二对微电极(A1-A2、B1-B2)并联连接，测量电路1、2的输出端通过甄别电路与单片机相连，组成被捕获单细胞到达分离通道入口时的识别，并同时触发单细胞分析中“单细胞捕获、溶膜”操作的自动切换和数据采集；

荧光检测模块由激发光学模块、荧光收集光学模块、激发光与芯片通道对中成像光学模块组成：

激发光学模块包括依次设置的激光器、准直组件、激发滤光片、光敏二极管的光轴与荧光收集光学模块包括依次设置的聚焦物镜、分色分光镜、带通滤光片、透镜、孔径光阑、发射滤光片组、光电倍增管的光轴呈90度角，其中分色分光镜与激发光学模块的光轴呈45度角放置；

激发光与芯片通道对中成像光学模块包括依次设置的CCD、柱状物镜、减光片、反光镜的光轴与荧光收集光学模块的光轴呈90度角，其中反光镜与荧光收集光学模块的光轴呈45度角放置；

所述的信号处理与数据采集模块：

光电倍增管、光敏二极管分别连接前置放大器1、前置放大器2的输入端，前置放大器1、前置放大器2的输出端顺序连接对数放大电路、数据采集板、PC机；

单片机通过单细胞捕获“识别与触发”模块提供的触发信号，控制数据采集板的开启；

所述的程序软件，由单片机控制程序和PC机应用程序组成，包括：

预置微流控单细胞活性氧分析中的操作步骤，每步操作所对应细胞荧光标记的温度、各路直流高压/微注射泵的输出模式、运行时间等实验参数；

控制微流控单细胞分析中细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分离和单细胞内活性氧检测等操作所对应细胞荧光标记温度、各路直流高压、各路微注射泵不同输出模式间的独立或/和同步输出的可编程输出流程，包括单细胞捕获“识别与触发”的自动切换；

实时显示/记录荧光标记温度、各路直流高压/微注射泵的运行状态、直流高压的输出电压/电流、数据采集板的输出信号。

所述的微型热敏电阻是具有加热和感温双重作用的微型热敏电阻。

所述的细胞荧光标记的微区温度范围为室温至60度。

所述的六路直流高压的电压范围为“0～5000V_DC”。

所述的二路微注射泵的灌注流量范围为“0.005μl/min～500μl/min”。

所述的激光器为473nm、532nm、635nm、730nm半导体泵浦固体激光器的任意一种，且激光器与激发滤光片、分色分光镜、带通滤光片为对应匹配关系。

所述的孔径光阑的大小在200～1000μm范围内可调。

所述的发射滤光片组由500～850nm范围内的六个不同波段的发射滤光片组成，且六个发射滤光片可以旋转式切换。

本发明的优点：

(1)本发明提出了一种单细胞捕获“识别与触发”的概念，利用被捕获单细胞到达分离通道入口时的电阻变化识别单细胞的捕获，并同时触发“单细胞捕获、溶膜”操作的自动切换和数据采集，从而使微流控单细胞组分分析向维持一个完全的自动化迈进了一大步；

(2)本发明实现了微流控芯片上细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分离和胞内活性氧检测的功能集成和自动化控制，达到了无需借助显微境以及手工操作即可自动完成单细胞活性氧分析全过程的目的，使得创建适应性强、误差范围小的微流控单细胞组分分析更为灵活和简便；

(3)本发明提供了友好的可视化人机对话平台，所有操作、显示/记录都在PC机的界面中完成，而且界面切换方便、显示直观明了。

附图说明：

图1是本发明实施例的整体结构示意图；

图2是本发明实施例的整体组成原理图；

图3是本发明实施例的单细胞捕获“识别与触发”模块的原理图；

图4是本发明实施例的荧光检测模块的结构原理图；

图5A是本发明实施例的测得10个肝癌细胞中H2O2的电泳谱图；

图5B是本发明实施例的测得10个肝癌细胞中H2O2含量的柱状图。

具体实施方式：

实施例1：

该分析仪由系统控制模块I、细胞荧光标记模块II、细胞/流体电动操纵模块III、细胞/流体液压操纵模块IV、微流控芯片与芯片操作平台V、单细胞捕获“识别与触发”模块VI、荧光检测模块VII、信号处理与数据采集模块VIII、程序软件IX组成；所述的系统控制模块I的核心是一单片机3；所述的细胞荧光标记模块II包括细胞荧光标记所需微区温度的控制与监测；所述的细胞/流体电动操纵模块III由六路直流高压组成；所述的细胞/流体液压操纵模块IV由二路微注射泵组成；所述的荧光检测模块VII由激发光学模块、荧光收集光学模块、激发光与芯片通道对中成像光学模块组成；所述的程序软件IX由单片机控制程序和PC机应用程序组成，单片机3通过RS-485通讯接口2与PC机1的串行口相连，组成通讯、运算、控制、显示/记录功能；

