CN112834473A - 一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法及其应用 - Google Patents

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CN112834473A CN202110020297.8A CN202110020297A CN112834473A CN 112834473 A CN112834473 A CN 112834473A CN 202110020297 A CN202110020297 A CN 202110020297A CN 112834473 A CN112834473 A CN 112834473A
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Center For Reproductive Medicine Tongji Medical University Hust
Jiangsu Rayme Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明属于精子检测技术领域，尤其涉及一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法及其应用。本发明创造性地使用可移动的微型激发光探头，将其定位到单个精子附近，并构建了完整的检测流程，包括：处理、定位、降噪、测量、基线处理等步骤。最终实现了对单个精子的散发荧光强度进行精确定量，并且可以准确地给出精子胞内活性氧数值；本发明是领域内首创的单个精子水平的活性氧检测，填补了领域空白，而且本发明对精子数目没有限制，能适用于包括重度少精子症在内的几乎所有患者。

Description

一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法及其应用
技术领域
本发明属于精子检测技术领域，尤其涉及一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法及其应用。
背景技术
活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是指存在于所有生活在含氧环境中的生物体的不稳定的、化学性质活泼的、氧化能力很强的氧衍生物。这些氧衍生物是正常代谢过程中的副产物，它们包括超氧阴离子(O2·-)、过氧化氢(H2O2)、氢氧基(·OH)、氢过氧自由基(HO2)、过氧化脂质(ROOH)等。研究发现，生物体产生的过量ROS和抗氧化防御系统之间的失衡会导致氧化应激，氧化应激在很多病理过程中都起着重要作用，包括男性不育。
由男方原因造成的不育称为男性不育，约占男女不育因素的50％。并且，大约30％-50％的男性不育确切病因不明，被称为特发性男性不育，最近文献表明，30％-80％的不育男性精液中的活性氧水平升高，高水平的活性氧引起的氧化应激会导致精子膜脂质过氧化损伤、精子DNA损伤、精子线粒体损伤及细胞凋亡，从而破坏精子活性和功能，包括对精子的发生、前向运动、获能、顶体反应、受精等多环节产生不同程度的影响，进而损害男性生育能力。因此，活性氧对于男性不育和人类生殖有重要影响。有学者提出，在特发性男性不育症患者中若发现精液或精子中活性氧指标升高，可以诊断为男性氧化应激性不育。因此检测男性精液和精子中活性氧水平是诊断男性不育和评估男性不育治疗疗效的重要指标之一。
目前，化学发光法和荧光探针法由于具有操作简便、反应灵敏、费用较低等优点，成为临床上定量检测精子活性氧的主要手段。其中化学发光法多以鲁米诺为发光剂，通过化学发光计检测被精子活性氧氧化的鲁米诺的发光强度来确定活性氧含量。然而，不带电荷的鲁米诺分子是一种膜透过性分子，可以与精子内和精浆中各种活性氧反应，因此鲁米诺的化学发光分析提供的是精液活性氧总体水平，而无法特异性显示精子活性氧水平。实际工作中，精子中活性氧水平较精液中活性氧水平更具临床意义，更能反映精子质量优劣和男性生育能力。考虑到化学发光法无法直接对精子进行检测的缺点，科研人员使用荧光探针法来检测。临床测定精子活性氧所用的荧光探针法以2'-7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)为探针，以流式细胞仪为检测仪器。DCFH-DA是DCF的一种细胞可渗透的非荧光前体，它对细胞氧化还原状态的变化极为敏感。细胞内酯酶在两个酯键处裂解DCFH-DA，产生相对极性且细胞膜不可渗透的产物H2DCF。该非荧光分子在细胞内积累，随后被精子内ROS氧化产生强荧光产物DCF，再通过流式细胞仪检测荧光的增加来监测精子的ROS水平。