所述的细胞荧光标记所需微区温度的控制与监测：

单片机3顺序连接温控电路4、微型热敏电阻5，组成细胞荧光标记的微区温度控制；微型热敏电阻5顺序连接A/D转换与温度补偿电路6、单片机3，组成细胞荧光标记的微区温度监测；

所述的六路直流高压：

单片机3顺序连接一个八通道12位D/A转换电路7、一个八通道放大电路8、六个并列的DC-DC高压模块9、六个并列的“双刀双掷”高压继电器10，组成输出模式为“悬空、高压、接地”的所述六路直流高压；六个并列的DC-DC高压模块9与单片机3之间连接有电压/电流测量电路11，组成所述的六路直流高压的输出电压/电流监测；单片机3与六个并列的“双刀双掷”高压继电器10之间连接有继电器控制电路12，组成所述的六路直流高压输出模式—“悬空、高压、接地”的转换；

所述的二路微注射泵：

单片机3顺序连接驱动电路13、二个并列的步进电机14、二个并列的微动推拉装置15、二个并列的微型注射器16，组成工作模式为“推进/灌注、等待、回拉”的所述二路微注射泵；

所述的微流控芯片与芯片操作平台V：

微流控芯片17的样品池底部沉积有适合细胞荧光标记的微型热敏电阻5，微流控芯片分离通道的入口处沉积有适合单细胞捕获“识别与触发”的二对微电极(A1-A2，B1-B2)；微流控芯片17水平固定于芯片操作平台18上，芯片操作平台18可以X、Y、Z轴三维调节，且能实现微流控芯片17与聚焦物镜201焦平面相对位置的任意匹配关系；

所述的单细胞捕获“识别与触发”模块VI：

单片机3与恒流源19的输入端相连，恒流源19的输出端与微流控芯片17分离通道入口处的二对微电极(A1-A2、B1-B2)串联连接；电压测量电路(1)21、电压测量电路(2)22的输入端分别与所述的二对微电极(A1-A2、B1-B2)并联连接，测量电路(1)21、(2)22的输出端通过甄别电路20与单片机3相连，组成被捕获单细胞到达分离通道入口时的识别，并同时触发单细胞分析中“单细胞捕获、溶膜”操作的自动切换和数据采集；

所述的激发光学模块、荧光收集光学模块、激发光与芯片通道对中成像光学模块：

激发光学模块包括依次设置的激光器101、准直组件102、激发滤光片103、光敏二极管104的光轴与荧光收集光学模块包括依次设置的聚焦物镜201、分色分光镜202、带通滤光片203、透镜204、孔径光阑205、发射滤光片组206、光电倍增管207的光轴呈90度角，其中分色分光镜203与激发光学模块的光轴呈45度角放置；激发光与芯片通道对中成像光学模块包括依次设置的CCD301、柱状物镜302、减光片303、反光镜304的光轴与荧光收集光学模块的光轴呈90度角，其中反光镜304与荧光收集光学模块的光轴呈45度角放置；

所述的信号处理与数据采集模块VIII：

光电倍增管207、光敏二极管104分别连接前置放大器(1)25、前置放大器(2)26的输入端，前置放大器(1)25、前置放大器(2)26的输出端顺序连接对数放大电路24、数据采集板23、PC机1；单片机3通过单细胞捕获“识别与触发”模块提供的触发信号，控制数据采集板23的开启；

所述的程序软件IX，由单片机控制程序和PC机应用程序组成，包括：

预置微流控单细胞活性氧分析中的操作步骤，每步操作所对应细胞荧光标记的温度、各路直流高压/微注射泵的输出模式、运行时间等实验参数；控制微流控单细胞分析中细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分离和单细胞内活性氧检测等操作所对应细胞荧光标记温度、各路直流高压、各路微注射泵不同输出模式间的独立或/和同步输出的可编程输出流程，包括单细胞捕获“识别与触发”的自动切换；实时显示/记录荧光标记温度、各路直流高压/微注射泵的运行状态、直流高压的输出电压/电流、数据采集板的输出信号。