但是，流式细胞仪具有以下两方面不足：一是流式细胞仪将受检样品分为单个小液滴通过检测区域，每个液滴里含有一个细胞，因此检测的是整个液滴的荧光强度，而不是精子自身的；二是流式细胞仪的激发光聚焦在特定的平面，待检的单个液滴会因为偏离聚焦平面导致收集的散发荧光不能准确反映其荧光物质含量，进而导致无法准确测量ROS含量。因此，流式细胞仪只能给出精子胞内荧光信号是否超过设定荧光值的判断(Yes or No)，无法准确计算荧光值的高低，因而最终报告的结果是：超过荧光设定值的精子的“比例”，并不是真正的精子胞内活性氧的“含量”。综上所述，现有方法均无法直接定量检测精子胞内的活性氧水平，该研究是生殖临床检测领域内的一大空白。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法，包括以下步骤：
样品处理：将精液置于37℃孵育后，离心保留沉淀；沉淀中加入清理液混匀，重复多次离心去上清的操作；向最后一次的沉淀中加入稀释后的染色液，混匀；37℃恒温避光孵育；离心，沉淀用PBS混匀；离心，沉淀用PBS混匀，得到精子悬液；
精子定位：将精子悬液置于培养皿中，于单细胞分析仪下进行检测，调节显微镜使精头清晰显示在视野中央，调节微操系统和细胞定位系统，使探头定位到精子头部，呈现紧贴精子头部同时又不会使精子出现形变或者位移的状态；
活性氧水平测量：根据单细胞分析仪的操作说明进行荧光检测，得到荧光值A；
基线处理：得到计数值A后，打开显微镜侧舱门，打开显微镜侧卤素灯，调节微操系统和细胞定位系统，将光探头移动到精子头部周围30μm处，同时保证探头激光不会照射到该精子和周围精子；关闭显微镜侧照明灯和卤素灯，缓慢关闭显微镜侧舱门以防止探头移位，开始光子计数；30S后计数自动停止，保存计数结果，多次操作取平均值记作B，表示被测精子的背景基线值；A与B的差值特异性代表样品精子胞内活性氧水平。
进一步地，包括以下步骤：
样品处理：将精液置于37℃孵育后，离心保留沉淀；沉淀中加入清理液混匀，重复多次离心去上清的操作；向最后一次的沉淀中加入稀释后的染色液，混匀；37℃恒温避光孵育；离心，沉淀用PBS混匀；离心，沉淀用PBS混匀，得到精子悬液；
精子定位：将精子悬液置于培养皿中，于单细胞分析仪下进行检测；单细胞分析仪的操作包括：打开卤素灯，调节光源强度及显微镜焦距，让精子在4倍物镜下能显示清晰；将直径与精子头部相近的激发光探头装配到分析仪显微操作系统动力端；在显微镜下观察的同时调节微操系统，让探头在4倍物镜下浸入液滴，并清晰地显示在视野中央；将显微镜物镜调整为10倍，调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，使精子和探头清晰显示在视野中央；将显微镜物镜调整为20倍，调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，使精子和探头清晰显示在视野中央；将显微镜物镜调整为40倍，调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，使精子和探头清晰显示在视野中央；将显微镜物镜调整为60倍，调节显微镜微调旋钮让精头清晰显示在视野中央，调节微操系统和细胞定位系统，使探头定位到精子头部，呈现紧贴精子头部同时又不会使精子出现形变或者位移的状态；
活性氧水平测量：打开触屏控制面板上激发光源电源按钮，点击计算机桌面的“SCanalysis”图标，打开软件控制界面，单击“LASER”图标，点击“+”，提示连接端口及设备，选择“Com7-DC4100-4”，点击“ACCEPT”，连接相应的激发光源；由于本专利使用染料激发波长为490nm，散发荧光波长为530nm，所以点击蓝色“圆形控件”，同时把过滤组块调节到B组块；打开软件控制界面，单击“PHOTON COUNTING”，进入计数器工作界面，选择左侧串口号为“com1”，点击“设置”，单次测量时长设置为30S，门控时间设置为1000ms，稳定时间设置为10ms，脉冲对分辨时间设置为20ns；当显示参数设置成功后，即可进行荧光检测；关闭显微镜侧照明灯和卤素灯，缓慢关闭显微镜侧舱门以防止探头移位，点击“PHOTON COUNTING”的“开始”按键以开始光子计数；30S后计数自动停止，保存光子计数结果A；A表示精子头部所在区域散发出的荧光值；
基线处理：得到计数值A后，打开显微镜侧舱门，打开显微镜侧卤素灯，调节微操系统和细胞定位系统，将光探头移动到精子头部周围30μm处，同时保证探头激光不会照射到该精子和周围精子；关闭显微镜侧照明灯和卤素灯，缓慢关闭显微镜侧舱门以防止探头移位，点击“PHOTON COUNTING”的“开始”按键以开始光子计数；30S后计数自动停止，保存计数结果B1；再重复1-3操作2次，总共可得到三个被测精子头部周围30μm处背景荧光值，B1、B2、B3，其平均值B表示被测精子的背景基线值；A与B的差值则能特异性代表该精子胞内活性氧水平。
进一步地，精液与清理液的用量体积比为0.3:2。
进一步地，新鲜精液放进37℃培养箱孵育20分钟；冻存精液在37℃恒温水浴锅中放置 10分钟。
进一步地，精液与PBS的用量体积比为0.3:4。
进一步地，所述染色液为氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯。
本发明还披露了如上述的一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法在非诊断目的的单精子的活性氧定量检测中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明创造性地使用可移动的微型激发光探头，将其定位到单个精子附近，并构建了完整的检测流程，包括：处理、定位、降噪、测量、基线处理等步骤。最终实现了对单个精子的散发荧光强度进行精确定量，并且可以准确地给出精子胞内活性氧数值；本发明是领域内首创的单个精子水平的活性氧检测，填补了领域空白，而且本发明对精子数目没有限制，能适用于包括重度少精子症在内的几乎所有患者。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或(和)质谱(MS)来确定的。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明披露了一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法及其应用，具体如下实施例所示。
实施例1
本发明所提供的单精子的活性氧定量检测方法包括五个步骤：处理、定位、降噪、测量、基线处理。
一、样品处理
本申请面向单精子活性氧的定量检测，针对性地发明了相应的样品处理方法。其基本过程是使用氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯(CM－H2DCFDA)为染色剂，通过孵育、反应、染色、去除游离染色剂等一系列步骤，特异性地对精子胞内的活性氧进行响应。为了适应单精子水平检测的灵敏度需求，本申请对这一处理流程进行了细致的改进，其完整操作方案如下：
(1)将－20℃冰箱里保存的染色液置入冰槽里融化，稀释液(稀释液成分为PH＝7.0磷酸盐缓冲液)放进37℃恒温水槽里预热。然后使用移液枪移出995微升稀释液到新的1.5毫升离心管，加入5微升染色液，充分混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。
(2)新鲜精液需放进37℃培养箱孵育20分钟，等待精液液化，移取0.3毫升精液到2毫升离心管。冻存精液(包括液氮和-80℃条件下冻存精液)需先在37℃恒温水浴锅中放置10分钟使精子复苏，再移取0.3毫升精液到2毫升离心管。
(3)将离心管放进离心机离心7分钟，速度为300g。
(4)移液枪轻轻移出离心管中上清液，保留沉淀。
(5)加入2毫升清理液(清理液成分为PH＝7.4磷酸盐缓冲液)，充分混匀精子细胞颗粒群。
(6)将离心管放进离心机离心7分钟，速度为300g。
(7)移液枪轻轻移出离心管中上清液，保留沉淀。
(8)加入2毫升清理液，充分混匀精子细胞颗粒群。
(9)将离心管放进离心机离心7分钟，速度为300g。
(10)移液枪轻轻移出离心管中上清液，保留沉淀。
(11)向离心管中加入1毫升含有5微升染色液和995微升稀释液的染色工作液，轻柔混匀精子细胞颗粒群。
(12)将离心管放进37℃恒温水浴锅中孵育40分钟，避免光照。
(13)拿出离心管，放进离心机离心5分钟，速度为300g。
(14)移液枪轻轻移出离心管中上清液，保留沉淀。
(15)向离心管中加入4℃冰箱保存的400微升PBS，轻柔混匀精子细胞颗粒群。
(16)重复步骤13-15一次，最后加入400微升保存液，得到精子悬液，常温保存待用。
二、精子定位
本申请面向单精子活性氧的定量检测，针对性地发明了单精子的定位方法，即通过单细胞分析仪(本发明所使用的细胞分析仪为本申请的申请人之一：江苏瑞明生物科技有限公司的自有产品，为扩展该仪器的使用范围开发出本申请中的单精子检测技术；仪器型号：实时原位单细胞生化分析仪:Single Cell Analyzer TM(SCATM)，型号SCA300)的显微操作系统以及细胞定位系统，将可移动微型激发光探头精确定位到单精子的头部。为了适应悬液中精子游动、杂乱的特性，进一步对该定位方法进行改进，具体操作流程如下：