所述的细胞荧光标记的微区温度范围为室温至60度；六路直流高压的电压范围为“0～5000V_DC”；二路微注射泵的灌注流量范围为“0.005μl/min～500μl/min”激光器101为473nm、532nm、635nm、730nm半导体泵浦固体激光器的任意一种，且激光器101与激发滤光片103、分色分光镜202、带通滤光片203为对应匹配关系；所述的孔径光阑205的大小在200～1000μm范围内可调；所述的发射滤光片组206由500～850nm范围内的六个不同波段的发射滤光片组成，且六个发射滤光片可以旋转式切换。

实施例2：

本发明整个仪器的制造，可采用分步实施的方法，先完成各个模块，然后将各个模块组合连接即可。下面结合附图对本发明作进一步详细说明。

首先请参见附图1。本发明一种微流控单细胞活性氧自动分析仪，由系统控制模块I、细胞荧光标记模块H、细胞/流体电动操纵模块III、细胞/流体液压操纵模块IV、微流控芯片与芯片操作平台V、单细胞捕获“识别与触发”模块VI、荧光检测模块VII、信号处理与数据采集模块VIII和程序软件组成VIIII组成。其中：

系统控制模块I(参见附图1，2)

系统控制模块，包括安装了本发明程序软件的PC机1、RS-485通讯接口2、单片机3。单片机采用ATMEL公司生产的增强型微功耗8位单片机ATmega16L。单片机通过RS-485通讯接口与PC机的串行口相连，构成通讯、运算、控制、显示/记录等功能。

细胞荧光标记模块II(参见附图1、2)

细胞荧光标记模块，包括单片机3、温控电路4、沉积于微流控芯片样品池底部的微型热敏电阻5、A/D转换与温度补偿电路6。单片机将存储于其内部的预置荧光标记温度值与A/D转换与温度补偿电路送入的温度监测值进行比较，当温度监测值小于预置温度值时，单片机控制温控电路给微型热敏电阻施加电压，微型热敏电阻开始对芯片样品池(微区)加热，样品池内的细胞活性氧与荧光探针(染料)开始进行衍生化反应，使细胞内本身无荧光的活性氧物质具有荧光(便于后续荧光检测)；与此同时微型热敏电阻提供的荧光标记温度监测值，经A/D转换与温度补偿电路送入单片机，由PC机进行实时显示。当荧光标记温度监测值等于或大于预置荧光标记温度值时，微型热敏电阻则停止加热。

细胞/流体电动操纵模块III(参见附图1、2)

细胞/流体电动操纵模块由六路直流高压组成，包括单片机3、一个八通道12位的D/A转换电路7、一个八通道的放大电路8、六个并列的DC-DC高压模块9、六个并列的“双刀双掷”高压继电器10、电压/电流测量电路11、继电器转换电路12。八通道12位的D/A转换电路将寄存于单片机中的六路直流高压的预置电压的数字量转化成相应的模拟量，并送入八通道的放大电路；放大电路将相应的模拟量放大处理为0-+2.5V_DC的模拟量，该模拟量分别控制六只DC-DC高压模块输出与其预置电压对应相等的输出电压；六只DC-DC高压模块的输出电压分别通过六个并列的“双刀双掷”高压继电器，构成输出模式为“悬空、电压、接地”的六路直流高压；六路直流高压再通过高压导线、铂丝电极与微流控芯片的贮液池对应相接，实现对微流控芯片上细胞/流体的电动操纵。

电压/电流测量电路将六个DC-DC高压模块提供的输出电压/电流监测量进行放大、A/D转换后送入单片机，由单片机进行内存(RAM)缓存和逻辑运算，最后由PC机实时显示六路直流高压的输出电压、电流。

单片机通过继电器控制电路，控制六个高压继电器的控制线圈，构成六路直流高压输出模式—“悬空、电压、接地”的转换。

细胞/流体液压操纵模块IV(参见附图1、2)