(1)使用移液枪，移取50微升上述最后一步的精子悬液到细胞培养皿中央，使悬液呈液滴状。本方法使用的培养皿为玻底培养皿35mm-20，产品型号：D35-20-1-N；
(2)分析仪接通电源后，打开设备总开关，将培养皿置于分析仪显微镜下，打开卤素灯，调节光源强度及显微镜焦距，让精子在4倍物镜下能显示清晰；
(3)将直径与精子头部相近的激发光探头(5μm)装配到分析仪显微操作系统动力端；
(4)在显微镜下观察的同时调节微操系统，让探头在4倍物镜下浸入液滴，并清晰地显示在视野中央；
(5)将显微镜物镜调整为10倍，一边在显微镜下观察，一边调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，让精子和探头清晰显示在视野中央；
(6)将显微镜物镜调整为20倍，一边在显微镜下观察，一边调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，让精子和探头清晰显示在视野中央；
(7)将显微镜物镜调整为40倍，一边在显微镜下观察，一边调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，让精子和探头清晰显示在视野中央。
(8)将显微镜物镜调整为60倍，一边在显微镜下观察，一边调节显微镜微调旋钮让精头清晰显示在视野中央，随后调节微操系统和细胞定位系统，让探头定位到精子头部，呈现紧贴精子头部同时又不会使精子出现形变或者位移的状态。
三、降噪处理
为适应单精子水平检测需求，增强精子胞内活性氧对激光激发的响应的特异性，本申请针对检测过程中会干扰检测信号的因素创新性地进行了相应的降噪处理，主要影响因素以及相应措施如下：
(1)精浆中的白细胞以及酶等，会对精子活性氧水平产生干扰，因此我们通过多次离心以及加入清理液清理，去除精浆，减少干扰。
(2)通过采用微型激发光探头，局域性激发精子头部荧光染料，进一步提高荧光信号特异性，降低背景信号干扰；又因为激光探头精确定位在精子头部，精子都处于聚焦平面，所以不同精子所受激发光强度一致，荧光检测准确性高。
四、活性氧水平测量
本申请采用荧光染料氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯(CM－H2DCFDA)进行精子胞内活性氧染色，进而使用单细胞分析仪检测并分析荧光信号，以荧光信号值(光子数)表示活性氧水平。本申请基于精子胞内活性氧特性以及所使用染料的性质，创造性地对单细胞分析仪检测参数进行相应设置，从而达到单精子水平检测的灵敏度和特异性需求。激光探头定位到精子头部后，即进行荧光激发和检测，具体操作流程如下：
(1)打开触屏控制面板上激发光源电源按钮，点击计算机桌面的“SC analysis”图标，打开软件控制界面，单击“LASER”图标，点击“+”，提示连接端口及设备，选择“Com7-DC4100-4”，点击“ACCEPT”，连接相应的激发光源。由于本专利使用染料激发波长为490nm，散发荧光波长为530nm，所以点击蓝色“圆形控件”(表示激发波长在490nm)，同时把过滤组块调节到B(blue)组块；
(2)打开软件控制界面，单击“PHOTON COUNTING”，进入计数器工作界面，选择左侧串口号为“com1”，点击“设置”，单次测量时长设置为30S，门控时间设置为1000ms，稳定时间设置为10ms，脉冲对分辨时间设置为20ns。当显示参数设置成功后，即可进行荧光检测；
(3)关闭显微镜侧照明灯和卤素灯，缓慢关闭显微镜侧舱门以防止探头移位，点击“PHOTON COUNTING”的“开始”按键以开始光子计数；
(4)30S后计数自动停止，保存光子计数结果A。A表示精子头部所在区域散发出的荧光值。
五、基线处理
由于本申请所使用的染料不能保证被活性氧氧化后完全不会从精子胞内漏出；此外即使采取包括离心、清理等措施减少悬液中的精浆成分，悬液中仍然存在将未完全洗去的染料氧化的物质。因此，光子计数值A实际上代表被测单精子头部荧光以及头部所在区域背景荧光之和。基于以上原因，本专利对背景荧光的基线值进行细致测定，其操作流程如下：
(1)得到计数值A后，打开显微镜侧舱门，打开显微镜侧卤素灯，一边在显微镜下观察一边调节微操系统和细胞定位系统，将光探头移动到精子头部周围30μm处，同时保证探头激光不会照射到该精子和周围精子；
(2)关闭显微镜侧照明灯和卤素灯，缓慢关闭显微镜侧舱门以防止探头移位，点击“PHOTON COUNTING”的“开始”按键以开始光子计数；
(3)30S后计数自动停止，保存计数结果B1；
(4)再重复1-3操作2次，总共可得到三个被测精子头部周围30μm处背景荧光值，B1、B2、B3，其平均值B表示被测精子的背景基线值；