细胞/流体液压操纵模块由二路微注射泵组成，包括单片机3、一个驱动电路13、二个并列的步进电机14、二个并列的微动推拉装置15、二个并列的微型注射器16。驱动电路将寄存于单片机中的二路微注射泵的预置输出参数转化成相应的脉冲信号，并分别控制二个步进电机；二个步进电机通过二个微动推拉装置带动二个相应的微型注射器完成与预置输出参数相同的动作，从而组成输出模式为“推进/灌注、等待、回拉”的二路微注射泵。二路微注射泵通过内径为50-500微米的疏水性聚合材料导管与微流控芯片的贮液池对应连接，实现对微流控芯片上细胞/流体的液压操纵。

微流控芯片与芯片操作平台V(参见附图2、3)

芯片操作平台18可以X、Y、Z轴三维调节，调节精度小于5微米。微流控芯片水平17水平放置在芯片操作平台18上，调整芯片操作平台18可使微流控芯片17与聚焦物镜201焦平面相对位置任意匹配。微流控芯片17样品池的底部沉积有适合细胞荧光标记的微型热敏电阻5；微流控芯片分离通道的入口处沉积有适合单细胞捕获“识别与触发”的二对微电极(A1-A2，B1-B2)。通用性是本发明的目的之一，因此本发明对微流控芯片的限制仅限上述要求，不同材质(如，石英、玻璃、PDMS等)、不同结构(如，贮液池≤8个)的微流控芯片均适合本发明。考虑到本发明与微流控芯片连接的多样性，在此不作详述，也不推荐附图。

单细胞捕获“识别与触发”模块VI(参见附图2、3)

单细胞捕获“识别与触发”模块包括单片机3、恒流源电路19、二对微电极(A1-A2，B1-B2)、电压测量电路(1)21、电压测量电路(2)22、甄别电路20。单片机控制恒流源输出微安级电流，该电流与二对微电极A1-A2、B1-B2串联连接后，电压测量电路1和电压测量电路2将测量到的微电极A1-A2和微电极B1-B2两端的电压分别送入甄别电路。甄别电路对微电极A1-A2和微电极B1-B2两端的电压值进行比较。当被捕获单细胞到达分离通道入口微电极A1-A2之间时(即，单细胞捕获)，微电极A1-A2两端电阻会产生变化，此时微电极A1-A2两端电压也发生变化，从而导致甄别电路产生脉冲信号(即，单细胞捕获识别)，同时该脉冲信号触发单片机控制细胞/流体操纵模块由单细胞捕获操作自动切换到单细胞溶膜操作，并启动数据采集。

荧光检测模块VII(参见附图2、4)

荧光检测模块由激发光学模块、荧光收集光学模块、激发光对中成像光学模块组成，其主要作用是对电泳分离的活性氧组分进行激发产生荧光、荧光收集、激发光与芯片通道的对中成像观察。调整时，按照各个器件在附图4光路设置的前后顺序，激发光学模块包括激光器101、准直组件102、激发滤光片103、光敏二极管104的光轴与荧光收集光学模块包括聚焦物镜201、分色分光镜202、带通滤光片203、透镜204、孔径光阑205、发射滤光片组206、光电倍增管207的光轴呈90度角，其中分色分光镜203与激发光学模块的光轴呈45度角放置；激发光与芯片通道对中成像光学模块包括CCD301、柱状物镜302、减光片303、反光镜304的光轴与荧光收集光学模块的光轴呈90度角，其中反光镜304与荧光收集光学模块的光轴呈45度角放置。CCD301用于采集激发光斑与芯片分离通道检测点处的成像，并送入PC机进行成像观察。

信号处理与数据采集模块VIII(参见附图2、4)

信号处理与数据采集模块包括单片机3、光电倍增管207、光敏二极管104、数据采集板23、对数放大电路24、前置放大器(1)25、前置放大器(2)26。光电倍增管将收集到的荧光信号转换为电流信号，并送入前置放大器(1)进行I/V变换。光敏二极管104将照射到的激光转换为电流信号，并送入前置放大器(2)进行I/V变换。对数放大电路将前置放大器(1、2)送来的模拟电压信号进行对数放大处理(目的是消除激光噪声，提高荧光检测信号的信噪比和响应范围)，并送入数据采集板转换成数字量信号。最后，在单片机的控制下，由PC机对数据采集板的输出信号进行实时显示/记录，完成活性氧检测电泳谱图的获得与谱图数据处理。

程序软件VIIII

程序软件由单片机控制程序和PC机应用程序组成。程序软件为本发明提供了一个人机交换平台，通过它可以完成：

预置实验参数；控制单细胞活性氧分析过程中细胞荧光标记温度，各路直流高压/微注射泵不同输出模式间的独立或/和同步输出的可编程输出流程，包括单细胞捕获的识别与触发；实时显示/记录仪器的运行状态，荧光标记温度，直流高压的输出电压/电流、数据采集板的输出信号、电泳谱图等。

本发明的工作过程为：

1)首先根据微流控芯片的结构和单细胞活性氧分析所需操作步骤，预置实验参数(包括：细胞荧光标记、细胞上样、单细胞被捕、单细胞溶膜、电泳分离及活性氧检测等每步操作所对应的细胞荧光标记温度/运行时间、直流高压/微注射泵的输出路数、每路直流高压/微注射泵的输出模式/运行时间等)；

2)将细胞荧光标记模块、各路直流高压和各路微注射泵、单细胞捕获“识别与触发”模块与微流控芯片对应连接；

3)调节芯片操作平台，观察PC机上的CCD成像，使激发光斑与芯片分离通道的检测点对中；

4)基于预置实验参数，本发明自动提供细胞荧光标记温控、各路直流高压/微注射泵不同模式间的独立或/和同步的可编程输出流程，包括单细胞捕获的识别和触发溶膜等后续操作的切换。从而可以在不同结构微流控芯片上自动实现细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、单细胞溶膜、电泳分离、单细胞内活性氧检测以及谱图采集等操作，完成单细胞活性氧分析全过程。

下面给出的实施例可以进一步说明本发明的应用效果(参见附图5)：

本实施例是本发明结合可对H₂O₂特异性识别的荧光探针FS，测得10个肝癌细胞中H₂O₂的电泳峰(图5A)及其含量的柱状图(图5B)。测试条件：玻璃芯片，细胞/l流体为电动操纵，λ_ex/λ_em为473nm/520nm，电泳介质为30mM HEPES缓冲溶液(pH7.4)添加20mM甘露醇；测试结果：H₂O₂的迁移时间和峰面积的标准相对偏差(RSDs，n＝10)分别是1.4％和4.8％，单个肝癌细胞中H₂O₂的平均含量为13.6amol(n＝10)。

以上所述，仅为本发明其中的较佳实施案例而已，并非用来限定本发明的实施范围：即凡根据本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆为本发明权利要求的范围所涵盖。

Claims (2)

1.一种微流控单细胞活性氧自动分析仪，其特征在于：所述的分析仪由系统控制模块（I）、细胞荧光标记模块（II）、细胞/流体电动操纵模块（III）、细胞/流体液压操纵模块（IV）、微流控芯片与芯片操作平台（V）、单细胞捕获“识别与触发” 模块（VI）、荧光检测模块（VII）、信号处理与数据采集模块（VIII）、程序软件（IX）组成；其中：

所述的系统控制模块（I）的核心是一单片机（3）：

单片机（3）通过RS-485通讯接口（2）与PC机（1）的串行口相连，组成通讯、运算、控制、显示/记录功能；

所述的细胞荧光标记模块（II）包括细胞荧光标记所需微区温度的控制与监测：

单片机（3）顺序连接温控电路（4）、微型热敏电阻（5），组成细胞荧光标记的微区温度控制；所述的微型热敏电阻（5）顺序连接A/D转换与温度补偿电路（6）、单片机（3），组成细胞荧光标记的微区温度监测；

所述的细胞/流体电动操纵模块（III）由六路直流高压组成：

单片机（3）顺序连接一个八通道12位D/A转换电路（7）、一个八通道放大电路（8）、六个并列的DC－DC高压模块（9）、六个并列的“双刀双掷”高压继电器（10），组成输出模式为“悬空、高压、接地”的所述六路直流高压；所述的六个并列的DC－DC高压模块（9）与单片机（3）之间连接有电压/电流测量电路（11），组成所述的六路直流高压的输出电压/电流监测；

单片机（3）与六个并列的“双刀双掷”高压继电器（10）之间连接有继电器控制电路（12），组成所述的六路直流高压输出模式—“悬空、高压、接地”的转换；

所述的细胞/流体液压操纵模块（IV）由二路微注射泵组成：

单片机（3）顺序连接驱动电路（13）、二个并列的步进电机（14）、二个并列的微动推拉装置（15）、二个并列的微型注射器（16），组成工作模式为“推进/灌注、等待、回拉” 的所述二路微注射泵；