(5)A与B的差值则能特异性代表该精子胞内活性氧水平。
通过处理、定位、降噪、测量、基线处理五个步骤，本专利所述的创新方法准确测定了单精子胞内活性氧水平。
实施例2单精子活性氧定量检测方法的应用
本实施例中用实施例1中单精子活性氧的定量检测方法检测不同精子质量的人精液标本，包括如下基本步骤：
(1)收集43份人精液标本，常规精液分析显示其中30份为正常精子，13份为异常精子。正常精子即标本同时符合《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》中规定的精液量≥1.5ml，精子浓度≥15×106/mL，精子前向运动≥32％，精子活动力≥40％的参数标准。有任一参数低于以上标准即算作异常精子。
(2)对于收集到的每一份标本，取0.5ml精液经上述操作流程，检测20个精子的活性氧染色的荧光物质含量，代表该份标本使用本专利所述方法检测所得的活性氧水平。
(3)对于收集到的每一份标本，同时取0.5ml精液经过活性氧染色后使用流式细胞仪进行荧光检测，所得结果用于与本申请的检测方法的检测结果进行对比。
(4)对于检测到的精子活性氧水平数据，使用Statistical Package for theSocial Sciences (version 15；SPSS UK Ltd.,Chertsey,Surrey,United Kingdom)软件进行数据分析。分析结果如下表：
Figure BDA0002888270540000081
注：使用独立样本T检验方法对精液量进行分析；其余参数均使用曼-惠特尼检验进行分析。
综合比较本专利所述方法和其他精子活性氧检测方法，可以发现本专利所述方法具有以下优势：
1.背景低，准确性高：如操作步骤中描述，本方法使用的激光探头发出的激发光局限在精子头部区域，这种局域化的激发方式可以做到几乎不激发精子头部以外的区域，背景低。又因为激光探头精确定位在精子头部，精子都处于聚焦平面，所以不同精子所受激发光强度一致，荧光检测准确性高。
2.分辨能力强：如上表所示，目前临床上使用较多的流式细胞仪检测精子活性氧时，无法分辨不同质量的单个精子(p>0.05)，而本方法可以分辨不同质量的单个精子(p<0.05)，说明本方法可以作为一种精子质量评价的手段。又因为活性氧是造成男性不育的重要因素，因此本方法也可以作为男性不育的一项诊断工具。
3.所需精子数少：无论是化学发光法还是流式细胞术，所需精子数都有下限要求，而本方法可以做到单个精子的活性氧检测，对于临床上原本完全无法进行精子活性氧水平检测的重度少精子症患者，可以用本方法进行检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法，包括以下步骤：
样品处理：将精液置于37℃孵育后，离心保留沉淀；沉淀中加入清理液混匀，重复多次离心去上清的操作；向最后一次的沉淀中加入稀释后的染色液，混匀；37℃恒温避光孵育；离心，沉淀用PBS混匀；离心，沉淀用PBS混匀，得到精子悬液；
精子定位：将精子悬液置于培养皿中，于单细胞分析仪下进行检测，调节显微镜使精头清晰显示在视野中央，调节微操系统和细胞定位系统，使探头定位到精子头部，呈现紧贴精子头部同时又不会使精子出现形变或者位移的状态；
活性氧水平测量：根据单细胞分析仪的操作说明进行荧光检测，得到荧光值A；
基线处理：得到计数值A后，打开显微镜侧舱门，打开显微镜侧卤素灯，调节微操系统和细胞定位系统，将光探头移动到精子头部周围30μm处，同时保证探头激光不会照射到该精子和周围精子；关闭显微镜侧照明灯和卤素灯，缓慢关闭显微镜侧舱门以防止探头移位，开始光子计数；30S后计数自动停止，保存计数结果，多次操作取平均值记作B，表示被测精子的背景基线值；A与B的差值特异性代表样品精子胞内活性氧水平。
2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
样品处理：将精液置于37℃孵育后，离心保留沉淀；沉淀中加入清理液混匀，重复多次离心去上清的操作；向最后一次的沉淀中加入稀释后的染色液，混匀；37℃恒温避光孵育；离心，沉淀用PBS混匀；离心，沉淀用PBS混匀，得到精子悬液；
精子定位：将精子悬液置于培养皿中，于单细胞分析仪下进行检测；单细胞分析仪的操作包括：打开卤素灯，调节光源强度及显微镜焦距，让精子在4倍物镜下能显示清晰；将直径与精子头部相近的激发光探头装配到分析仪显微操作系统动力端；在显微镜下观察的同时调节微操系统，让探头在4倍物镜下浸入液滴，并清晰地显示在视野中央；将显微镜物镜调整为10倍，调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，使精子和探头清晰显示在视野中央；将显微镜物镜调整为20倍，调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，使精子和探头清晰显示在视野中央；将显微镜物镜调整为40倍，调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，使精子和探头清晰显示在视野中央；将显微镜物镜调整为60倍，调节显微镜微调旋钮让精头清晰显示在视野中央，调节微操系统和细胞定位系统，使探头定位到精子头部，呈现紧贴精子头部同时又不会使精子出现形变或者位移的状态；
活性氧水平测量：打开触屏控制面板上激发光源电源按钮，点击计算机桌面的“SCanalysis”图标，打开软件控制界面，单击“LASER”图标，点击“+”，提示连接端口及设备，选择“Com7-DC4100-4”，点击“ACCEPT”，连接相应的激发光源；由于本专利使用染料激发波长为490nm，散发荧光波长为530nm，所以点击蓝色“圆形控件”，同时把过滤组块调节到B组块；打开软件控制界面，单击“PHOTON COUNTING”，进入计数器工作界面，选择左侧串口号为“com1”，点击“设置”，单次测量时长设置为30S，门控时间设置为1000ms，稳定时间设置为10ms，脉冲对分辨时间设置为20ns；当显示参数设置成功后，即可进行荧光检测；关闭显微镜侧照明灯和卤素灯，缓慢关闭显微镜侧舱门以防止探头移位，点击“PHOTON COUNTING”的“开始”按键以开始光子计数；30S后计数自动停止，保存光子计数结果A；A表示精子头部所在区域散发出的荧光值；
基线处理：得到计数值A后，打开显微镜侧舱门，打开显微镜侧卤素灯，调节微操系统和细胞定位系统，将光探头移动到精子头部周围30μm处，同时保证探头激光不会照射到该精子和周围精子；关闭显微镜侧照明灯和卤素灯，缓慢关闭显微镜侧舱门以防止探头移位，点击“PHOTON COUNTING”的“开始”按键以开始光子计数；30S后计数自动停止，保存计数结果B1；再重复1-3操作2次，总共可得到三个被测精子头部周围30μm处背景荧光值，B1、B2、B3，其平均值B表示被测精子的背景基线值；A与B的差值则能特异性代表该精子胞内活性氧水平。
3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法，其特征在于：精液与清理液的用量体积比为0.3:2。
4.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法，其特征在于：新鲜精液放进37℃培养箱孵育20分钟；冻存精液在37℃恒温水浴锅中放置10分钟。
5.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法，其特征在于：精液与PBS的用量体积比为0.3:4。
6.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法，其特征在于：所述染色液为氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯。
7.如权利要求1-7任一所述的一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法在非诊断目的的单精子的活性氧定量检测中的应用。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5874726A (en) * 1995-10-10 1999-02-23 Iowa State University Research Foundation Probe-type near-field confocal having feedback for adjusting probe distance
WO2008044138A1 (en) * 2006-10-12 2008-04-17 Syddansk Universitet Optical nanosensor for detection of reactive oxygen species
CN102183504A (zh) * 2011-01-25 2011-09-14 山东师范大学 一种微流控单细胞活性氧自动分析仪
US20130137085A1 (en) * 2011-11-30 2013-05-30 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Method for Real-Time Measurement of the Individual Secretions of a Cell