所述的微流控芯片与芯片操作平台（V）：

微流控芯片（17）的样品池底部沉积有适合细胞荧光标记的微型热敏电阻（5），

微流控芯片分离通道的入口处沉积有适合单细胞捕获“识别与触发”的二对微电极（A1-A2, B1-B2）；所述微流控芯片（17）水平固定于芯片操作平台（18）上，芯片操作平台（18）可以X、Y、Z轴三维调节，且能实现微流控芯片（17）与聚焦物镜（201）焦平面相对位置的任意匹配关系；

所述的单细胞捕获“识别与触发”模块（VI）：

单片机（3）与恒流源（19）的输入端相连，恒流源（19）的输出端与微流控芯片（17）分离通道入口处的二对微电极（A1-A2、B1-B2）串联连接；

电压测量电路1（21）、电压测量电路2（22）的输入端分别与所述的二对微电极（A1-A2、B1-B2）并联连接，电压测量电路1（21）、电压测量电路2（22）的输出端通过甄别电路（20）与单片机（3）相连，组成被捕获单细胞到达分离通道入口时的识别，并同时触发单细胞分析中“单细胞捕获、溶膜”操作的自动切换和数据采集；

所述的荧光检测模块（VII）由激发光学模块、荧光收集光学模块、激发光与芯片通道对中成像光学模块组成：

激发光学模块包括依次设置的激光器（101）、准直组件（102）、激发滤光片（103）、光敏二极管（104），荧光收集光学模块包括依次设置的聚焦物镜（201）、分色分光镜（202）、带通滤光片（203）、透镜（204）、孔径光阑（205）、发射滤光片组（206）、光电倍增管（207），激发光学模块的光轴与荧光收集光学模块的光轴呈90度角，其中分色分光镜（202）与激发光学模块的光轴呈45度角放置；

激发光与芯片通道对中成像光学模块包括依次设置的CCD（301）、柱状物镜（302）、减光片（303）、反光镜（304），激发光与芯片通道对中成像光学模块的光轴与荧光收集光学模块的光轴呈90度角，其中反光镜（304）与荧光收集光学模块的光轴呈45度角放置；

所述的信号处理与数据采集模块（VIII）：

光电倍增管（207）、光敏二极管（104）分别连接前置放大器1（25）、前置放大器2（26）的输入端，前置放大器1（25）、前置放大器2（26）的输出端顺序连接对数放大电路（24）、数据采集板（23）、PC机（1）；

所述的程序软件（IX）由单片机控制程序和PC机应用程序组成，包括：

预置微流控单细胞活性氧分析中的操作步骤，每步操作所对应细胞荧光标记的温

度、各路直流高压/微注射泵的输出模式、运行时间实验参数；

控制微流控单细胞分析中细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分                    

离和单细胞内活性氧检测操作所对应细胞荧光标记温度、各路直流高压、各路微注

射泵不同输出模式间的独立或/和同步输出的可编程输出流程，包括单细胞捕获“识别与触发”的自动切换；

实时显示/记录荧光标记温度、各路直流高压/微注射泵的运行状态、直流高压的输出电压/电流、数据采集板的输出信号。

2.根据权利要求1所述的一种微流控单细胞活性氧自动分析仪，其特征在于：所述的微型热敏电阻（5）具有加热和测温双重作用。

3．根据权利要求1所述的一种微流控单细胞活性氧自动分析仪，其特征在于：所述的激光器（101）为473 nm 、532 nm、635 nm、730 nm半导体泵浦固体激光器的任意一种，且激光器（101）与激发滤光片（103）、分色分光镜（202）、带通滤光片（203）为对应匹配关系。

4．根据权利要求1所述的一种微流控单细胞活性氧自动分析仪，其特征在于：所述的孔径光阑（205）的大小在200～1000 μm范围内可调。

5．根据权利要求1所述的一种微流控单细胞活性氧自动分析仪，其特征在于：所述的发射滤光片组（206）由500～850 nm范围内的六个不同波段的发射滤光片组成，且六个发射滤光片可以旋转式切换。

6．根据权利要求1所述的一种微流控单细胞活性氧自动分析仪，其特征在于：所述的单片机（3）采用ATmega16L。

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