CN104911274A (zh) * 2015-07-06 2015-09-16 四川医科大学 一种单细胞实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN105607686A (zh) * 2016-01-11 2016-05-25 浙江大学 基于纳米级微操的单细胞亚纳米级运动控制系统
CN106092991A (zh) * 2016-06-29 2016-11-09 南京大学 一种利用dapi荧光染料对活细胞内活性氧含量的检测方法
CN108398407A (zh) * 2018-01-25 2018-08-14 迈克博（天津）生物科技有限公司 一种人类精子活率及其dna损伤双参数检测及分析的试剂盒
CN109164080A (zh) * 2018-09-29 2019-01-08 江苏瑞明生物科技有限公司 适用于细胞水平无损荧光检测光谱仪

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5874726A (en) * 1995-10-10 1999-02-23 Iowa State University Research Foundation Probe-type near-field confocal having feedback for adjusting probe distance
WO2008044138A1 (en) * 2006-10-12 2008-04-17 Syddansk Universitet Optical nanosensor for detection of reactive oxygen species
CN102183504A (zh) * 2011-01-25 2011-09-14 山东师范大学 一种微流控单细胞活性氧自动分析仪
US20130137085A1 (en) * 2011-11-30 2013-05-30 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Method for Real-Time Measurement of the Individual Secretions of a Cell
CN104911274A (zh) * 2015-07-06 2015-09-16 四川医科大学 一种单细胞实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN105607686A (zh) * 2016-01-11 2016-05-25 浙江大学 基于纳米级微操的单细胞亚纳米级运动控制系统
CN106092991A (zh) * 2016-06-29 2016-11-09 南京大学 一种利用dapi荧光染料对活细胞内活性氧含量的检测方法
CN108398407A (zh) * 2018-01-25 2018-08-14 迈克博（天津）生物科技有限公司 一种人类精子活率及其dna损伤双参数检测及分析的试剂盒
CN109164080A (zh) * 2018-09-29 2019-01-08 江苏瑞明生物科技有限公司 适用于细胞水平无损荧光检测光谱仪

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HERVE BARRIERE ET AL.: "Analysis of Endocytic Trafficking by Single-Cell Fluorescence Ratio Imaging", 《CURRENT PROTOCOLS IN CELL BIOLOGY》 *
J.M. MORRELL ET AL.: "Reactive oxygen species in stallion semen can be affected by season and colloid centrifugation", 《ANIMAL REPRODUCTION SCIENCE》 *
MAKOTO KAZAMA ET AL.: "Sea urchin spermatozoa generate at least two reactive oxygen species; the type of reactive oxygen species changes under different conditions", 《MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT》 *
赵成瑞 等: "双波长比例法测定单细胞活性氧探析", 《山西医科大学学报》 *

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